酶学分析ALT分析Km值

第四章酶学分析 酶 Enzyme 是生物体内具有催化功能的蛋白质 又叫生物催化剂 生物体内的化学反应几乎都是在酶的催化下进行的 因此酶学的研究 对于了解生命活动的规律 阐明生命现象的本质以及指导有关的医学实践和工农业生产都有重要意义 第一节酶的分离纯化 酶的化学本质是蛋白质 故适用于蛋白质的分离纯化方法一般也适用于酶的分离纯化 一 酶的分离 1 材料的选取在酶的分离过程中 首先应该考虑的一个问题是如何选择材料 同一种酶在不同组织细胞中的含量可能相差千倍或上万倍 因此 如果不是对某种酶在各组织中的含量进行比较分析或是某些特殊需要 一般选择含量丰富的材料进行提纯 2 细胞的破碎常用的细胞破碎方法有 1 绞碎 匀浆 高速组织捣碎机捣碎等 2 对于细胞壁较厚的微生物材料 通常采用加石英砂研磨 超声波破碎 反复冻融等方法 3 对于细胞膜上的酶还可以采用有机溶剂处理 去垢剂处理等 从组织中抽提所需要的酶往往用缓冲液抽提 这样可以避免由于pH的突然变化而导致酶的失活 低温 O 4 操作更宜 二 酶的纯化 随着科学技术水平的不断提高 酶的分离纯化手段也不断增加 尽管方法多样 但大致可归纳为以下几类 1 沉淀法2 层析法3 电泳法4 结晶 1 沉淀法 常用的有盐析法 聚乙二醇沉淀法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 热变性沉淀法等 1 盐析法 盐析用的盐通常有硫酸铵和氯化钠等 由于硫酸铵溶解度大 对大部分酶无毒副作用 且在浓度较高时对一些酶还有稳定作用 易透析除去 故盐析绝大多数都用硫酸铵 2 聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇是最常用的分离核酸和蛋白质的沉淀剂 在部分纯化的酶溶液中 缓慢加入聚乙二醇 使溶液达到混浊 可以使某些酶以结晶的形式沉淀下来 使酶的提纯效果提高3 5倍 且很少引起酶的失活 5 热变性沉淀法 对于热稳定酶 如酵母醇脱氢酶 可利用温度控制 将杂蛋白变性沉淀除去 该法提纯效果很好 但在操作时要防止局部过热 一般用比变性温度高l0 的水浴迅速升温 在变性温度下保持一定时间后 用冰迅速冷却 3 等电点 pI 沉淀法 酶蛋白在等电点处溶解度最小 易于沉淀 因此可以通过调节介质的pH值对酶进行提纯 但由于蛋白质在pI附近一定范围的pH值溶液中都可发生沉淀 而且相当多蛋白质的pI很接近 所以该法的提纯效果及回收率均不理想 一般只用在酶的粗分离阶段 4 有机溶剂沉淀法 常用的有机溶剂有乙醇 丙酮和甲醇等 该法是一种比较有效的分离提纯方法 为了避免酶蛋白变性 须在低温 5 10 下进行分离提纯 2 层析法 酶纯化中常用的层析法有 吸附层析 离子交换层析 凝胶层析及亲和层析等 详见本书第三章 电泳法是利用酶蛋白所带电荷和分子量大小与其他杂蛋白的不同而达到分离的目的 酶纯化中常用的电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦等 详见本书第二章 3 电泳法 4 结晶 结晶主要是利用酶蛋白在硫酸铵等溶液中的溶解度随着温度升高而降低的特性将酶进行提纯 达到一定纯度的酶才可以结晶 同时结晶本身也是一种提纯的方法 用于结晶的酶制剂只要纯度达到50X以上就可以了 第二节酶的活力测定 一 酶活力与酶反应速度 1 酶活力酶活力 EnzymeActivity 是指酶催化化学反应的能力 也即酶催化某一化学反应的反应速度 检查酶的含量及存在 不能直接用重量或体积来表示 通常用它催化某一特定反应的速度来表示 即用酶的活力来表示 由于酶活力受温度 pH等环境因素的影响很大 在进行酶活力测定时 必须使这些因素保持恒定 2 酶反应速度酶活力测定常采用测反应初速度的方法 底物浓度的变化在起始浓度的5 以内的速度为初速度 底物浓度太低时 5 以下的底物浓度变化不易测准 所以在测酶活力时 往往使底物浓度足够大 这样酶促反应对于底物来说是零级反应 而对于酶来说却是一级反应 由此测得的速度就能较可靠地反映酶的活力 测定酶活力有两种方法 一是测定完成一定量反应所需的时间 即在一定条件下将全部底物转化为产物所需的时间 所需的时间愈短 酶活力愈高 反之则活力愈低 由于反应时间很难精确控制 这种方法很少应用 另一种方法是测定在最适宜条件下 单位时间内底物的减少量或产物的增加量 由于在实验中底物往往是过量的 反应中底物的转化仅占总底物的极小一部分 不易测准 而产物则从无到有 只要方法足够灵敏就可以准确测定 故常采用后一种方法 酶促反应速度的单位是浓度 单位时间 二 测定方法 测定产物增加量或底物减少量的方法很多 常用的方法有化学滴定 比色 比旋光度 气体测压 紫外吸收测定 电化学法 荧光测定及同位素技术等 具体选择哪一种方法 要根据底物或产物的物理化学性质而定 1 化学法这是一种取样法 终止酶反应通常采用加入酶的变性剂的方法 如果反应底物或产物热稳定性好 也可用加热使酶失活的方法终止酶反应 但时问较难控制 该法工作量大 本身包含一定的误差 对速度快的反应常不易得到十分准确的结果 2 比色法比色法是根据底物和产物在某 波长上有明显的特征吸收差别建立起来的连续观测方法 3 荧光法利用酶反应的底物 产物或辅助物具有荧光 通过测荧光强度变化来测酶活力 例如 某些脱氢酶的辅酶NADH 或NADPH 的中性溶液能发出强烈的蓝白色荧光 460nm 而NAD 或NADP 则没有 用荧光法测酶活力时 通常以单位时间内荧光强度的变化来表示 荧光法的优点是灵敏度极高 比分光光度法还要高2 3个数量级 故特别适用于酶量或底物量极低的快速酶分析 其缺点是 荧光读数与浓度之间没有直接的比例关系 而且常因测定条件 如温度 散射 仪器等 的不同而不同 4 电化学法包括离子选择性电极测定法 氧电极测定法及电流测定法等 5 同位素法用同位素标记底物 随着酶催化反应的进行 一部分标记的底物将转化为产物 反应终止后 分离底物和产物 测底物的放射性减少量或产物的放射性增加量 常用于底物标记的同位素有3H 14C 32P 35S和131I 同位素法的特点是灵敏度极高 但操作烦琐 费时 有放射性 操作者须特别小心 三 酶的活力单位 U 及比活力 酶活力的大小也即酶量的大小 用酶的活力单位来度量 1 酶的活力单位1976年国际酶学生化学会委员会规定 1个酶活力单位 是指在特定条件下 1分钟内能将l微摩尔 mol 底物转化为产物所需的酶量 或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量 在临床上酶活力单位常用习惯表示法 如对血清谷丙转氨酶 ALT 活力单位按King氏法定义为 每100ml血清在37 pH 7 4条件下与底物作用60min 生成1 mo1丙酮酸为1个活力单位 2 酶的比活力比活力的大小 就是酶含量的大小 即酶蛋白所具有的酶活力 一般用活力单位 毫克蛋白 U mg蛋白 来表示 有时也用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示 单位 克或单位 毫升 3 酶的转换数指每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数 mol s 它相当于一旦底物一酶 ES 中间复合物形成后 酶将底物转换为产物的效率 第三节酶促反应动力学 酶促反应动力学研究的是酶促反应速度及其影响因素 这些因素包括底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂等 酶促反应动力学的研究具有重要的理论和实践意义 一 底物浓度对反应速度的影响 在其他因素不变的情况下 底物浓度对反应速度影响的关系曲线呈矩形双曲线 在底物浓度较低时 反应速度随底物浓度的增加而急剧上升 两者成正比关系 随着底物浓度的进一步增高 应速度的增幅度不断下降 如果继续加大底物浓度 反应速度将不再增加 此时酶的活性中心已被底物饱和 1 米 曼氏方程式 1913年 L Michaelis和M L Menten提出了反应速度与底物浓度关系的数学方程式 即著名的米一曼氏方程式 简称米氏方程式 即 式中 max为最大反应速度 S 为底物浓度 Km为米氏常数 是在不同 S 时的反应速度 2 Km值和 max值的测定 由于底物浓度对反应速度影响的关系曲线是矩形双曲线 因此很难准确地测得Km值和 max值 若将米氏方程式进行变换 将曲线作图改为直线作图 便可容易地用图解法准确求得Km值和 max值 最常用的是双倒数作图法 又称为林 贝氏 Lineweaver Burk 作图法 它将米氏方程式等号两边取倒数 再以1 对1 S 作图 可得一直线 它在纵轴上的截距为1 max 在横轴上的截距为 1 Km 二 酶浓度对反应速度的影响 在酶促反应系统中 当底物浓度大大超过酶的浓度 使酶被底物饱和时 反应速度与酶的浓度成正比例关系 三 温度对反应速度的影响 酶是生物催化剂 温度对酶促反应速度具有双重影响 温度升高时 一方面可加快酶促反应速度 同时也增加酶的变性 综合这两种因素 酶促反应速度最快时的环境温度称为酶促反应的最适温度 温血动物中酶的最适温度多在35 40 之间 温度高于最适温度时 反应速度则因酶变性而降低 酶的最适温度不是酶的特征性常数 它与反应进行的时间有关 酶可以在短时间内耐受较高的温度 相反 延长反应时间 最适温度便降低 四 pH对反应速度的影响 酶分子中的许多极性基团在不同的pH条件下解离状态不同 所带电荷的种类和数量也各不相同 酶活性中心的某些必需基团往往仅在某一解离状态时才具有最大的催化作用 此时的环境pH称为酶促反应的最适pH 动物体内多数酶的最适pH接近中性 最适pH也不是酶的特性常数 它受底物浓度 缓冲液的种类与浓度 以及酶的纯度等因素的影响 溶液pH高于或低于最适pH时 酶的活性降低 远离最适pH时甚至会导致酶的变性失活 因此在测定酶的活性时 应选用pH适宜的缓冲液以保持酶活性的相对恒定 五 激活剂对反应速度的影响 使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂 activator 可分为必需激活剂和非必需激活剂 必需激活剂大多为金属离子 如Mg2 K Mn2 等 它们对酶促反应是不可缺少的 否则将测不到酶的活性 非必需激活剂是指激活剂不存在时 酶仍有一定的催化活性 但它的存在能提高酶的催化活性 六 抑制剂对反应速度的影响 凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂 根据抑制剂与酶结合的紧密程度不同 对酶的抑制作用分为可逆性抑制与不可逆性抑制两类 1 不可逆性抑制作用 不可逆性抑制作用的抑制剂通常以共价键与酶活性中心或活性中心以外的必需基团相结合 使酶失活 此种抑制剂不能用透析 超滤等方法予以去除 2 可逆性抑制作用 可逆性抑制作用的抑制剂通常以非共价键与酶或酶 底物复合物可逆性结合 使酶活性降低或消失 采用透析或超滤的方法可将抑制剂除去 使酶恢复活性 可逆性抑制作用的类型大体可分为以下三种 1 竞争性抑制作用 抑制剂与酶的底物结构相似 可与底物竞争酶的活性中心 从而阻碍酶与底物结合形成中间产物 这类抑制作用使酶的Km增大 但不改变酶的 max 2 非竞争性抑制作用 抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合 不影响酶与底物的结合 酶和底物的结合也不影响酶与抑制剂的结合 这类抑制作用使酶的 max降低 但不影响酶的Km 3 反竞争性抑制作用 抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合 使中问产物的量下降 这类抑制作用同时降低反应的 max和Km值 第四节酶法分析 酶法分析是指应用酶作为工具的分析方法 可以对酶的底物 辅酶 激活剂或抑制剂进行定量分析 常用的方法有动力学分析法 终点测定法和酶标免疫测定法 其中终点测定法的应用最为普遍 所谓终点测定法就是借助某种酶的作用 使被测物质定量地进行转变 在转化完成后 测定底物 产物或辅酶等物质的变化量 它可分为单酶反应定量法和偶联酶反应定量法 一 单酶反应定量法 1 底物含量的测定单酶反应只应用一种酶进行催化 如下式所示 SP E 用这种反应作底物定量时 可以测定底物的减少量 也可以测定产物的增加量 对含有辅酶的酶 测定辅酶的变化量也是有效的方法 1 测定底物的减少量 在以待测物质为底物的酶反应中 如果底物能接近完全地转比为产物 当有99 转化成产物时 则认为反应完全 而且底物又具有某种特征性质 如具有特殊的吸收光谱 时 就有可能通过直接测定底物的减少量而定量测定待测物 例如尿酸的定量测定 尿酸在293nm 297nm波长处具有特征吸收峰 其摩尔吸光系数分别为12 6 106和11 7 106 利用这一性质 通过尿酸酶作用 测定它的吸光度的减少量就可计算出尿酸含量 尿酸 2H2O O2尿囊素 CO2 H2O2 尿酸酶 2 测定产物增加量 在以被测物作为底物的酶促反应中 如果底物基本上都能转变成为产物 而产物又是具有可专一性进行定量测定的物质 那么 根据产物的增加量就能检测底物的量 例如己糖的定量测定 用ATP 32P 的微量测定法 通过己糖激酶作用 32P从ATP 32P 掺人到产物己糖 6 磷酸 32P 中 因此测定产物的 P就可进行已糖的定量 D 已糖 ATP 32P D 已糖 磷酸 32P ADP 已糖激酶 3 由辅酶变化量进行底物定量 NADH和NADPH在340nm波长处有特征性最大吸收峰 其摩尔吸光系数 6 22 106 当氧化为NAD 或NADP 时在340nm波长处没有吸收 所以在以NAD 或NADP 为辅酶的脱氢酶反应中 可以通过测定340nm波长处吸光度的变化 对相应脱氢酶的底物作定量分析 此法应用范围很广 见表4 1 例如 L 谷氨酸的定量测定 NADH生成量的测定 L 谷氨酸 NAD H2O 酮戊二酸 NADH NH4 谷氨酸脱氢酶 在这个反应中 通过测定NAKH的生成量可以对L一谷氨酸进行定量 由于此反应的平衡偏向左方 为使其右移 必须向反应系统添加肼 使酮酸与之反应 并加过量的NAKH 在碱性 pH 9 0 条件下 当L一谷氨酸浓度在60 mol L以下时 反应即可定量地向右方进行 2 辅酶的定量 辅酶的种类很多 由于它们在酶系统中非常重要 因而经常要对它们作定量分析 单酶反应可测定的辅酶有多种 例如 CoA可用磷酸转乙酰基酶 PTA 进行测定 CoA 乙酰磷酸乙酰CoA H3PO4 PTA 乙酰CoA在233nm波长处有吸收峰 通过测定反应生成乙酰CoA的值 即可计算出乙酰CoA的A233生成量 进而计算出CoA的含量 除了酶的底物及辅酶的酶法分析以外 还可以根据对酶系统的激活作用测定元机物质 如Ca2 Mg2 Zn2 Cu2 Mn2 K 等 也可以根据对酶反应的抑制作用测定有机物质 如用酶法测定农药痕量有机磷 有机氯 氨甲酸酯等 二 偶联酶反应定量法 当单酶反应产物和原始底物用物理化学手段无法区分时 往往可借助另一种酶作为指示酶 通过偶联反应进行定量分析 如 ABC E1 E2 当测定A B很困难时 可用E2作指示酶 通过测定C的含量来测定A 这种偶联酶反应可分为两类 1 以脱氢酶作指示酶 用作偶联的指示酶中 应用最广的是以NAD 或NADP 为辅酶的脱氢酶类 根据这种方法进行定量的例子很多 例如 葡萄糖6 磷酸 葡萄糖 已糖激酶 ATP 果糖6 磷酸 果糖6 磷酸 葡萄糖 已糖激酶 磷酸葡萄糖异构酶 上述两个反应都可以生成产物6 磷酸 葡萄糖 再将该产物作为底物 用6 磷酸葡萄糖脱氢酶作为指示酶进行反应 测定偶联反应中NADPH在340nm波长处的吸光度 算出NADPH的增加量 从而分别对葡萄糖或果糖进行定量分析 6 磷酸 葡萄糖 NADP 6 磷酸葡萄糖酸 NADPH H 6 磷酸葡萄糖脱氢酶 2 以脱氢酶以外的酶作指示酶 除了脱氢酶可作为指示酶以外 还有些酶也能作为指示酶 如葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成的H2O2可与过氧化物酶偶联 这里过氧化物酶就是指示酶 葡萄糖 H2O O2葡萄糖酸 H2O2 葡萄糖氧化酶 H2O DH22H2O D 过氧化物酶 DH2为还原型色素 D为氧化型色素 氧化型色素如邻联茴香胺 二氨基联苯胺等在420 470nm波长处有吸收峰 所以用分光光度法测定D的生成量 就可计算出葡萄糖的量 这样就能对葡萄糖进行定量分析 第五节同工酶 同工酶 Isozymes 是指催化同一种化学反应 但其酶蛋白本身的分子组成 结构却有所不同的一组酶 这类酶通常由两个或两个以上的亚基聚合而成 彼此问的理化性质及反应机理不同 可存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中 甚至同一组织 同一细胞中 对细胞的发育及代谢的调节都很重要 现在同工酶的研究已经成为细胞分化及形态遗传的分子学基础中的重要内容 目前已发现的同工酶有几百种 如存在于哺乳动物中的乳酸脱氢酶 LDH 有5种 它们催化如下反应 同工酶之间由于分子结构不同 电泳迁移率亦不同 因此 一般通过电泳对同工酶进行分离 并通过染色后区带的宽度及颜色的深浅测定各同工酶相对活性的高低 CH3CHOHCOOH NAD CH3COCOOH NADH H LDH 乳酸 丙酮酸 第五节酶在医学上的应用 一 诊断 1 酶的诊断通过检测酶活性并与正常值进行比较 对疾病进行辅助诊断 人体血清中含有各种各样的酶 在正常情况下含量稳定 若在病理条件下 某些酶的活性会发生显著变化 如血清丙氨酸氨基转移酶 ALT 活性与肝细胞病变密切相关 而血清肌酸激酶 天冬酰胺氨基转移酶 AsT 及乳酸脱氢酶 LDH 等酶活性变化与心肌细胞病变密切相关 2 诊断用酶检测体内某些与疾病有关的代谢物质的变化 对疾病进行辅助诊断 诊断用酶是将酶作为分析试剂 通过检测体内某些与疾病有关的代谢物质来诊断疾病 如体液 主要是血清和尿液 中葡萄糖 乳酸 胆固醇 甘油三酯 尿素 丙酮酸 肌酐 肌酸等物质的含量都是重要的临床指标 这些物质可用化学法测定 也可用酶法分析测定 由于酶法检测具有快速 简便 准确 无副反应 灵敏等优点 现已逐步取代化学法等 二 治疗 酶直接用于治疗的研究比它用在诊断上要早得多 最早使用的是以淀粉酶为代表的各类口服消化酶 现在已发展了口服 注射 包括皮下注射和静脉注射 和外用三类治疗用酶 若按其治疗功能 酶又可分为消化酶类 纤溶酶类 抗炎及清疮用酶 心血管疾病用酶以及治疗肿瘤和遗传性缺酶症用酶等几大类 血清谷 丙转氨酶 ALT 活性的测定 改良Mohun法 原理 转氨酶在人体内氨基酸的代谢中占有重要地位 转氨酶有多种 即大多数氨酸均有其特异的转氨酶 其中对谷 丙转氨酶 ALT 和谷革转氨酶 AST 的研究最多 ALT和AST广泛分布于人体各组织器官的细胞内 且活性很高 但正常人血清中这两种转氨酶活性却很低 说明在正常情况下只有极少量从组织释放至血浆中 当组织受损伤 造成细胞通透性增加乃至细胞坏死时 ALT括性和AST活性可明显升高 园此ALT和AST活性测定已广泛应用于临床检验 ALT活性测定的方法很多 主要有两类 一是卡门氏 Karman 分光光度法 二是比色测定法 Karman分光光度法的原理如下 由于NADH在波长340nm处有特异的吸收峰 因此ALT的活性可通过NADH的消失量 即根据340nm处光密度值的减少量间接作出定量测定 ALT活性的K洲an氏单位的定义是 在分光光度法规定的条件 karman分光光度计 25 340nm 光径1km 下 1毫升血清每分钟使光密度值降低0 001时为1单位 这一方法特异性高 不受限制和干扰 因而准确性高 但是此法除加入ALT底物外 还需加人LDH和NADH 又需用分光光度计 因此不易为一般临床化验室推广 比色测定法目前国内采用三种方法 即金氏法 King法 穆氏法 Mohun法 和赖氏法 Reitman一Frankel法 其原理完全相同 现简述如下 此外 这三种方法中所用试剂 操作步骤及作用温度等均完全相同 不同之处在于作用时间 King法60min Mohun法和Reitman Frankel法30min 因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同 King法单位定义是 每100ml血清在37 条件下与底物作用60min 生成1微克分子丙酮酸为1单位 Mohun法单位定义是 每毫升血清在pH 7 4 37 条件下与底物作用30min 每生成2 5微克丙酮酸为1单位 Reitman Frankel法的单位是根据比色法所得光密度值与分光光度法作对比测定求得 因此其单位值与Karman单位相同 本实验采用Mohun法 试剂 1 500 g ml 精确称取丙酮酸钠 A R 62 5mg溶于少量磷酸盐缓冲液 0 1mol L pH 7 4 中 转移至100ml容量瓶内 再以此缓冲液稀释至满刻度 混匀后贮存于冰箱 2 200 g ml 取 1 液40 0ml置100m1容量瓶中 以磷酸盐缓冲液 o 1mol L pH 7 4 稀释至刻度线 混匀后贮存于冰箱 1 标准丙酮酸液 上述 1 2 液均不宜久存 应临用前配制 1 0 1mol L磷酸二氢钾溶液 称取KH2PO4 A R 13 614g 用重蒸馏水溶解后转人1000ml容量瓶中 再用重蒸馏水定容至刻度 摇匀 2 O 1mol L磷酸氢二钠溶液 称取无水Na2HPO4 A R 14 196g 用重蒸馏水溶解后转入1000ml容量瓶中 再用重蒸馏水定容至刻度 摇匀 2 磷酸盐缓冲液 0 1mol L pH 7 4 取 1 液2份与 2 液8份混合 即得0 1mol L pH 7 4的磷酸盐缓冲液 3 ALT底物液 精确称取 酮戊二酸29 2mg DL 丙氨酸1 78g 用O 1moI LpH 7 4磷酸盐缓冲液50ml溶解后 再以磷酸盐缓冲液加至约80ml 再用1mol LNaOH调至pH 7 4 然后加氯仿1ml防腐 最后以磷酸盐缓冲液定容至100ml 冰箱保存可用一周 若出现混浊则应弃之不用 4 2 4一二硝基苯肼溶液 称取2 4 二硝基苯肼 A R 100mg 加入约200ml1mol LHCI 加热使其溶解 冷却后再以1mol LHcl定容至500ml 此液贮于棕色瓶内 置冰箱保存可用半月 5 0 4mol LNaoH 操作 1 标准丙酮酸液 取干燥洁净试管8支 编号 按表S21 1加入各试剂 另取干燥洁净试管9支 编号 在1 8号管中依次加入上述稀释的1 8号丙酮酸标准液0 1ml 在9号管中加人0 1mol L pH 7 4磷酸盐缓冲液0 1mI 再按表S21 2操作 各管混匀 置37 水浴保温20min 取出加0 4mol LNaOH混匀 于lOmin后在30min内用520nm波长比色 用空白管 第9号管 调节零点 测定各管吸光度值 以各管吸光度值为纵坐标 各管中丙酮酸含量为横坐标 绘制标准曲线 实际应用时