5第四章微生物的营养与培养基6节

第四章微生物的营养和培养基 2 微生物细胞化学组成成分析表明 与其他高等动植物细胞一样 细胞也是主要元素碳 氢 氧 氮 磷 硫 这六种元素占细菌细胞干重的97 和少量元素铁 锰 锌等构成 微生物细胞中这些元素主要以蛋白质 糖 脂 核酸 维生素及它们的降解产物 代谢产物等有机物质 水和无机盐等无机物质的形式存在 水是细胞中的一种主要成分 一般可占细胞总重的70 以上 3 微生物细胞的化学组成 4 微生物和动物 植物营养要素的比较 微生物 动物 植物之间存在 营养上的统一性 5 组成微生物细胞的各类化学元素的比例常因微生物种类的不同而不同 Eg 细菌 酵母菌和真菌的碳 氢 氧 氮 磷 硫六种元素的含量就有差别 硫细菌 sulfurbacteria 铁细菌 ironbacteria 和海洋细菌 marinebacteria 相对于其他细菌则含有较多的硫 铁和钠 氯等元素 硅藻 Diatom 需要硅酸来构建富含 SiO2 n的细胞壁 6 营养物质是微生物生存的物质基础 而营养是微生物维持和延续其生命形式的一种生理过程 营养物质 nutrient 能够满足机体生长 繁殖和完成各种生理活动所需要的物质 营养 nutrition 微生物获得和利用营养物质的过程 7 微生物的营养要素 六要素 碳源 氮源 能源 生长因子 无机盐和水 营养物质按照它们在机体中的生理作用不同 可以将它们区分成六大类 第一节微生物的营养六要素 微生物需要吃什么 8 碳源物质的功能 1 碳素化合物是构成机体中有机物分子的骨架2 碳素化合物是大多数异养微生物的能源3 构成微生物代谢产物的分子骨架 1 碳源 carbonsource 在微生物生长过程中能为微生物提供碳素来源的物质 9 微生物的碳源谱 微生物利用 糖类 有机酸类 醇类 脂类 10 单糖 双糖和多糖己糖 戊糖葡萄糖 果糖 甘露糖 半乳糖淀粉 纤维素或几丁质等纯多糖纯多糖 琼脂等杂多糖 葡萄糖可作为大多数微生物的碳源 1 糖 11 2 酚 氰化物等有毒物质 对人类有毒的物质Eg 酚 氰化物等 某些微生物Eg 诺卡氏菌和一些霉菌等 美味佳肴 微生物清除三废 12 3 CO2 最廉价的 用之不尽的碳源 是自养微生物唯一或主要的碳源 Eg 生长在动物血液 组织和肠道中的致病细菌 沙门氏菌 李斯特菌等 13 4 纤维素 纤维素是由葡萄糖以 1 4糖苷链组成的 在自然界中资源丰富 但大多数动物和人不能直接利用 而某些微生物可用其作为碳源来生产发酵产品 5 烃类 烃类化合物也能被微生物用作碳源 且微生物氧化烃类的许多中间产物和最终产物均是重要的工业原料 清除石油污染 14 目前在微生物工业发酵中所利用的碳源物质主要是 单糖 淀粉 麸皮 米糠等 对于异养微生物来说 碳源是兼有能源功能的营养物 这种碳源称为双功能营养物 微生物利用的碳源物质主要有糖类 有机酸 醇 脂类 烃 CO2及碳酸盐等 微生物不同 利用上述含碳化合物的能力不同 如假单胞菌属中的某些种可以利用90种以上的不同类型的碳源物质 而某些甲基营养型细菌只能利用甲醇或甲烷等一碳化合物进行生长 15 氮源 凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源 2 氮源 nitrogensource 氮源物质的主要作用 1 提供合成细胞中含氮物 如蛋白质 核酸 以及含氮代谢物等的原料 2 少数细菌可以铵盐 硝酸盐等氮源为能源 16 微生物的氮源谱 最常用的有机氮源 N C H O X类型 17 实验室常用的氮源有碳酸铵 硝酸盐 硫酸铵 尿素 蛋白胨 牛肉膏 酵母膏等 生产上常用的氮源硝酸盐 铵盐 尿素 氨以及蛋白含量较高的鱼粉 蚕蛹粉 黄豆饼粉 花生饼份 玉米浆等 18 速效氮源无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接迅速的被菌体吸收利用 这种氮源 通常是有利于机体的生长 用于发酵前期 迟效氮源蛋白氮必须通过水解之后降解成胨 肽 氨基酸等才能被机体利用 这样的氮源为迟效氮源 有利于代谢产物的形成 用于发酵后期 19 分解利用阳离子化合物如 以 NH4 2SO4作N源 会过剩SO42 而使pH下降 生理酸性盐 微生物对某盐阳离子吸收的量大于阴离子时 造成溶液pH值下降 这种盐成为 分解利用阴离子化合物如 NaNO3和KNO3 会过剩Na 或K 而使pH上升 生理碱性盐 微生物对某盐阴离子吸收量大于阳离子时 造成溶液pH值上升 这种盐成为 20 21 氨基酸自养型生物 能利用尿素 铵盐 硝酸盐甚至氮气等简单氮源来自行合成所要的一切氨基酸的生物 常用的蛋白质类氮源包括蛋白胨 鱼粉 蚕蛹 黄豆饼粉 玉米浆 牛肉浸膏 酵母浸膏等 按氮源的不同生物可分为 氨基酸异养型生物 需要从外界吸收现成的氨基酸作为氮源的微生物多数微生物可以利用无机含氮化合物作为氮源 也可以利用有机含氮化合物作为氮源 22 3 能源 energysource 能源 能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能 23 化能自养微生物的能源物质都是一些还原态的无机物质 如 NH4 NO2 S H2S H2 Fe2 等 能利用这些物质作为能源的全部是细菌 硝酸细菌 亚硝酸菌 硫化细菌 硫细菌 铁细菌 硫细菌 氢细菌和铁细菌等 这些无机养料常常是双功能的 为双功能营养物 如 NH4 既是硝酸细菌的能源 又是它的氮源 氨基酸类有三种功能作用 能源 碳源 氮源 为三功能营养物辐射能是单功能的 只为光能微生物提供能源 为单功能营养物 24 4 生长因子 growthfactor 生长因子 一类对微生物正常代谢必不可少且又不能从简单的碳源 氮源自行合成的 所需极微量的有机物 微生物生长因子需要量 ml 1 III型肺炎链球菌 Streptococcuspneumoniae 胆碱6ug金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus 硫胺素0 5ng白喉棒杆菌 Cornebacteriumdiphtherriae B 丙氨酸1 5ug破伤风梭状芽孢杆菌 Clostridiumtetani 尿嘧啶0 4ug肠膜状串珠菌 Leuconostocmesenteroides 吡哆醛0 025ug 25 广义的生长因子包括 氨基酸 嘌呤 嘧啶碱及其衍生物 甾醇一些脂肪酸等狭义的生长因子 维生素生长因子的功能 提供微生物细胞重要化学物质 蛋白质 脂质 核酸 辅因子的组分和参与代谢 26 a 维生素 维生素作为一些酶的辅酶 Eg 维生素B6 吡哆醛 磷酸吡哆醛是一些转氨酶和氨基酸脱羧酶的辅酶 微生物对维生素的需要量一般是1 5mg ml 27 b 氨基酸 氨基酸是蛋白质合成的基本单位 在大多数情况下可被微生物吸收利用 少数情况下微生物虽需要氨基酸作为生长因子 但氨基酸不能透过细胞膜 而能够吸收利用小肽 在培养基中一种氨基酸的含量过高 会抑制细胞对其他氨基酸的摄取 此现象称氨基酸不平衡 微生物对氨基酸的需要量一般是20mg ml 28 c 碱基 碱基是核酸 核苷酸及一些辅酶的组分 一般情况下 核苷酸不能用作生长因子 因为它不能透过细胞膜 微生物对碱基的需要量一般是10 20mg ml 29 d 其他生长因子 有些微生物的生长需要一些很特殊的物质 也称生长因子 Eg 流感嗜血杆菌一定要在含红细胞的培养基上生长 因为它需要卟啉环作生长因子 厌氧条件下生长的啤酒酵母需要甾醇作为生长因子 30 在配制微生物培养基时 一般可用生长因子含量丰富的天然物质作原料以保证微生物对它们的需要 Eg 如果配制的是天然培养基 则可加入酵母膏 yeastextract 玉米浆 cornsteepliquor 一种浸制玉米以制取淀粉后产生的副产品 肝浸液 liverinfusion 麦芽汁 maltextract 其他新鲜的动 植物的汁液 如果配制的是组合培养基 则可加入复合维生素溶液 31 生长因子自养型微生物 不需要从外加吸收任何生长因子 真菌 放线菌和不少细菌属于此类生长因子异养型微生物 需要从外加吸收任何生长因子才能维持正常生长 乳酸菌 动物致病菌 支原体和原生动物等从外界吸收任何生长因子生长因子过量合成的微生物 少数微生物在其代谢活动中能合成并大量分泌某些维生素等生长因子 可以作为有关维生素的生产菌种 32 5 无机盐 mineralsalts 微量元素 通常需要量在10 6 10 8mol L锌 锰 氯 钼 硒 钴 铜 钨 镍 硼等 根据微生物对矿质元素需要量大小可以把它分成 大量元素 浓度在10 3 10 4mol L的元素Na K Mg Ca S P等 无机盐 为微生物细胞生长提供碳 氮源以外的多种重要元素 包括大量元素和微量元素 的物质 多以无机盐的形式供给 33 一般微生物生长所需要的无机盐有 硫酸盐 磷酸盐 氯化物以及含有钠 钾 镁 铁等金属元素的化合物 34 35 36 6 水 water 生理功能主要有 起到溶剂与运输介质的作用 参与细胞内一系列化学反应 维持蛋白质 核酸等生物大分子稳定的天然构象 通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构 热的良好导体 存在状态 游离态 溶剂 和结合态 结构组成 37 第二节微生物的营养营养类型 38 根据碳源 能源及电子供体性质的不同 可将微生物分为 光能无机自养型 photo litho autotrophy 光能有机异养型 photo organo heterotrophy 化能无机自养型 chemo litho autotrophy 化能有机自养型 chemo organo heterotrophy 39 1 光能无机自养型 光能自养型 碳源 CO2能源 光能氢供体 H2O和H2S Na2SO3等无机硫化物CO2 H2O CH2O O22CO2 H2S 2H2O 2 CH2O H2SO4CO2 2H2S CH2O H2O 2S举例 蓝细菌 藻类 紫硫细菌 绿硫细菌 40 2 光能有机异养型 光能异养型 碳源 CO2及简单有机物能源 光能氢供体 有机物 举例 红螺菌属 Rhodospirillum 41 3 化能无机自养型 化能自养型 碳源 CO2能源 还原态无机物氢供体 无机物2NH3 2O2 2HNO2 4H 能量CO2 4H 能量 CH2O H2O举例 氢细菌 硫细菌 硝化细菌 42 4 化能有机异养型 化能异养型 碳源 有机物能源 有机物氢供体 有机物举例 自然界中绝大部分的微生物 几乎所有致病微生物均为 型微生物 几乎所有致病微生物均为化能有机异养型微生物 43 可利用无生命的有机物 如动植物尸体和残体 作为碳源 腐生型 metatrophy 寄生型 paratrophy 在腐生型和寄生型之间还存在中间类型 兼性腐生型 facultivemetatrophy 兼性寄生型 facultiveparatrophy 寄生在活的寄主机体内吸取营养物质 离开寄主就不能生存 44 不同营养类型之间的界限并非绝对 异养型微生物并非绝对不能利用CO2 自养型微生物也并非不能利用有机物进行生长 有些微生物在不同生长条件下生长时 其营养类型也会发生改变 例如紫色非硫细菌 purplenonsulphurbacteria 没有有机物时 同化CO2 为自养型微生物 有机物存在时 利用有机物进行生长 为异养型微生物 光照和厌氧条件下 利用光能生长 为光能营养型微生物 黑暗与好氧条件下 依靠有机物氧化产生的化学能生长 为化能营养型微生物 微生物营养类型的可变性无疑有利于提高其对环境条件变化的适应能力 45 某些菌株发生突变 自然突变或人工诱变 后 失去合成某种 或某些 对该菌株生长必不可少的物质 通常是生长因子如氨基酸 维生素 的能力 必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖 这种突变型菌株称为营养缺陷型 auxotroph 相应的从自然界分离的能在基本培养基上生长的称为野生型 wildtype 注 营养缺陷型菌株经常用来进行微生物遗传学方面的研究 5 营养缺陷型 auxotroph 46 第三节营养物质进入细胞的方式 营养物质能否进入细胞取决于三个方面的因素 营养物质本身的性质 相对分子量 质量 溶解性 电负性等 微生物所处的环境 温度 PH等 微生物细胞的透过屏障 原生质膜 细胞壁 荚膜等 47 根据物质运输过程的特点 将物质的运输方式分为 48 1 单纯扩散 原生质膜是一种半透性膜 营养物质通过原生质膜上的小孔 由高浓度的胞外环境向低浓度的胞内进行扩散 特点 物质在扩散过程中没有发生任何反应 不消耗能量 不能逆浓度运输 运输速率与膜内外物质的浓度差成正比 49 水是唯一可以通过扩散自由通过原生质膜的分子 脂肪酸 乙醇 甘油 一些气体 O2 CO2 及某些氨基酸在一定程度上也可通过自由扩散进出细胞 50 2 促进扩散 特点 不消耗能量 参与运输的物质本身的分子结构不发生变化 不能进行逆浓度运输 运输速率与膜内外物质的浓度差成正比 需要载体参与 51 通过促进扩散进入细胞的营养物质主要有氨基酸 单糖 维生素及无机盐等 一般微生物通过专一的载体蛋白运输相应的物质 但也有微生物对同一物质的运输由一种以上的载体蛋白来完成 胞外细胞膜胞内 52 53 3 主动运输 它的一个重要特点是物质运输过程中需要消耗能量和载体 而且可以进行逆浓度运输 是广泛存在于微生物中的一种主要的物质运输方式 54 基团转位又称为磷酸烯醇式丙酮酸 磷酸糖转移酶运输系统 PTS PTS通常由五种蛋白质组成 包括酶I 酶II 包括a b c三种亚基 和一种低相对分子量的热稳定蛋白质 HPr 4 基团移位 基团移位是另一种类型的主动运输 它与主动运输方式的不同之处在于它有一个复杂的运输系统来完成物质的运输 而物质在运输过程中发生化学变化 55 基团转移主要存在于厌氧型和兼性厌氧型细胞中 主要用于糖的运输 脂肪酸 核苷 碱基等也可以通过这种方式运输 运送某一具体糖至少有4种蛋白参与 消耗一个ATP 两步进行 1 热稳载体蛋白的激活 2 糖分子被磷酸激活 磷酸糖 细胞质中 56 57 比较项目单纯扩散促进扩散主动运输基团移位载体蛋白无有有有溶质运送方向由浓至稀由浓至稀由稀至浓由稀至浓能量消耗不需要需要需要需要运送前后溶质分子不变不变不变改变运送速度慢快快快平衡时内外浓度内外相等内外相等内部高内部高运送分子无特异性特异性特异性特异性载体饱和效应无有有有与溶质类似物无竞争性有竞争性有竞争性有竞争性运送抑制剂无有有有运送对象举例水 O2糖 SO42 氨基酸 乳糖葡萄糖 嘌呤 四种运送营养方式的比较 58 膜泡运输 membranevesicletransport 胞吞作用胞饮作用 59 第四节培养基 medium 培养基 人工配制的 适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质 培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础 用途 促使微生物生长 积累代谢产物 分离微生物菌种 鉴定微生物种类 微生物细胞计数 菌种保藏 制备微生物制品 任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素 碳源 氮源 无机盐 能源 生长因子 水 任何培养基一旦配成 必须立即进行灭菌处理 常规高压蒸汽灭菌 1 05kg cm2 121 3 15 30分钟 0 56kg cm2 112 6 15 30分钟 60 一 选用和设计培养基的原则和方法 目的明确 营养协调 理化条件适宜 经济节约 61 1 目的明确 根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基 培养化能自养型的氧化硫杆菌的培养基组成为 S10gMgSO4 7H2O0 5g NH4 2SO40 4gFeSO40 01gH2PO44gCaCl20 25gH2O1000ml 培养化能异养的大肠杆菌一种培养基是由下列化学成分组成 葡萄糖5gNH4H2PO41gNaCl5gMgSO4 7H2O0 2gK2HPO41gH2O1000ml 62 常见的培养四大类微生物的培养基 细菌 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5gH2O1000ml 放线菌 高氏1号 淀粉20gK2HPO40 5gNaCl0 5gMgSO4 7H2O0 5gKNO31gFeSO40 01gH2O1000ml 酵母菌 麦芽汁培养基 干麦芽粉加四倍水 在50 60 保温糖化3 4小时 用碘液试验检查至糖化完全为止 调整糖液浓度为10 巴林 煮沸后 沙布过滤 调PH为6 0 霉菌 查氏合成培养基 蔗糖30gNaNO33gK2HPO41gKCl0 5gMgSO4 7H2O0 5gFeSO40 01gH2O1000ml 63 1 分离细菌时 在培养基中加入浓度为50U ml制霉菌素 可以抑制霉菌和酵母菌的生长 2 分离放线菌时 在样品中加入0 05 十二烷基磺酸钠 SDS 不仅可以抑制细菌的生长 还能激活放线菌孢子的萌发 加入氟哌酸 5mg L 制霉菌素 50mg L 青霉素 0 8mg L 也可以有效地抑制细菌和真菌 而不影响放线菌的生长 3 分离霉菌和酵母菌时 在培养基中加入青霉素 链霉素和四环素各30U ml 可以抑制细菌和放线菌生长 4 分离根霉和毛霉时 由于这些微生物的菌丝易蔓延成片 难以得到纯化的菌落 通常在培养基中添加0 1 去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝蔓延 使菌落长得小而紧密 64 2 营养协调 培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好 营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需 浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用 培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累 其中碳氮比 C N 的影响较大 碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值 有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比 例如 在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中 培养基碳氮比为100 2时 菌体量繁殖 谷氨酸积累少 当培养基碳氮比为100 12时 菌体繁殖受到抑制 谷氨酸产量则大量增加 65 66 3 理化条件适宜 pH 渗透压和水活度 氧化还原电位 67 a pH 培养基的pH必须控制在一定的范围内 以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物 通常培养条件 细菌 pH7 0 8 0放线菌 pH7 5 8 5酵母菌 pH3 8 6 0霉菌 pH4 0 5 8 为了维持培养基pH的相对恒定 通常在培养基中加入pH缓冲剂 或在进行工业发酵时补加酸 碱 68 常用pH缓冲剂 69 维持培养基pH值的相对恒定的两种方式 内源调节 在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐 这种通过培养基内在成分所起的调节作用外源调节 按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液 使用磷酸缓冲剂 K2HPO4 Na2HPO4 H2PO4 NaH2PO4采用 备用碱 CaCO3 CaHCO3 NaHCO3采用弱酸盐 柠檬酸盐 乳酸盐等采用NaOH或HCL 70 渗透压等渗溶液适宜微生物生长高渗溶液细胞发生质壁分离低渗溶液细胞吸水膨胀 直至破裂 大多数微生物适合在等渗的环境下生长 而有的菌如金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus 则能在3mol LNaCl的高渗溶液中生长 能在高盐环境 2 8 6 2mol LNaCl 生长的微生物常被称为嗜盐微生物 b 渗透压和水活度 71 微生物对水的需要程度常用环境中的水活度值 wateractivity w 表示 所谓 w就是水的有效浓度 定义 水活度是在一定的温度条件下 溶液的蒸汽压 材料上部蒸气相中水浓度 与纯水的蒸汽压 即纯水上部蒸气相中水浓度 之比 即 w o 表示溶液的蒸汽压 o表示纯水的蒸汽压 在 w为0 60 0 99的环境条件均有微生物生长 但对某种微生物而言 它对 w的要求是一定的 微生物对水的需求有相当的变化程度 即微生物不同 其生长的最适 w亦不同 水活度 72 几类微生物生长最适 w 为了表示微生物生长与水的关系 有时也常用相对湿度 RH 的概念 w 100 RH 通常也用测定蒸气相中相对湿度的方法得知溶液或物质的水活度 73 c 氧化还原电位 氧化还原电位又称氧化还原电势 redoxpotential 是度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标 其单位是V 伏 或mV 毫伏 不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同 好氧性微生物 0 1伏以上时可正常生长 以 0 3 0 4伏为宜 厌氧性微生物 低于 0 1伏条件下生长 兼性厌氧微生物 0 1伏以上时进行好氧呼吸 0 1伏以下时进行发酵 74 培养基是多氧化还原偶联的复杂电化学系统 测出的Eh值仅代表其综合结果 对微生物影响最大的是 分子氧和分子氢的浓度培养基中常用的还原剂 巯基乙酸 抗坏血酸 硫化氢 半胱氨酸 谷胱甘肽 二硫苏糖醇等 75 4 经济节约 以粗代精 以野代家 以废代好 以国代进 以简代繁 以氮代朊 以烃代粮 以纤代糖 76 二 培养基的种类及应用 培养基种类繁多 根据其成分 物理状态和用途可将培养分成多种类型 77 一 根据微生物的种类 二 按培养基的成分 三 按培养基的物理状态 四 按培养的用途 培养基的种类 78 一 根据微生物的种类分类细菌培养基放线菌培养基霉菌培养基酵母培养基 79 二 按培养基的成分1 天然培养基2 合成培养基3 半合成培养基 80 1 天然培养基 81 2 合成培养基 82 3 半合成培养基 83 三 按培养基的物理状态 1 液体培养基2 固体培养基3 半固体培养基4 脱水培养基 84 1 液体培养基 85 液体培养基为什么适于工业生产 液体培养基营养物质分布均匀 与菌体充分接触 有利于微生物更快吸收营养 有利于菌体繁殖 积累产物 因而适于大规模生产 86 2 固体培养基 87 理想的凝固剂应具备以下条件 不被所培养的微生物分解利用 在微生物生长的温度范围内保持固体状态 在培养基中适当增加凝固剂来解决这一问题 凝固剂凝固点温度不能太低 否则将不利于微生物的生长 凝固剂对所培养的微生物无毒害作用 凝固剂在灭菌过程中不会