1例急性期的2型登革病毒感染病例的检测结果分析.doc

1例急性期的2型登革病毒感染病例的检测结果分析 1例急性期的2型登革病毒感染病例的检测结果分析郭川1林洁敏1陈婉张志华李进2伦镜盛2汕头市疾病预防控制中心515041；2汕头大学生物学系515063通信作者郭川，Emailpo吼一science126，电摘要】目的分析登革病毒(dengue virus，DENV)感染病例各检测指标值的关系，为制定合理的检测策略提供经验。 方法以1例急性期2型DENV感染病例为例，分析检测中抗原、抗体及核酸结果之间的联系。 结果在NSl抗原初检、IgM和IgG抗体检测皆为阴性情况下，核酸检测出现阳性结果；该病例所感染毒株的Nsl编码基因未发生明显变异；而更换另一种NSl抗原试剂进行复检则结果阳性。 结论实验室要进行登革病例的排查应以核酸检测结果为依据，NSl抗原用另一种试剂进行复检可以减少漏检的几率，增加结果的可信度。 【关键词1登革病毒；抗原；核酸抗体基金项目汕头市科技计划项目(汕府科2018155号)DOI103760cmajissn1003-9279201904022Analysis Ofthe resultsof examinationsof anacute phase case inf电cted winItype2dengue VirusGuoC_Il“口，11，in以emi，l。 ，Cen IF么，11，Z口，lg2冼i口，i以，皤。 ，Lu，l，lgse，培21Ce，le，br D如ense Co，毫rof口，ld PretJe，ltion矿s口nou，Js口，ltou51504l，Cin口；2Biof99记口f Dep口n，ne凡t矿So，lto“西ersit)，S_Il口nou515063，CinnCorrespo凡di，培口orGno Cunn，Em口甜Postscie，毫cel26，死f0086754884l l305【Abst阻ct】objectiveTo analyzethe resultsof variousmethods todetect denguevinls(DENV)infec“on andto provideexpe“ence forIhe developmenl of reasonabledeteclion strategieson DENVinfec“onMethods Anacute phasecase infectedwithtype2DENV wasused asan exampleto analyzevariousmethods of detection andthe relationoftheir resultsResults WhileNS lantigen，IgM andIgG antibodywereall negative，the nucleic acid testshowed apositive result；the NS1coding geneof theDENV slrainfromthe infectedcase didnot mutatesignificanlly；by additionaluse ofNSl reagentsfromothermanufacturers，the antigentestresult tumedtoweakly positiveConcIusions Toconduct screeningofdengue f色ver cases，the resultof nucleicacid detectionshould alsobe appliedMoreover，addjtional useofNS lreagentsf如m othermanufacturers couldbe helpfulinreducing misseddiagnosis，and couldobtain morereliableresult【Key words】Dengue virus；Antigen；Nucleic acid；AntibodyFund programScienceand TechnologyPlanning Projectof ShantouCity(Shanfuke2018155)DOI103760cmajissn1003-9279201904022登革热(dengue fever)是流行于热带和亚热带地区的重要虫媒传染病，全球每年约5000万人被感染?。 感染者主要呈现出登革热、登革出血热及登革出血休克综合征3种代表性体征旧1。 登革病毒(dengue virus，DENV)是引起登革热的病原，属于黄病毒科，其基因组11kb的RNA编码3种结构蛋白(C、M、E)和7种非结构蛋白(NSl、NS2A、NS2B、NS 3、NS4A、NS4B、NS5)。 非结构蛋白NSl在病毒感染、复制及病理过程中起着重要作用，而且437病例研究可在急性期感染者血清中检出，因此目前普遍作为登革热早期诊断的重要指标?。 在一般情况下NSl抗原与核酸应呈现正相关的关系。 本文报道1例2型DENV感染的急性期病例，其抗原与核酸的检测则呈现不同的结果。 1材料与方法11病例情况病例编号18STGFW一3008，患者女性，65岁，于2018年7月24日发病，2018年7月27万方数据主堡塞堕塑堕压堑垂堂苤查!至!旦笙!鲞箜!塑曼!堕望!垦翌!尘i竺!垒!型坠!塑!堕!日到医院就诊。 主要症状为发热，全身酸痛，白细胞335109L，血小板198109L；采取血液样本分离血清进行NSl抗原、IgM抗体、IgG抗体、核酸检测及病毒血清型别鉴定。 12主要试剂DENV NSl抗原检测抗原试剂盒1(澳洲Panbio公司产品，批号01GDB002A)，抗原试剂盒2(北京喜乃健检测有限公司，批号0908N11D00B)；DENV抗体检测登革热抗体IgGIgM快速检测试剂(澳大利亚Panbio公司产品，批号01FDB006A)；核酸检测DENV通用型核酸检测试剂盒(荧光PcR法，江苏硕世诊断公司产品，批号2018叭02)，DENV2型分型试剂盒(荧光PCR法，江苏硕世诊断公司产品，批号20180201)；基因扩增所用RTPCR试剂(TaKaRa公司产品，批号AGH0906A)。 13抗原检测用抗原试剂盒1对18STGFW一3008病例样本进行NSl抗原检测，随后用抗原检测试剂盒2进行复检。 14抗体检测用登革热抗体IgGIgM快速检测试剂对18STGFW一3008病例样本进行IgM和IgG抗体检测。 15病例DENV NSl基因序列测定NSl基因扩增弓I物P rimer F5一GCGGTACCAATTCACGCAGC一37，Primer R5GCTCTAGATCTGTGACCAAGGAG-3由上海生工生物工程股份有限公司合成；NSl基因扩增方法如下扩增体系25l2PcR buffer125l，P“merF1(10肛m01L)l，P rimerR(10斗molL)1斗l，Takara ExTaq HS05斗1，PriseScript RTenzymeMix05斗1，RNA模板95斗1；程序设定4220min，942min，循环设定40次(9430s，54。 C40s，721min)，最后72cC10min。 扩增产物由深圳华大基因有限公司完成基因序列测定。 16基因序列分析测序结果用生物信息学软件DNAStar60SeqMan进行拼接处理后获得18sTGFw一3008病例所感染DENV毒株的Nsl蛋白氨基酸序列，将此序列输入ncbinlmnihgov网站进行BLAST分析。 2结果21病例的检测结果经抗原试剂盒1检测，该病例的Nsl抗原阴性(图1A)；经DENV抗体检测，IgM、IgG抗体均为阴性(图1B)；但核酸检测的结果表明该病例是2型DENV感染的阳性病例，c值在20左右，提示该病例发病时间较短，尚未产生抗体，处于急性期(图2)。 经抗原试剂盒2复检，结果为弱阳性(图1C)。 A BC1r1T、L一一LJ注ANsl抗原初检；BIgM和IgG抗体检测；cNsl抗原复检图118sTcFw一3008病例的Nsl抗原和IgM、IgG抗体检测结果Not8ANS lantigen“rst detecljo“；BIgM andIgC antibodydetectio“；S1antigen seconddetectionFig1Results ofNSl anligen andIgM，IgG ancibodydPlection inthe case】8STGFW300840e+635e+6壶3oe_6弘嚣鬟l5e_6替lo邮萎s。 哪O0e_550e+S；一?一_，-j，。 i1一”f4?PCR循环数篇?肌-一注A登革病毒通用型核酸荧光PCR检测结果(C值21)；B登革病毒2型核酸荧光PcR检测结果(c值20)图218sT-CFw3008病例的核酸检测结果NoteAThe resultof de“gue virusuniversal lypenuorescent PCRdetectjon(cValue21)；BThe resultofde“gue virLlsype2fluorescent PCRdeIection(Cvalue20)Fig2Results ofnucleicaciddetection int11ecasel8ST-GFW一300822序列分析结果所检出毒株进行Nsl核酸序列测定后转化为蛋白氨基酸序列并在GenBank中进行BLAST分析，结果表明，毒株的Nsl蛋白氨基酸序列与其他已发现毒株序列具有较高的相似度，有94条与18sTGFw一3008病例毒株序列相似性为100，说明蛋白氨基酸序列尚未发生明显变异。 因此推测其抗原性依然保持稳定，不同Nsl检测试剂间结果差异是由于试剂生产制备工艺的特点，而非毒株本身基因的变异所造成。 万方数据主堡塞笙塑堕鏖疸垂堂苤查!生!旦箜!鲞箜!塑垦坐竺!垦!P!也!i翌!垒!壁!堕!13讨论有报道61指出，机体感染DENV后的27d内开始发病。 发病1d后便可在患者体液中检测到Nsl抗原，并持续到第9天左右。 在检出NSl抗原的同时也可检出DENV核酸，并持续到第7天。 原发性感染患者35d后首先出现IgM抗体并持续13个月不等。 IgG抗体一般在第8天开始出现，预示着机体开始进入恢复期。 继发感染的患者则IgM和IgG抗体几乎同时较早出现，引起比较强烈的免疫反应。 各种病毒检测结果可以结合发病时间对患者是否为登革热感染病例进行综合分析和判定。 世界卫生组织(world HealthOrganiaztion，wH0)在登革热防控全球战略(xx2020)中指出NSl抗原可用于登革热的早期诊断指标7o；广东省登革热防控专业技术指南(xx年版)也指示NSl抗原阳性可作为阳性确诊病例的判定依据，但同时也指出阴性不能排除DENV感染。 因为病程较久的感染者体内产生了抗体，NSl抗原会被中和或降解而检测不出。 因此有报道建议将Nsl抗原、IgM和IgG抗体等血清学指标结合起来考虑以排查登革热感染病例，特别是发病时间较长的疑似病例。 NSl抗原、IgM抗体和IgG抗体3项皆为阴性者，如果临床和流行病学资料未能提供有力支持，一般会排除是DENV感染病例。 但在本文报道的18sT-GFw3008病例即使3项指标皆为阴性，核酸却呈现阳性结果。 研究人员一开始怀疑是由于病例所感染毒株的NSl编码基因的变异导致原有检测试剂未能成功检出NSl抗原。 但经过序列测定及BLAST分析，发现NSl抗原的氨基酸序列与GenBank已有的毒株比较，相似性近100，抗原性依然维持保守和稳定。 推测NSl抗原水平和核酸丰度在血清中虽理论上呈现正相关却并非同步，Nsl抗原有可能出现明显降解，但核酸的丰度依然维持在较高水平，而此时抗体尚未产生。 因此，以Nsl抗原结合抗体检测来排查登革病例，也要考虑核酸检测结果，否则可能出现漏检。 以上情况说明核酸检测在DENV感染病例判定中的重要性。 但在临床或基层实验室无法具备核酸检测的实验室条件，若要实现感染的快速排查，最好用另一种NSl抗原试剂同时进行检测，能获得比较可靠的结果。 研究人员后来用另一种Nsl检测试剂对18STGFW一3008的检测结果为弱阳性(图1c)。 同时，研究人员也发现所用的两种NSl早期检测试剂对1型DENV感染样本的检测能力并无明显差异，但对2型DENV样本则显示出一定的差异(未发表结果)。 推测不同厂商的试剂由于所用工艺及所包被的单克隆抗体等原料的不同，针对不同型别的病毒样本，检测结果有所差异。 单用一种NSl检测试剂会对某种型别病毒的检测存在一定盲区，因此实验室要进行病例的快速排查，用其他品牌的试剂进行复检方能获得较为可靠的结果。 有条件的实验室则必须用核酸检测进行确认。 利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突志谢本研究得到广东省疾病预防控制中心病原微生物检验所的指导作者贡献声明郭川、林洁敏实验操作、论文撰写；李进、伦镜盛数据、生信分析；陈婉、张志华研究指导、论文审阅、经费支持参考文献1wH0Dengue andsevere dengueEB0Lxx-02-01whointmediacentrefactsheetsfsll7en2Halstead sBPathogenesis ofde“gue challengestomolecularbiologyJscience，1988，239 (4839)476-481DOI101126science2394839，4763chambers”，Chang sH，Galler R，e【a1Flavivirus genomeorganization，elpression，and replicationJAnnu RevMicrobiol，1989，44649-688DOI101146annurevmi441001900032454杨笑涵，