生化-第17章 蛋白质的生物合成

生物化学,第十七章 蛋白质的生物合成 （翻译）,Protein Biosynthesis(Translation),主讲人：董俊红,蛋白质的生物合成，即翻译，生物体内的蛋白质以mRNA为模板而合成。在这一过程中，mRNA上来自DNA基因编码的核苷酸序列信息转换为蛋白质中的氨基酸序列，故称为翻译（translation）。,（1）氨基酸的活化（2）肽链的生物合成（3）肽链形成后的加工和靶向输送,反应过程,第一节 蛋白质生物合成体系,Section 1 Protein Biosynthesis System,掌握三种RNA（tRNA、rRNA、mRNA）在蛋白质生物合成中的作用。掌握遗传密码的概念、数目及其特点（连续 性、简并性、摆动性、通用性）。掌握核蛋白体是肽链合成的场所。熟悉核蛋白体的组成。,目的要求,基本原料：20种编码氨基酸模板：mRNA适配器：tRNA装配机：核蛋白体主要酶和蛋白质因子：氨基酰-tRNA合成酶、转肽酶、起始因子、延长因子、释放因子等能源物质：ATP、GTP无机离子：Mg2+、 K+,蛋白质生物合成体系,一、mRNA是蛋白质生物合成的信息模板,从mRNA 5-端起始密码子AUG到3-端终止密码子之间的核苷酸序列，称为开放阅读框架(open reading frame, ORF)。,mRNA上的遗传密码子,在mRNA的开放阅读框架区，以每3个相邻的核苷酸为一组，代表一种氨基酸(或其他信息)，这种三联体形式的核苷酸序列称为遗传密码(genetic codon)。,61种编码20种氨基酸，称为有意义密码。 AUG 编码Met 起始密码UAA，UAG，UGA为终止密码，不编码任何氨基酸,mRNA上四种核甘酸：A、G、C、U组成64组遗传密码：,遗传密码表,除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有2、3、4个或多至6个三联体为其编码。, 方向性 连续性； 简并性； 摆动性； 通用性。,遗传密码的特点：,遗传密码的特点,1. 方向性(directional),翻译时遗传密码的阅读方向是53，即读码从mRNA的起始密码子AUG开始，按53的方向逐一阅读，直至终止密码子。,2. 连续性(commaless),编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。,由于遗传密码的连续性，可对mRNA进行编辑，使同一mRNA前体翻译出不同功能的多种蛋白质。,益 处：,许多真核生物基因转录后有一个对mRNA外显子加工的过程，可通过特定碱基的插入、缺失或置换，使mRNA序列中出现移码突变、错义突变或无义突变，导致mRNA与其DNA模板序列不匹配，使同一前体mRNA翻译出序列、功能不同的蛋白质。这种基因表达的调节方式称为mRNA编辑（mRNA editing）。,基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失可能导致移码突变(frameshift mutation)。,弊 端：,谷 酪 蛋 丝,正常,5 G A G U A C A U G U C ,缺失C,同一氨基酸存在多个不同的遗传密码的现象称为遗传密码的简并性。,3. 简并性(degeneracy),编码同一种氨基酸的多组密码，称 为同义密码子。,各种氨基酸的密码子数目,遗传密码的简并性在保持遗传稳定性上具有意义。,同义密码间第一、二碱基多相同，第三位上有差异,如，苏氨酸的密码：ACU、ACC、ACA、ACG。 当这些密码第三位的碱基发生突变时，而不影响所翻译氨基酸的种类。不同生物间在翻译中，对同一氨基酸的几组密码，可表现选择某些密码优先使用的特性，称为对遗传密码的 “偏爱性”,4. 摆动性(wobble),反密码子与密码子之间的配对有时并不严格遵守常见的碱基配对规律，这种现象称为摆动配对(wobble base pairing)。,一般说来，遗传密码的前两位碱基和反密码子碱基配对时遵循碱基配对规律，而第三位碱基则有一定的灵活性，这种现象称为摆动配对。,U,3 2 1,1 2 3,摆动配对,蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。 密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。,5. 通用性(universal),已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。,二、氨基酰-tRNA通过其反密码子与mRNA中对应的密码子互补结合,tRNA的作用,运载氨基酸：氨基酸各由其特异的tRNA携带，一种氨基酸可有几种对应的tRNA，氨基酸结合在tRNA 3-CCA的位置，结合需要ATP供能；充当“适配器”：每种tRNA的反密码子决定了所携带的氨基酸能准确地在mRNA上对号入座。,二级结构,三级结构,反密码环,氨基酸臂,tRNA的构象,三、核糖体是肽链 “装配厂”,核蛋白体的组成,核蛋白体又称核糖体，是由rRNA和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒，是蛋白质生物合成的场所。,核蛋白体的组成,36,不同细胞核蛋白体的组成,原核生物翻译过程中核蛋白体结构模式,A位：氨基酰位(aminoacyl site),P位：肽酰位(peptidyl site),E位：排出位(exit site),与模板mRNA和起始tRNA结合位点：主要与小亚基有关,A位：又称受位或氨酰基位，可与新进入的氨基酰tRNA结合；由大、小亚基成分构成。,P位：又称给位或肽酰基位，可与延伸中的肽酰基tRNA结合；由大、小亚基成分构成。,E位：又称排出位，空载tRNA脱离核蛋白体前的结合位点；主要由大亚基成分构成。,原核生物核蛋白体结构模式,四、肽链生物合成需要酶类、蛋白质因子,（一）重要的酶类,氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyltRNA synthetase)，催化氨基酸的活化；转肽酶(peptidase)，催化核蛋白体P位上的肽酰基转移至A位氨基酰-tRNA的氨基上，形成肽键; 表现出酯酶的水解活性，使P位上的肽链与tRNA分离；转位酶(translocase)，催化核蛋白体向mRNA3-端移动一个密码子的距离，使下一个密码子定位于A位。,（二）蛋白质因子,起始因子（initiation factor，IF）延长因子（elongation factor，EF）释放因子（release factor，RF）,参与原核生物翻译的各种蛋白质因子及其生物学功能,参与真核生物翻译的各种蛋白质因子及其生物学功能,蛋白质生物合成的能源物质为ATP和GTP;参与蛋白质生物合成的无机离子有Mg2+、K+ 等。,第二节 氨基酸与tRNA的连接,1.掌握tRNA是氨基酸的搬运工具。2.熟悉氨基酰-tRNA合成酶的特异性 及其催化的反应。,目的要求,氨基酸臂,反密码环,一、氨基酰-tRNA合成酶识别特定氨基酸和tRNA,第一步反应,第二步反应,氨基酰-tRNA合成酶,结构,氨基酰tRNA合成酶的3个结合位点,氨基酸和ATP形成氨基酰腺苷,氨基酰转移到tRNA上,tRNA负载了氨基酸,氨基酰-tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性。,特性,氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性。,动力学校对,化学校对,特性,氨基酰-tRNA的表示方法,丙氨酰-tRNA： Ala-tRNAAla精氨酰-tRNA： Arg-tRNAArg甲硫氨酰-tRNA：Met-tRNAMet,各种氨基酸和对应的tRNA结合后形成的氨基酰-tRNA表示为：,氨基酸的三字母缩写-tRNA氨基酸的三字母缩写,例如：,真核生物： Met-tRNAiMet原核生物： fMet-tRNAifMet,二、肽链合成的起始需要特殊的起始氨基酰-tRNA,AUG,起始密码,甲硫氨酸的密码,所以辨认AUG密码的tRNA有两种,fMet-tRNAfMet的生成是一碳化合物转移和利用的过程之一，反应由转甲酰基酶催化，甲酰基从N10-甲酰四氢叶酸转移到甲硫氨酸的-氨基上。,第三节 肽链的生物合成过程,Section 3 The Process of Protein Biosynthesis,掌握核蛋白体循环的概念。熟悉三步循环反应（进位、成肽和转位）；释放因子的作用。 了解真核蛋白质生物合成的主要过程。,目的要求,翻译过程从阅读框架的5-AUG开始，按mRNA模板三联体密码的顺序延长肽链，直至终止密码出现。 合成肽链方向是从N端到C端。,起始(initiation)延长(elongation)终止(termination ),整个过程可分为 ：,一、翻译起始复合物的装配启动肽链合成,（一）原核生物翻译起始复合物的形成,指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物的过程。,与多肽链合成起始有关的蛋白因子称为起始因子（initiation factor，IF）。原核生物中存在3种起始因子，分别称为IF1-3。IF的作用主要是促进核蛋白体小亚基与起始tRNA及模板mRNA结合。,1. 起始因子（IF）,包括以下几个步骤：,核蛋白体大小亚基分离；mRNA在小亚基定位结合；起始氨基酰-tRNA的结合； 核蛋白体大亚基结合。,2. 原核生物翻译起始复合物形成,IF-3,IF-1,1).核蛋白体大小亚基分离,2) mRNA在小亚基的精确定位结合：,两种机制保证了mRNA在小亚基上的精确定位SD序列；小核苷酸序列。,S-D序列,小核甘酸序列,rRNA (RNA-RNA),rpS(RNA-蛋白质),原核生物mRNA在核蛋白体小亚基上的准确定位和结合涉及两种机制：,在各种mRNA起始AUG上游约813核苷酸部位，存在一段由49个核苷酸组成的一致序列，富含嘌呤碱基，如-AGGAGG-，称为Shine-Dalgarno序列(S-D序列)，又称核蛋白体结合位点(ribosomal binding site, RBS)。,S-D序列,小亚基中的16S-rRNA 3-端有一富含嘧啶碱基的短序列，如-UCCUCC-，通过与S-D序列碱基互补而使mRNA与小亚基结合。,3. 起始氨基酰tRNA( fMet-tRNAimet )结合到P位,起始 fMet-tRNAimet以及IF2-GTP一起，识别结合对应小亚基P位的mRNA的起始密码AUG。,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,4.核蛋白体大亚基结合，起始复合物形成,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,GDP,Pi,起始复合物形成过程,（a）起始复合物的装配过程；（b）rRNA识别mRNA的核糖体结合位点，保证翻译起始在起始密码子处,（二）真核生物翻译过程,包括：1）核蛋白体大小亚基分离； 2）起始氨基酰-tRNA结合； 3）mRNA在核蛋白体小亚基就位； 4）核蛋白体大亚基结合。,（一）翻译起始复合体的过程,真核生物翻译起始复合体形成过程,帽子结合蛋白复合体,真核生物翻译起始复合物的装配,真核生物中各种起始因子的生物功能,翻译起始复合物形成后，核糖体从mRNA的5端向3端移动，依据密码子顺序，从N端开始向C端合成多肽链。,二、在核糖体上重复进行的三步反应延长肽链,肽链延长在核蛋白体上连续循环式进行，又称为核蛋白体循环（ribosomal cycle）。每次循环增加一个氨基酸。该循环包括三步反应：,进位(entrance)成肽(peptide bond formation )转位(translocation),与多肽链合成的延伸过程有关的蛋白因子称为延长因子（elongation factor，EF）。原核生物中存在3种延长因子（EFTU，EFTS，EFG）。EF的作用主要促使氨基酰tRNA进入核蛋白的，并可促进移位过程。,延长因子（EF）,1. 进位（entrance）：,又称注册(registration)，是指一个氨基酰-tRNA按照mRNA模板的指令进入并结合到核蛋白体A位的过程。,延长因子EF-T催化进位（原核生物）,目 录,EF-Tu:促进氨基酰-tRNA进入A位。,EF-Ts:调节亚基,Tu,Ts,GTP,GDP,Tu,Ts,GTP,目 录,2.成肽,成肽是在转肽酶(peptidase)的催化下，核蛋白体P位上起始氨基酰-tRNA的N-甲酰甲硫氨酰基或肽酰-tRNA的肽酰基转移到A位并与A位上氨基酰-tRNA的-氨基结合形成肽键的过程。,转肽酶(transpeptidase)催化的肽键形成过程。,在A位上成肽,3 转位（translocation）,延长因子EF-G有转位酶( translocase )活性，可结合并水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3侧移动相当于一个密码的距离，同时使肽酰基tRNA从A位移到P位。此步骤需GTP和Mg2+参与。,转位反应过程,fMet,fMet,成肽转位下一轮进位,核蛋白体循环的反应过程,真核生物肽链延长过程,多肽链合成的延长因子,EF-T,真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。,真核生物延长过程,多肽链合成时，需ATP、GTP作为供能物质，并需Mg2+、K+参与。氨基酸活化时需消耗2分子高能磷酸键，肽键形成时又消耗2分子高能磷酸键，故缩合一分子氨基酸残基至少需消耗4分子高能磷酸键。,供能物质和无机离子,当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止。,三、终止密码子和释放因子导致肽链合成停止,终止阶段需要释放因子RF-1、 RF-2和 RF-3参与。,RF-3可结合核蛋白体其他部位，有GTP酶活性，能介导RF-1、RF-2与核蛋白体的相互作用。,释放因子的功能,识别终止密码子,RF-1特异识别UAA、UAG； RF-2特异识别UAA、UGA。,诱导转肽酶转变为酯酶活性,催化新生肽链与结合在P位的tRNA之间的酯键水解，使肽链从核蛋白体上释放。,原核肽链合成终止过程,1识别： RF识别终止密码,2水解：RF使转肽酶变为酯酶,3. 脱离：,多肽链合成终止演示,RF,真核生物肽链合成终止,与原核生物相似，但真核生物只有一个释放因子：eRF ，识别所有的终止密码，完成所有释放因子的功能。,原核生物与真核生物肽链合成过程的主要差别,多聚核糖体(polysome),目 录,不论真核、原核细胞1条mRNA模板链都可附着10100个核糖体，依次结合起始密码并沿53方向读码移动，同时进行肽链合成，这种mRNA和多个核蛋白体聚合物称为多聚核糖体（polysome）。,电镜下的多聚核蛋白体现象,目 录,第四节 肽链合成后加工和靶向输送,Section 4 Posttranslational Processing & Transportation of Protein,1.熟悉分子伴侣的概念、种类和功能。2了解蛋白质合成后加工和输送。3了解蛋白质生物合成的干扰和抑制。,目的要求,从核蛋白体释放出的新生多肽链不具备蛋白质生物活性，必需经过不同的翻译后复杂加工过程才转变为天然构象的功能蛋白。主要包括：多肽链折叠为天然的三维结构肽链；一级结构的修饰；高级结构修饰。,蛋白质合成后被定向输送到其发挥作用的靶位点的过程称为蛋白质的靶向输送(protein targeting)。,新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成，新生肽链N端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。一般认为，多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋白质折叠的信息，即一级结构是空间构象的基础。细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶、蛋白辅助。,一、多肽链折叠为功能构象需要的分子伴侣,几种有促进蛋白折叠功能的大分子,分子伴侣 (molecular chaperon) 蛋白二硫键异构酶 (protein disulfide isomerase, PDI)肽-脯氨酰顺反异构酶 (peptide prolyl cis-trans isomerase, PPI),1. 分子伴侣：,分子伴侣是细胞内一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。包括： 热休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和GreE族 伴侣蛋白(chaperonins) GroEL和GroES家族,分子伴侣的功能,封闭待折叠蛋白质的暴露的疏水区段；创建一个隔离的环境，可以使蛋白质的折叠互不干扰；促进蛋白质折叠和去聚集；遇到应激刺激，使已折叠的蛋白质去折叠。,(1) 热激蛋白(heat shock protein, HSP),热休克蛋白属于应激反应性蛋白质，高温应激可诱导该蛋白质合成。热休克蛋白可促进需要折叠的多肽折叠为有天然空间构象的蛋白质。 热休克蛋白包括HSP70、HSP40和GrpE三族。,大肠杆菌的HSP70 (DnaK),它有两个主要功能域：一个是存在于N-端的高度保守的ATP酶结构域，能结合和水解ATP；另一个是存在于C-端的多肽链结合结构域。蛋白质的折叠需要这两个结构域的相互作用。,大肠杆菌的HSP40 (Dna J)可激活Dna K中的ATP酶，生成稳定的Dna J -Dna K-ADP-被折叠蛋白质复合物，以利于Dna K发挥分子伴侣作用。在ATP存在的情况下，Dna J和Dna K的相互作用能抑制蛋白质的聚集。Grp E，核苷酸交换因子，与Dna K的ATP酶结构域结合，使Dna K的构象发生改变、ADP从复合物中释放出来并由ATP代替ADP，从而控制Dna K的ATP酶活性。,在蛋白质的折叠过程中，HSP70还需2个辅助因子HSP40和Grp E。,大肠杆菌中的HSP70 反应循环,（HSP40）,（HSP70）,Dna J -Dna K-ADP-被折叠蛋白质复合物,2 伴侣蛋白(chaperonin),伴侣蛋白是分子伴侣的另一家族，如大肠杆菌的Gro EL和Gro ES（真核细胞中同源物为HSP60和HSP10）等家族。其主要作用是为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,当待折叠肽链进入Gro EL的桶状空腔后，Gro ES可作为“盖子”瞬时封闭Gro EL空腔出口。封闭后的桶状空腔提供了能完成该肽链折叠的微环境。,Gro EL-Gro ES复合物,Gro EL-Gro ES反应循环,2. 蛋白二硫键异构酶：,多肽链内或肽链之间二硫键的正确形成对稳定分泌蛋白、膜蛋白等的天然构象十分重要，这一过程主要在细胞内质网进行。 二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。,3. 肽-脯氨酰顺反异构酶：,多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象明显差别。肽酰-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。,二、肽链的肽键水解生成活性蛋白质或功能肽,（一）合成后肽链的末端被水解加工,新生肽链的N端的甲硫氨酸残基，在肽链离开核糖体后，大部分即由特异的蛋白水解酶切除。,（一）肽链N端的修饰（二）个别氨基酸的修饰（三）多肽链的水解修饰,二、一级结构的加工修饰,N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸残基，必须在多肽链折迭成一定的空间结构之前被切除。, 去甲酰化：, 去蛋氨酰基：,（一）N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除,由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。,（二）氨基酸的共价修饰,由专一性的酶催化进行修饰，包括羟基化、磷酸化、甲酰化等。,（三）多肽链的水解修饰,鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰,256个氨基酸,39肽,91肽,三、肽链中氨基酸残基的化学修饰增加蛋白质功能多样性,三、空间结构的修饰,（一）亚基的聚合,具有四级结构的蛋白质由两条以上的多肽链通过非共价键聚合形成寡聚体。,（二）辅基的连接,结合蛋白合成后需要结合相应的辅基才能成为具有天然活性的蛋白质。,四、亚基聚合形成功能性蛋白质复合物,结合蛋白质合成后都需要结合相应辅基，才能成为具有功能活性的天然蛋白质。,具有四级结构的蛋白质由两条以上的肽链通过非共价键聚合，形成寡聚体(oligomer)。,通过非共价键亚基聚合形成具有四级结构的蛋白质,辅基连接后形成完整的结合蛋白质,蛋白质的靶向输送(protein ta