实验 硫酸铵分级沉淀分离苯丙氨酸解氨酶

实验 一 硫酸铵分级沉淀分离苯丙氨酸解氨酶 8学时 一 实验背景 了解硫酸铵沉淀蛋白质的原理 掌握分级沉淀分离酶的基本操作和方法 二 实验原理 盐析 在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐 如硫酸铵 硫酸钠等 使蛋白质沉淀析出称为盐析 因为中性盐在水中解离时 能夺走蛋白质胶粒表面的水分子 破坏水膜结构 同时中性盐解离后形成的带电离子能中和蛋白质表面的电荷 这两种作用使溶液中蛋白质沉淀析出 分级沉淀 不同盐浓度下各种蛋白质的溶解度是不同的 因此调节溶液的盐浓度可使各种蛋白质先后沉淀出来 或者使需要的酶与其它杂质蛋白分开 达到提纯目的 这就是分级沉淀法 硫酸铵沉淀一般在蛋白纯化的步骤中前期用 它简便且重复性好 但纯化倍数不高 分级沉淀中需加的固体硫酸铵或饱和硫酸铵溶液的量 可从硫酸铵饱和度量表中查得 苯丙氨酸解氨酶 L phenylalanine ammonialyase 简称PAL 是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶 与一些重要的次生物质如木质素 异黄酮类植保素 黄酮类色素等合成密切有关 在植物的正常生长发育和抵御病菌侵害的过程中起重要作用 PAL催化L 苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨 产物反式肉桂酸在波长290nm处有最大吸收值 在反应系统中如果酶的加入量适当 反式肉桂酸的生成速率即A290升高的速率可在几小时内保持不变 因此 可通过测定A290升高的速率来测定PAL的活力 规定1小时内A290增加0 01为PAL的一个活力单位 三 实验试剂 0 1mol L硼酸 硼砂缓冲液 PH8 7 酶提取液 0 1mol L硼酸 硼砂缓冲液 内含1mmol LEDTA 20mmol L 巯基乙醇 取100ml0 1mol L硼酸 硼砂缓冲液 PH8 7 加入0 037克EDTA钠盐 混匀 临用前再加入0 137ml 巯基乙醇 混匀 0 6mmol LL Phe溶液 称取L Phe9 912毫克溶于100ml蒸馏水中 6NHCl溶液固体 NH4 2SO4 四 实验步骤 1 酶液提取 1 取小麦幼苗 发芽5 6天 2克 用剪刀剪成小段后 立即放入有10ml酶提取液的研钵中 于冰浴上研磨匀浆 匀浆结束前 再加入10ml酶提取液研磨混匀 2 将已匀浆的酶液 用三层纱布过滤 挤干 滤液转入离心管 平衡后 于10 000g下冷冻离心30min 3 取离心后的上清液 酶粗提液 量出其体积V1 放置冰浴中备用 实验步骤 2 硫酸铵分级沉淀酶蛋白 1 从酶粗提液中吸取出0 5ml 以作后面活力测定等用 根据实际体积和硫酸铵饱和度用量表 算出达到40 饱和度实际应加入酶液中的硫酸铵量 并称取该量的硫酸铵 2 将酶液到入烧杯内 烧杯置于冰浴中 然后在边缓慢搅拌下缓慢加入称好的固体硫酸铵 不能有大颗粒 放在研钵中研碎 待全部硫酸铵加入后 再缓慢搅拌20min 实验步骤 2 硫酸铵分级沉淀酶蛋白 3 将上述溶液到入离心管 3 000g下冷冻离心30min 倒上清液于烧杯内 保留沉淀 记为沉淀1 4 根据硫酸铵饱和度用量表中 查出从40 到75 饱和度所需硫酸铵用量 算出并称取实际应加的硫酸铵量 5 按上述 2 3 步同法处理 离心后 倒出上清液 保留沉淀 记为沉淀2 实验步骤 3 酶活力测定 1 将沉淀 1 和沉淀 2 分别溶于1ml酶抽提液中 待沉淀全部溶解后 量出其体积V2 V3 记为沉淀液 1 和 2 2 分别从沉淀液 1 和 2 中吸出0 2ml加入另外二个试管内 然后用酶提取液分别将其稀释成1ml 记为稀释沉淀液 1 和 2 3 取试管7支 按下列编号并加入各试剂 实验步骤 3 酶活力测定 4 以上试管放入恒温水浴 40 中保温60min后 立即加入0 2ml6NHCl 混匀 终止反应 5 于波长290nm处 以0号管溶液调零 分别记录测得的各管A290值 酶活单位定义 规定1小时内A290增加0 01为PAL的一个活力单位 1 PAL总活力计算 分别算出每ml酶粗提液和沉淀液 1 和 2 中