血清γ-球蛋白的分离-夏洪

血清 球蛋白的分离纯化与鉴定 指导教师 夏洪李晓梅 本次实验内容 一 血清 球蛋白的分离与纯化 二 血清 蛋白的鉴定 醋酸纤维素薄膜电泳 一 血清 球蛋白的分离与纯化 实验17 1 掌握蛋白质分离纯化的主要方法和原理 2 熟悉盐析和层析的基本操作 3 掌握离心机的正确使用方法 实验目的 仪器试剂 试管 刻度吸管 吸耳球 胶头滴管 层析柱 反应板 血清 PBS液 葡聚糖凝胶G 25 纳氏试剂 双缩尿试剂 饱和硫酸铵溶液 实验原理 1 盐析 是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法 1 蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素 电荷 同种电荷相斥 水化膜 隔离 Pr 中性盐破坏了这两个稳定性因素 使蛋白质沉淀 中性盐加入蛋白质溶液 中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质 于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失 同时 中性盐加入蛋白质溶液后 由于离子强度发生改变 蛋白质表面电荷大量被中和 更加导致蛋白溶解度降低 使蛋白质分子之间聚集而沉淀 沉淀蛋白质的方法还有哪些 2 盐析的影响因素 蛋白质的浓度 盐浓度 pH值 温度等 本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀而清蛋白溶解 球蛋白在33 浓度的硫酸铵溶液中沉淀 2 层析 待分离蛋白质溶液 流动相 经过一个固态物质 固定相 时 根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小 电荷多少及亲和力等 使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配 并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 3 检测分离效果 1 纳氏试剂 盐存在时 NH4 与其反应呈现黄色或橙色 2 双缩尿试剂检测 蛋白质与其呈现红色或紫红色 1 盐析 血清2ml放入离心管中 加入PBS2ml混匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液2ml 边加边摇匀 静置10分钟后 离心3000rpm10分钟 倾上清液 上清中主要含清蛋白 球蛋白 实验操作 将离心管中的沉淀用1mlPBS搅拌溶解 再逐滴加入饱和硫酸铵溶液0 5ml 边加边摇匀 静置10分钟后 离心3000rpm10分钟 注意离心机使用时需要配平并且离心时将盖子盖好 倾上清液 上清中主要含清蛋白 球蛋白 沉淀即为初步纯化的 球蛋白 装柱 将制好的葡聚糖凝胶混匀 倾入层析柱内 静止后分层 凝胶高度要在柱高的1 3 3 4之间 当液面接近凝胶上表面时将出口胶管夹紧待用 2 脱盐 注意 装柱要均匀 不要有气泡和分层 凝胶面要平整 2 加样 向装有 球蛋白的离心管内加入PBS10滴 用玻璃棒搅拌使之溶解 再用乳头吸管吸出 球蛋白液 加到层析柱内凝胶表面 待 球蛋白液全部进入凝胶柱内时 再用乳头吸管小心加入PBS约1cm高 待大部分液体进入凝胶柱后 再继续加PBS直至洗脱完毕 加液时注意不要冲击凝胶表面 在整个洗脱过程中不能让液面降至凝胶面以下 3 收集 加样同时可进行收集 每管收集1ml 收集12管后加紧螺旋夹 回收凝胶和尼龙布等 检测 准备反应板两块 将12管收集液各取1滴分别放入反应板的12个凹孔 一块板的各孔内加纳氏试剂1滴 有NH4 者呈黄色至橙色 可用 号表示有无呈色或颜色深浅 再向另一块板的各孔内加双缩脲试剂1滴 有蛋白者呈蓝紫色 实验结果 可用 号表示有无呈色或颜色深浅 将双色脲反应呈色最深的一管收集液保留供下次实验使用 利用醋酸纤维素薄膜电泳检测本次实验所提 球蛋白的纯度 1 使用离心机前注意配平 2 装柱要均匀 不要有气泡和分层 凝胶面要平整 3 凝胶高度要在柱高的1 3 3 4之间 4 脱盐时不能冲击凝胶面 PBS液面不能降到凝胶面以下 5 实验后将凝胶中盐洗脱干净后回收再利用 实验注意事项 思考题 1 装柱不均匀 凝胶面不平整对实验结果有什么影响 2 盐析与变性的异同 3 凝胶层析的原理 透析与浓缩 Dialysistechnique 透析 透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里 放入透析液 蒸馏水或缓冲液 中进行的 透析液可以更换 直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止 原理 利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质 使蛋白质和其他小分子物质如无机盐 单糖等分开 浓缩 Anti dialysis 浓缩将凝胶过滤得到的 球蛋白液倒入透析袋内 悬于盛有浓蔗糖溶液的小烧杯内 振荡1小时以上 观察袋内液体体积变化 二 血清 蛋白的鉴定 醋酸纤维素薄膜电泳 实验8 1 掌握电泳的基本原理 2 熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法和应用 实验目的 仪器试剂 电泳仪 点样器 镊子 醋酸纤维素薄膜 巴比妥缓冲液 染色液 漂洗掖 实验原理 1 蛋白质是两性电解质 在同一个PH环境下 混合蛋白质中各种成分带电量不同 分子大小不同 在同一电场中泳动的速度不同 导致相同的时间迁移的距离不同而把它们分开 1 分子越小 泳动速度越快 2 带电量越多 泳动速度越快 反之 越慢 2 本实验分离全血清中各种蛋白质成分 同时鉴定上次实验提纯结果 点样 2 1清蛋白 球蛋白 1 准备与点样 用巴比妥缓冲液将醋酸纤维素薄膜充分浸透 在毛面距一端1 5厘米处点样 即上述实验得到的 蛋白 另取薄膜一点全血清 2 电泳 点样面朝下 点样端靠近负极 电流1mA 条 通电40 45min 3 染色 2 5min 4 脱色 直至背景漂净为止 实验操作 实验结果 根据电泳区带出现的位置和条数判断是何种血清蛋白 如果只是一条 蛋白说明上个实验分离纯化的较好 1 不要用手触摸纤维素膜