第三章发育生物学研究技术和方法

第三章发育生物学研究技术和方法 在第一章回顾发育生物学的历史时 我们已了解了实验技术对发育生物学发展的突出贡献 特别是分子生物学的兴起给发育生物学的发展所带来的活力 事实上 发育生物学是一门实验性很强的学科 很多重要的发育理论和发育模型都是在大量实验结果的基础上建立起来的 其中涉及各种各样的研究技术和方法 既有传统的胚胎学和细胞学方法 如胚胎移植 胚胎分割 细胞核移植等 又有新发展的分子生物学方法 如显微注射 原位杂交 基因转移及基因功能分析等 本章将重点介绍发育生物学研究中的几种常用方法 第一节显微注射显微注射 microinjection 是发育生物学研究中最经典而又使用最为普遍的一种方法 特别是近十几年来通过基因转移创造生物反应器这一具有明显商业价值的应用研究的开展 更显现出这一技术的活力 本节将介绍显微操作系统 注射用卵子或胚胎的准备 操作过程等 一 显微操作系统显微操作系统已经历了多次更新和发展 现今普遍使用的显微操作器一般由带荧光或相差的倒置显微镜 显微操作臂 注射器及玻璃微吸管 摄像装置和计算机图像处理装置等组成 为了配制一个性能优良的用于发育生物学研究的显微操作系统 虽有许多必须考虑的因素 但由于现在普遍采用的显微操作系统一般都是配套购置 且都具有详细的说明书 因而这里就不详述 有兴趣者还可参考有关文献 二 显微注射步骤1 注射用卵母细胞的制备在鱼类和两栖类动物中 卵母细胞可采用两种方法获得 一是将动物麻醉后 通过解剖取出卵巢叶 两栖动物 或用挖卵器从泄殖孔取出所需要的卵母细胞 另一种方法是杀死动物 取出全部卵巢 对哺乳动物而言 一般通过超数排卵 superovulation 获得更多的卵母细胞 即模拟体内卵母细胞发育与排放的激素调节模式 通过注射不同的促性腺激素 刺激暂时处于休眠状态的卵母细胞进入成熟发育期 成熟后排放到输卵管中 由此可以获得的卵母细胞远多于自然排卵 下面以两栖动物爪蟾为例 简要介绍制备卵母细胞的这两种方法的基本步骤 1 取出完整卵巢及卵母细胞的培养 2 取出卵巢叶及卵母细胞的培养2 注射用胚胎的制备3 显微注射在开始注射之前 应准备好所有试剂和器具 第二节胚胎原位杂交 一 全胚原位杂交全胚原位杂交 wholemountinsuitehybridization WISH 是广泛用于胚胎发育调控基因表达研究的一种技术 近年来该技术发展较快 不仅可以检测到较弱的杂交信号 而且可以多色杂交 检测多个基因的表达情况 全胚原位杂交的基本原理 是用各种标记物标记与体内特定mRNA互补的RNA分子 反义RNA 以它们作为探针与动物的整体胚胎进行原位杂交 然后用相应的抗体来检测特异探针的分布情况 以下以爪蟾胚胎为例介绍全胚原位杂交的操作步骤 其他动物的全胚原位杂交与爪蟾基本相同 一 单色全胚原位杂交1 原位杂交试剂2 操作步骤 1 探针制备 2 胚胎的固定与保存 3 原位杂交 4 洗脱和检测 二 双色全胚荧光原位杂交 用2种不同的标记物 DIG 11 dUTP 生物素一11一dUTP等 分别标记2个探针 同时与胚胎杂交 然后对两个探针分别用相应的抗体进行检测 在双色全胚原位杂交中 探针的制备 胚胎的固定杂交及洗脱方法与单色原位杂交步骤相同 只是检测方法有所不同 两次加入不同的抗体进行两次显色 二 胚胎组织切片原位杂交 原位杂交是研究胚胎基因表达的常用方法 虽然全胚原位杂交简单易行 但在许多情况下 该方法还达不到研究的要求 因而需要在胚胎的组织切片上进行杂交 在胚胎的组织切片上杂交的有利因素在于不存在探针不能渗入到胚胎内部的问题 第三节胚胎免疫组织化学技术 一 用途 胚胎免疫组织化学是定位胚胎内的内源或外源蛋白质的一种有效方法 该技术操作相对简单 如果和其他一些免疫学技术结合使用 可以快速获得相关蛋白质功能的有关信息 二 胚胎免疫组织化学技术的基本原理 是用某种蛋白质免疫其他动物 通常为鼠或兔 而获得相应的抗体 初级抗体 再用初级抗体免疫另一种动物 获得次级抗体 在次级抗体上偶联上一种酶 如碱性磷酸化酶 构成免疫复合物 将胚胎与初级抗体结合后 洗去多余的抗体 再与免疫复合物结合 最后利用显色反应来确定胚胎内特定蛋白质的表达位置 本节以爪蟾胚胎为例介绍胚胎蛋白质免疫组织化学检测的操作方法 三 操作方法1 实验所需溶液2 爪蟾胚胎免疫组织化学检测 1 胚胎固定 2 漂白 3 免疫检测 4 胚胎切片 第四节发育基因的启动子分析 一 用途启动子调控作用分析是研究胚胎发育基因功能的一种重要方法 特别在研究基因时空表达的分子机制方面 更是有突出的作用 通常 启动子分析包括基因特异调控序列 启动子 promoter 和增强子元件 enhancerelement 的鉴别 它们都是基因转录活性的重要调控单元 二 原理 启动子分析的第一步是将一系列大小不同的启动子的片段克隆到含有报告基因 reportergene 的载体中 然后通过比较这一缺失系列中启动子的活性 找到启动子中具有调控能力的序列 随后 将被鉴定出来的调控序列分为更小的片段 并亚克隆到含有异源活性启动子 如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因启动子 和报告基因的载体中 再次比较缺失系列启动子的活性 以确定调控序列中的最关键序列 最后 可通过野生型启动子中单个碱基的点突变 进一步确定基因的关键调控元件 图3 2 有多种方法可用于体内 invivo 启动子分析 如转基因动物 显微注射等 在不同的动物中可选用不同的方法 但比较而言 转基因动物法较为费时 而且需要一些特殊条件 而显微注射法较为简单 本节将以斑马鱼胚胎中goosecoid基因启动子分析为例介绍启动子的定性和定量分析方法 1 实验所需试剂2 分散囊胚细胞中的启动子分析3 完整胚胎中启动子的定量分析4 整体胚胎中启动子空间活性分析 第五节基因表达的核糖核酸酶保护分析 一应用 核糖核酸酶 RNase 保护实验是定量分析基因转录水平的常用方法之一 它对mRNA的分析具有灵敏度高 比Northern杂交和点杂交灵敏8 10倍 特异性强的特点 另外 核糖核酸酶保护实验还可用于转录起始位点的确定 内含子 外显子边界的确定 选择性剪接 alternativesplicing 分析及确定转入到胚胎中的核酸的降解率等方面的研究 核糖核酸酶保护实验的基本原理是 将待分析的目标DNA序列作为模板 用逆转录的方法合成与之互补的放射性标记的探针 将此探针加入到RNA混合物中后 它便可与目标RNA杂交 形成双链RNA 由于该双链对核糖核酸酶具有抵抗力 因此 杂交体系中未杂交的样品RNA 及过量的探针全部被核糖核酸酶消化 只剩下杂交形成的双链RNA 核糖核酸酶失活后 通过凝胶电泳和放射自显影检测被保护的RNA探针的量 即RNA样品中目标RNA的量 1 实验用试剂2 操作步骤 1 胚胎总RNA提取 2 RNA探针的合成和纯化 3 杂交和RNA酶消化 第六节抑制性差减杂交技术 一 应用 抑制性差减杂交 suppressionsubtractivehybridization SSH 最早见于1996年6月Clontech公司 加州大学旧金山分校和俄罗斯科学院合作的研究报道 Diatchenkoeta1 996 是一种简便而高效的通过比较两种总mRNA 而克隆只存在于其中一种总mRNA中特异表达产物的新方法 例如可以快速从不同细胞系 不同组织间或同一细胞系 同一组织在不同条件下 如发育时间的差异 病理性差异等 克隆出差别表达基因 二 原理是以抑制PCR为基础的DNA差减杂交 抑制PCR 是利用DNA链内退火优于链间退火 比链间退火更稳定的特点 使非目的系列片段两端反向重复系列在退火时产生类似于 锅一柄 的结构 无法与引物配对 选择性地抑制了非目的基因片段的扩增 同时 该方法运用了杂交二级动力学原理 即高丰度的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于低丰度的单链cDNA 从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致 三 SSH基本过程是 抽提2种不同细胞如肿瘤细胞和正常细胞的mRNA分别作为检测样本 tester 和参照样本 driver 反转录成cDNA 用RsaI或HaeIII酶切 以产生大小适当的平头末端cDNA片段 将 testercDNA分成均等的2份 各自接上2种接头 与过量的drivercDNA变性后退火杂交 第一次杂交后有4种产物 a testercDNA b 自身退火的testercDNA双链 c 是tester和driver的异源双链 d 是drivercDNA 第一次杂交的目的是实现tester单链cDNA均等化 normalization 即使原来有丰度差别的单链cDNA 的相对含量达到基本一致 由于testercDNA中与drivercDNA 序列相似的片段大都和drivercDNA形成异源双链分子 c 使testercDNA 中的差异表达基因的目标cDNA得到大量富集 第一次杂交后 合并2份杂交产物 再加上新的变性driver单链 再次退火杂交 此时 只有第一次杂交后经均等化和扣除的单链testercDNA和drivercDNA一起形成各种双链分子 这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA 产生了一种新的双链分子 e 它的2个5 端有2个不同的接头 正由于这2个不同的接头 使其在以后的PCR中被有效地扩增 图3 3 操作过程1实验中所需试剂2实验步骤 1 RNA的提取 2 Driver和TestercDNA的制备双链cDNA的合成Rsa1消化DrivercDNA的制备 3 差减杂交 4 PCR扩增 5 差减文库的构建及差减基因的克隆 三 控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法 一 鉴定发育相关新基因的主要方法 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因 分离时空特异性表达基因的方法 利用基因序列同源性的克隆法 利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因 隐性突变 半显性突变 显性突变 突变体的类型 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因 突变类型图示 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因 自然群体中的突变体 化学诱变剂处理 如亚硝基 乙脲 乙亚硝基脲 N nitroso N ethylureaethylnitrosourea ENU 外源DNA插入法 如DNA注射 病毒感染 转座子利用等 X 射线或r 射线照射 获得突变体的方法 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因 隐性突变体的鉴定方法 化学诱变法 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因 DNA插入诱变法 ExpressionofGFPinvirus infectedfish Transient germline 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因 DNA插入诱变法 Anexampleofmutationalphenotypes 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因 DNA插入诱变法 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因 Geneticmappingandchromosomalwalking PCRorSouthernhybridization Candidatecloning Differentialdisplay subtractivecloning 从突变体克隆基因的方法 分离时空特异性表达基因的方法 获取特定组织 直接取材或转基因法取材 构建cDNA文库 从蛋白质到基因 Differentiatialhybridization differentialdisplay subtractivecloning 分离时空特异性表达基因的方法 基因芯片 核酸杂交法 Subtractivecloning 分离时空特异性表达基因的方法 利用基因序列同源性的克隆法 用一个物种的基因直接做探针分离另一个物种的同源基因 根据多个物种的蛋白序列分离另一个物种的同源基因 根据同一基因家族的不同成员间的保守序列分离新的家族成员 利用大分子间的相互作用克隆新的基因 鉴定可与蛋白质结合的DNA序列分离靶蛋白质 可采用gel shiftassay 克隆靶蛋白的表达基因 利用DNA与蛋白质间的相互作用 分离时空特异性表达基因的方法 利用蛋白质之间的相互作用 酵母双杂交法 二 基因表达的检测 mRNA的检测蛋白质的检测启动子活性检测 mRNA的检测 NorthernblotDotblotRT PCRDNAMicroarrayinsituhybridization Northern杂交的作用 检测基因的转录物的存在及是否发生了选择性拼接 mRNA的检测 原位杂交 insituhybridization 利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱 mRNA的检测 启动子活性检测法 表达载体的构建 三 基因对发育的影响的功能性研究 基因敲除法 geneknockout 异位表达法 ectopicexpress