现代生物技术2章.docx

第二章 DNA重组技术 -基因工程原理DNA重组技术也称基因克隆或者分子克隆，它实际上包括了一系列的实验技术，最终目的是把一个生物体中的遗传信息（DNA）转入另一个生物体。一个典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤（1）克隆重组： 提取供体生物的目的基因(或称外源基因), 酶 解连接到另一DNA分子上(克隆载体),形成一个新的重组DNA分子；（2）转化： 将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化；（3）筛选鉴定：对那些吸DNA的受体细胞进行筛选和鉴定；（4）培养表达对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检验 外源基因是否表达。1、DNA 结构与功能2.1.1 DNA分子组成：核苷酸（1）碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶（2）脱氧核糖（3）磷酸1.2 DNA 一级结构 是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。 DNA链上的脱氧核苷酸通过一个脱氧核苷酸的脱氧核糖3/-OH与相邻脱氧核苷酸5/-P形成 磷酸二酯键聚合而串联成为DNA链 。 Cargaff等科学家在20世纪50年代总结出DNA碱基组成的规律：A=T，G=C，A+C=G+T，A+G=T+C。这一规律提示了A与T，G与C配对的可能性，为Watson 和Crick提出了DNA双螺旋模型奠定了基础。1.3 DNA 二级结构 Watson 和Crick（1953） DNA双螺旋模型 ：（1） DNA分子是上两条互相平行的脱氧核苷酸长链围绕同一中心轴相互缠绕而成；两条链均为右手螺旋。（2） DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替，彼此通过3/,5/-磷酸二酯键连接，排在外侧，构成基本骨架；4种碱基排列在内侧。（3） 双螺旋平均直径2.0nm，两个相邻的碱基对之间的相距高度为0.34nm，两个核苷酸之间的夹角为360 。因此，沿中心轴每螺旋一周有10个脱氧核苷酸，每旋转一周的高度（螺距）为3.4nm。（4） 两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。A只与T配对，G与C配对。（5） 碱基在一条链上的排列顺序不受到任何限制。但是，当一条多核苷酸链的序列被确定之后，即可确定另一条互补链的序列1.4 DNA链的大小（1）一个双链DNA分了的长度通常用互补核苷酸对的数目来表达，也就是人们通常所说的碱基对bp(base pair，bp)。（2）对于大的DNA分子通常用多少千个碱基对来表示，即kb (kilo base pairs，kb)。（3）当双链DNA分子超过几百万个碱基对时，人们就用百万碱基对, 即Mb (mega base pairs，Mb)这个单位来描述它。1.5 DNA 分子的基本功能 携带和传递遗传信息。（1）DNA复制（2）转录（3）翻译 （1）复 制：半保留复制a、复制起点与复制单位、b、单向复制与双向复制、c、滚筒式复制、 d、D环复制（2）几个概念基因：DNA上具有遗传效应的碱基序列，是遗传信息传递、表达、性状分化的依据。结构基因：可以转录、翻译的基因。调节基因：控制结构基因表达的基因。重叠基因：同一段DNA可编码两种或两种以上不同蛋白的基因。跳跃基因：位置可移动的基因。假 基因：结构与基因相似，但不表达。2、基因工程简介 基因工程是按照人们的愿望对携带遗传信息的分子（DNA）进行设计和改造的分子工程，包括基因重组、克隆、表达；其核心是构建重组体DNA的技术，因而基因工程和DNA重组技术有时成为同义词2.1 基因工程的理论与技术基础2.1.1 理论基础1）证明遗传物质是DNA：AVERY细菌转化实验2）DNA双螺旋结构阐明、半保留复制发现 3 ) 遗传信息传递方式、遗传密码破译、密 码通用性发现2.1.2 技术基础 1）限制性内切酶与DNA连接酶纯化分离 2）基因工程载体发明 3）逆转录酶发现2.2 基因工程常用工具酶（1）限制性内切酶（2）甲基化酶（3）连接酶（4）DNA聚合酶（5）反转录酶（6）依赖于DNA的RNA聚合酶（7）T4噬菌体多核苷酸激酶（8）碱性磷酸酶 2.2.1 限制性内切酶II特点（1）多数限制性内切酶II结合并切割DNA序列是一种回文结构；（2）切割后DNA产生5-P突出末端，有些产生3- OH突出末端；些酶切割后产生平末端。（3识别序列可以是4、5、6、8，甚至更多的碱基对 EcoRI是最早发现的一种类型II限制性内切酶，它是从大肠杆菌中分离鉴定出来的。 EcoRI特异地结合在一段6个核苷酸的DNA区域里，在每一条链的鸟嘌呤和腺嘌呤之间切断DNA链(图24)。DNA链经EcoRI对称切割后会产生两个单链末端，每个末端会有4个核苷酸延伸出来，称为粘性末端。2.2.2限制性内切酶II主要用途（1）基因克隆（2）基因测序2.2.3类型II限制性内切酶的命名目前人们已经从各种不同的细菌中分离出了数百种其他的类型II限制性内切酶，这些酶的命名方式都一样，第一个字母采用含有此菌的细菌属名的第一个字母（例如：EcoRI的第一个字母E是大肠杆菌Esherichia coli的第一个字母），后两个字母为种名的前两个字母小写（例如：EcoRI的co是大肠杆菌Esherichia coli的种名的前两个字母co），株系数字通常都省略，罗马数字I用来表示从同一个细菌中分离出的不同的限制性内切酶，R是抗性质粒 。比如HpaI和HpaII就是从同一种细菌中分离出来的第一种和第二种类型II的限制性内切酶。3、基因工程载体分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出来的元件组装而成。根据功能的不同，分为克隆载体和表达载体。（1）克隆载体：以繁殖DNA片段为目的的载体通常称为克隆载体（cloning vector）。（2）表达载体（expression vector）是用来将克隆到的外源性基因在宿主细胞内表达成蛋白质的载体。表达载体又分胞内表达载体和分泌表达载体。根据表达所用的受体细胞不同，可分为原核细胞表达载体和真核细胞表达载体。 （3）穿梭载体（shuttle vector）：有些既含有原核细胞复制起点，又含有真核细胞复制起点，能携带插入DNA序列在不同种类真核或原核宿主细胞中存在和复制的载体称穿梭载体。3.1理想的克隆载体应具备的条件（1）能自我复制，并能带动插入的外源基因一起复制。（2）具有合适的限制性内切酶位点。（3）具有合适的筛选标记基因，如抗药性基因等，容易从宿主细胞中分离纯化出来，便于重组操作。（4）在细胞内拷贝数要多。（5）载体的相对分子质量要小，可以容纳较大的外源DNA插入片段。（6）在细胞内稳定性高，可以保证重组体稳定传代而不易丢失。（7）载体必须安全，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会转入到除受体细胞以外的其它生物细胞，特别是人的细胞。3.2表达载体的必要条件（1） 很强的启动子。（2）很强的终止子。（3）启动子必须是受控制的，只有当被诱导时才能进行转录。（4）所产生的mRNA必须具有翻译起始信号，既AUG和SD序列。（5）具备有复制起点和灵活的酶切位点。3.3常用克隆载体结构与特点 （1）质粒载体（2）噬菌体载体（3）COS质粒载体（4）动物病毒载体（5人工染色体载体3.3.1 质粒1定义 质粒：在细菌中存在于染色体外，能自主复制的双链环状分子。3.3.1.2质粒的特点（1）每个质粒都有一段叫DNA复制起始位点的序列，它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。（2）在一个细菌细胞中, 质粒最多可以占到细菌总DNA的0.15。例：PBR322、PUC193.3.1.3质粒的大小质粒的大小不定，小的不到l kb，大的超过500kb。 3.3.1.4质粒的分类（1）按携带的遗产信息分类F 质 粒：携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息的质粒，即F质粒。R 质 粒：表达对种抗生素的抗性的质粒，即R质粒。降解质粒：携带的是参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因的质粒，即降解质粒。（2）按拷贝数分类高拷贝数质粒：在每个宿主细胞中可以有10100个拷贝的质 粒，称为高拷贝数质粒。低拷贝数质粒：在每个细胞中只有14个拷贝的质粒，为低 拷贝数质粒。 3.3.1.4质粒的分类（3）按宿主范围分类窄宿主范围质粒： 复制起始点较特异，只能在一种特定的宿主细胞中复制的质粒，称为窄宿主范围质粒。广宿主范围质粒：复制起始点不太特异可以在许多种细菌细胞中复制的质粒，称为广宿主范围质粒。 3.3.1.4作为克隆载体的质粒应具备的特点（1）不能太大；（2）拥有克隆外源基因的单一限制性内切酶酶切位点；（3）有一个或多个选择性标记。3.3.2噬菌体 （1）噬菌体 DNA含50kb，其中20kb对整合/切割极为关键（称I/E区）。经过改造成为克隆载体。如在I/E两端各设计一个Bam位点，用15-20kb外源DNA代替I/E。 可克隆20kb左右DNA。（2）p噬菌体 p噬菌体是一种线性DNA，可携带大小为85kb的外源DNA3.3.3 柯氏质粒 COSMID可克隆40kb左右DNA，并能在Ecoli中复制；综合了上述两类载体优点。带有多个单克隆位点RE2(restriction endonuclease，RE) ，两个cose site，一个ori位点和TetR基因；两个cose site之间还有一个RE1位点。 3.3.4 YAC载体（yeast artifical chromosome）YAC载体一种线性DNA，可携带大小为100Mb的外源DNA。容纳最大外源性DNA的载体。关键结构：着丝粒、端粒、自主复制序列 3.3.5 BAC载体BAC载体一种线性DNA，可携带大小为300Mb的外源DNA4、基因重组技术与基因操作4.1获取目的基因的方法（1）基因文库（2）cDNA（3）PCR法（4）化学合成 4.1.1 基因文库法（1）定义基因文库：某一生物体所有DNA随机克隆群。（2）基因文库构建 限制性内切酶酶解总DNA将酶解片段克隆进载体 对外源性重组DNA克隆进行鉴定、分离、培养再培养再鉴定（3）基因文库筛选 DNA杂交法、抗体对蛋白产物免疫鉴定、测定蛋白活性鉴定。 4.1.2 cDNA法 提取真核细胞总RNA，纯化信使mRNA逆转录酶、四种碱基脱氧核苷酸、引物mRNA：DNA（反义链）RnaseH S-cDNAS1核酸酶、Ecoli聚合酶I d-DNA克隆进载体DNA杂交或免疫分析进一步分析DNA完整性4.1.3 PCR法（1）反应体系条件 两条链各一端互补引物、热稳定性聚合酶、dTNP、模板DNA（2）反应过程 DNA95变性，与引物退火55； 72延伸（热稳定性聚合酶、dTNP） （3）改良PCR逆转录PCR、反向PCR、锚定PCR特点4.1.4 化学合成法 起始反应物与反应柱偶联加入起始核苷酸，每步用DMP保护5-OH，用异 丙稀晴保护3-P逐个加入核苷酸, 完成循环, 直至达到所需目的。4.2原核细胞转化与筛选4.2.1 转化（1）定义转化 就是将纯化DNA导入细菌细胞的过程。（2）方法氯化钙法、电穿孔法、F质粒转导 氯化钙法-采用先用冰冷的CaCl2处理，然后置于42高温热激90s的方法帮助其吸收外源的DNA，这种方法的最大转化频率为10-3，其效率是每微克DNA转化107-108个细胞。 目前CaCl2转化方法的机制尚不甚清楚，可能是细胞壁被打了一些孔，DNA分子即从这些孔洞中进入细胞，而这些孔洞随后又可以被宿主细胞修复。 电穿孔- (electroporation)，简单地说就是把宿主细胞置于一个高强电场中，通过电场脉冲在细胞壁上打孔，DNA分子随即进入细胞，电穿孔方法也因茵而异，对大肠杆菌来说，一般是50 mL细胞，用25F，2.5kV和200的脉冲处理4.6ms，其转化效率可以达到小质粒每微克DNA转化109个细胞，大质粒(l00kb)也可达到每微克DNA转化106个细胞。 F质粒转导-有些细菌本身就存在质粒的自然转移的现象，有些质粒上带有负责形成细胞细胞接合的基因。 实际上自然的质粒转移现象主要涉及两个功能，一是接合功能，二是移动功能。 但用于重组DNA操作的质粒分子大多数没有接合功能，因而它自己不能通过接合作用(conjugation)从供体细胞转到受体细胞。于是人们就想了个方法，将携带有编码接合功能基因的另一个质粒转入同一细胞，如果第一个质粒上携带有移动功能基因，那么这个质粒就可能通过接合作用转入受体细胞。 这种方法大多用于转化那些用Ca Cl2法和电穿孔法无法获得满意效果的细菌。 4.2.2 筛选 以外源DNA插入到pBR322的BamHI位点（四环素抗性基因内）中为例，可以通过以下步骤来鉴别：（1）将转化细胞涂布于汗胺卞青霉素平板表面-转化细胞生长，未转化细胞被杀死 有那些带有完整的pBB322质粒或是插入有外源DNA片段的pBR322质粒的细胞可以在培养基上生长；没有转化的细胞就会被氨苄青霉素杀死。 -这一步是将转化和未转化的区分。 4.2.2 筛选（2）再将生长菌落用影印法涂布于含四环素培养基平板上-带有目的基因细胞不生长（Bam I位点在 tet基因内）。如在含合四环素的平板上生长, 该克隆就带有自身环化的pBR322，因为这些细胞对两种 抗生素都有抗性；而那些只 在氨苄青霉素的平板上生长， 而在四环素平板上不能生长的克隆就是带有外源DNA的重组质粒的克隆。 4.2.2 筛选（3）重复（2）可确定筛选出细胞克隆细胞。 4.3原核细胞基因表达与操作 要考虑 控制、转录、翻译、蛋白质稳定性、细胞外分泌特性等因素。4.3.1构建较好的表达载体 转录启动子和终止子序列特性；核糖体结合位点强弱；基因拷贝数、核基因/质粒基因；合成外源蛋白细胞中定位；宿主翻译效率；克隆基因在表达载体中的稳定性。4.3.2宿主系统本身特点 E coli 遗传背景、分子生物学、生理学、生物化学研究深入；很多目标基因在E coli 中能很好表达；培养条件易于控制；费用低。A：原核细胞基因表达 涉及两类信号：DNA启动子和终止子；始密码（AUG） 终止密码（UAA、UAG、UGA）。B：有功能启动子分离 有效表达的基本要求是有一个强有力的、可调控的启动子。最普遍使用的可调控启动子有: Ecolilac启动子 Ecoli trp启动子 Lac 10区与 lac-35区融合 lac启动子 噬菌体左向启动子 7噬菌体基因10启动子：可控强启动子驱动基因表达 4.4 常用表达载体特点（1）含LAC启动子表达载体（2）含启动子表达载体（3）含启动子表达载体（4）含启动子表达载体5、基因工程应用5.1 生产基因工程药物5.2 制备新型疫苗5.3 治疗基因缺陷性疾病5.4 改良动植物遗传性状5.5 动植物生物反应器5.6 治理污染与环境保护5.7 人体器官移植6、蛋白质工程简介 蛋白质工程是研究蛋白质分子结构规律与生物学功能的关系，对现有蛋白质加以定向修饰改造、设计和剪切，构建生物学功能比天然蛋白质跟加优良的新型蛋白。从预期功能出发，设计期望结构、合成目的基因并有效表达或通过定向诱变、定向修饰和改造等一系列工序，合成优良蛋白。 蛋白质工程是在基因工程基础上发展起来的，指的是通过对蛋白质已知结构和功能的认识，结合蛋白质