琼脂糖凝胶电泳

杨君霞2012 11 23 琼脂糖凝胶电泳 电泳技术简介 什么是电泳技术 电泳法 是指带电荷的供试品 蛋白质 核苷酸等 在惰性支持介质 如纸 醋酸纤维素 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶等 中 于电场的作用下 向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动 使组分分离成狭窄的区带 用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法 电泳技术的分类 电泳法可分为自由电泳 无支持体 及区带电泳 有支持体 两大类 自由电泳包括Tise leas式微量电泳 显微电泳 等电聚焦电泳 等速电泳及密度梯度电泳 区带电泳则包括滤纸电泳 常压及高压 薄层电泳 薄膜及薄板 醋酸纤维薄膜电泳 非凝胶性支持体区带电泳 支持体有 淀粉 纤维素粉 玻璃粉 硅胶等 凝胶支持体区带电泳 琼脂 琼脂糖 淀粉胶 聚丙烯酰胺凝胶 等 凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 200bp 50kb 5bp 500bp 琼脂糖凝胶电泳 实验原理 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖 其结构单元是D 半乳糖和3 6 脱水 L 半乳糖 许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束 构成大网孔型凝胶 其本身不带有电荷 因此该凝胶适合于免疫复合物 核酸与核蛋白的分离 鉴定及纯化 琼脂糖凝胶电泳 实验原理 与蛋白质分子相似 核酸分子也是两性解离分子 在pH3 5时 碱基上的氨基酸基团解离 而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离 整个核酸分子带正电荷 在电场中向负极泳动 在pH8 0 8 3时 碱基几乎不解离 磷酸根全部解离 核酸分子带负电荷 向正极移动 不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同 在自由泳动时各核酸分子的迁移率区别很小 难以分开 所以采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物 发挥分子筛的功能 使得大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异 达到分离目的 在loadingbuffer的作用下 可观察电泳的进行情况 琼脂糖与琼脂的区别 琼脂是由琼脂糖 agarose 和琼脂果胶 agaropectin 组成的 琼脂糖的结构单元是D 半乳糖和3 6 脱水 L 半乳糖 琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物 它们的结构相似 但琼脂果胶带硫酸根和羧基组分 凝胶能力差 在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除 否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团 就会造成电内渗 电内渗对质点的移动产生影响 质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低 通常在0 2 以下 电内渗比较小 通常在0 13 以下 简言之 琼脂糖是从琼脂中精细提取的 有自身独特的性质 所以琼脂糖要比琼脂贵得多 不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围 琼脂糖凝胶电泳特点 聚丙烯酰胺凝胶电泳 操作步骤 凝胶制备 样品制备 点样 电泳 照相 琼脂糖凝胶的制备 1 根据电泳需要 配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液注意 用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的 电泳缓冲液 指在进行电泳时所使用的缓冲溶液 用以稳定体系酸碱度 常见的核酸电泳缓冲液 Tris 乙酸盐缓冲液 TAE Tris 硼酸盐缓冲液 TBE Tris 磷酸盐缓冲液 TPE 琼脂糖凝胶的制备 电泳缓冲液作用维持合适的pH电泳时正极与负极都会发生电解反应 正极发生的是氧化反应 负极发生的是还原反应 长时间的电泳将使正极变酸 负极变碱 一个好的缓冲体系应有较强的缓冲能力 使溶液两极的pH基本保持不变 使溶液具有一定的导电性 以利于DNA分子的迁移例如 一般电泳溶液中应含有0 01 0 04mol L的钠离子 钠离子的浓度太低时电泳速度变慢 太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至融化 缓冲液中的EDTA 加入浓度为1 2mmol L 螯合Mg2 等离子 防止电泳时激活DNA酶 还可防止镁离子与核酸生成沉淀 琼脂糖凝胶的制备 电泳缓冲液特点TAE是使用最广泛的缓冲体系 特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量 TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量 且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10 电泳大于13kb的片段时用TAE将取得更好的分离效果 回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳TAE的缺点是缓冲容量小 长时间电泳 如过夜 不可选用 除非有循环装置使两级的缓冲液得到交换 琼脂糖凝胶的制备 电泳缓冲液特点TBE的特点是缓冲能力强 长时间电泳时可选用 当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好 TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用 并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低 所以不宜在回收电泳中使用 TPE缓冲能力也较强 但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出 所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用 TBE可以使用10次左右 而TAE用2 3次就要更换 电泳缓冲液多次使用后 离子强度降低 pH值上升 缓冲性能下降 可能使DNA条带模糊或不规则DNA带迁移 常用电泳缓冲液的配制 琼脂糖凝胶的制备 2 根据制胶量及凝胶浓度 在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中 加入准确称量的琼脂糖粉 注意 总液体量不宜超过三角锥瓶的50 容量 琼脂糖凝胶的制备 3 在微波炉中加热溶解琼脂糖注意 必须保证琼脂糖充分完全溶解 否则 会造成电泳图像模糊不清 加热时如胶液剧烈沸腾发泡 停止加热 微波炉中加热时间不宜过长 琼脂糖凝胶的制备 4 使溶液冷却至60 左右 如需要可在此时加入溴化乙锭 EB 溶液使其终浓度为0 5ug ml 并充分混匀 不提倡使用 注意 溴化乙锭是一种致癌物质 使用含有溴化乙锭的溶液时 请戴用手套 溴化乙锭在可见光下会分解 冷却过程中可准备好胶槽 也可开始时准备好 琼脂糖凝胶的制备 5 将琼脂糖溶液倒入制胶模中 然后在适当位置处插上梳子 凝胶厚度一般在3 5mm之间 注意 不要产生气泡 溶液温度太高 60 会使得水分过分蒸发 改变凝胶离子浓度 影响电泳效果 一般情况下 0 5cm宽的梳子可加0 5ug的DNA量 加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定 过多的量会造成加样孔超载 从而导致拖尾和弥散 对于较大的DNA此现象更明显 琼脂糖凝胶的制备 6 在室温下使胶凝固 大约30分钟 然后放置于电泳槽中进行电泳 注意 凝胶不立即使用时 用保鲜膜将凝胶包好在4 下保存 或者放在制胶的缓冲液中 一般可保存2 5天 样品制备 根据上样缓冲液的浓度加样如6 loadingbuffer 则1 lloadingbuffer 5 lDNAsample 类推 LoadingBuffer 上样缓冲液 含有的指示剂溴酚蓝和二甲苯氰FF起到指示的作用 显示电泳的进程溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的2 2倍 这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无关在0 5 TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率约与长约300bp的线性双链DNA相同 而二甲苯氰FF约与长4kb的DNA相同在0 5 1 4 浓度的琼脂糖凝胶中基本不会变化含有的甘油可加大样品密度 使其大于TAE的浓度而沉降到点样孔中 防止样品飘出点样孔另外 有的Buffer是加有SDS的 一般都会写明SDS主要是使聚合酶变性 因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率 点样 用移液器将将样品加到样品孔中 注意加DNAMarker 电泳 接通电源 红色为正极 黑色为负极 设定稳压为75V 电流一般为50mA DNA往正极移动 1 5V cm 照相 根据指示剂移动位置决定终止电泳 将电压调到零 关机 再取出凝胶 紫外灯下观察 照相 照相 实验结束后 把凝胶未使用的部