北大医学研究生课程-分子免疫学-细胞因子和细胞因子受体授

细胞因子和细胞因子受体CytokineandCytokineReceptor 王露 细胞因子概念 细胞因子 Cytokine 是指由机体各种细胞分泌的具有调控细胞生长 分化 调节免疫功能和生理反应并参与病理反应的小分子蛋白质 细胞因子从细胞中释放出来成为重要的可溶性信使蛋白 它是细胞间信号网络的组成部分 在免疫系统 这一网络调控天然免疫和特异性免疫应答中各种功能性事件 如炎症反应 防御病毒感染 特异性T B细胞增殖及功能调节 细胞因子研究历史 1957年 发现干扰素 IFN 1969年 提出淋巴因子 lymphokine 的概念1974年 定名细胞因子 cytokine 近年来 细胞因子发展迅猛 现已发现200多种细胞因子 成立专门的细胞因子学会 如国际细胞因子学会 internationalcytokinesociety 创办研究细胞因子的专门杂志 如 Cytokine 等 人类基因组研究显示 不仅有新成员存在于已有的细胞因子家族中 还会找到全新的家族 尚有多种细胞因子有待发现 怎样确定一种物质是细胞因子 从人类基因组发现新细胞因子由于体内含量较高的细胞因子大部分已被克隆化 传统的路线已经难以发现新免疫分子 目前的新细胞因子克隆化策略主要利用反向生物学原理 从人类基因组发现新细胞因子或其受体编码基因 传统生物学策略发现生物活性 鉴定细胞因子蛋白 克隆基因 细胞表型 动物模型 人体内功能及与疾病关联反向生物学策略数据库DNA序列 生物信息学 蛋白质表达 细胞表型 动物模型 人体内功能及与疾病关联 细胞因子序列同源性分析和基因Cluster分析 IL 19 20 23 27 30 33 35 IL 17B F 包括IL 25 IL 1F5 F10 免疫细胞基因和蛋白表达谱分析 IL 21 22 26 28A B 29 31 32 34 免疫相关疾病的易感基因或致病基因分析 IL 24 利用免疫细胞筛选模型 开展基因表达文库或RNAi文库的功能筛选 新的细胞因子的发现 免疫细胞筛选技术 生物信息学 基因芯片 酵母双杂交 蛋白质组学 结构基因组学 动物体内实验 基因敲除转基因小鼠 功能研究 药物开发研究 其它应用研究 免疫细胞筛选技术在发现细胞分子研究的重要位置 筛选潜在的细胞因子的策略 未知蛋白的生物信息学分析 无功能性文章报道或无免疫相关的功能性报道具有潜在的信号肽或被证实为分泌蛋白蛋白氨基酸数目少于300个主要在免疫系统和造血系统中表达 7 获得的基因 ORF克隆连接在真核表达载体 转染293T细胞 检测其分泌表达 在免疫细胞中 检测其生物学功能 正常细胞 未活化时 产生很少 活化后 产量可提高成百上千倍 如活化的淋巴细胞 活化的单核 巨噬细胞 NK细胞 成纤维细胞 上皮细胞 内皮细胞等 IL 1 IL 6 IL 12 IL 18和TNF 主要由巨噬细胞产生的细胞因子 细胞因子的来源 肿瘤细胞如Jurkat细胞 IL 2 3 骨髓瘤细胞 IL 6 WEHI 3 IL 3 等 基因工程技术从工程细胞如大肠杆菌 酵母菌等产生重组细胞因子 细胞因子的分类 根据产生细胞因子的细胞种类分类 1 淋巴因子 lymphokines 2 单核因子 monokines 3 非淋巴因子 非单核因子 巨噬细胞产生的细胞因子 基质 血管内皮 成纤维细胞等 根据细胞因子的结构和功能分类 1 白细胞介素 Interleukin IL 2 集落刺激因子 Colony StimulatingFactor CSF 3 干扰素 Interferon IFN 4 肿瘤坏死因子 Tumor NecrosisFactor TNF 5 趋化因子 Chemokine CK 6 生长因子 GrowthFactor GF 7 转化生长因子家族 TGF b 1 白细胞介素 Interleukin IL 1979年第二届国际淋巴因子专题讨论会上命名的 将由白细胞产生的又在白细胞之间发挥作用的细胞因子统一命名为白细胞介素 正式命名的有IL 1 IL 35 Interleukin来自inter leukin 意指白细胞之间信使分子 中文译为白细胞介素 白细胞介素的分类 IL 1家族 IL 1 1Ra 18 33IL 2家族 IL 2 4 7 9 15 21 共用 受体链 IL 6家族IL 6 11 27 30 31 共用gp130受体链 IL 10家族IL 10 19 20 22 24 26 28A B 29 结构相似 IL 12家族IL 12 23 27 35 均为异源二聚体结构 IL 17家族 IL 17A B C D E和F 1 集落刺激因子IL 3 1 5 6 11IL 8 趋化因子 其它IL IL 13 14 16 32 34 传统生物学策略 生物活性 蛋白质 基因 细胞 动物模型 人体内功能及与疾病关联 分离纯化 cDNA克隆 检测表型 构建 临床相关 反向生物学策略 DNA 蛋白质 细胞 动物模型 人体内功能及与疾病关联 表达纯化 检测表型 构建 临床相关 疾病标本 DNA 致病基因或易感基因分析 IL 2 1976发现 1979年命名 1983年克隆成功1965年发现混合白细胞培养上清中存在一种可溶性因子 可促进细胞生长 命名为母细胞形成因子 BlastogenicFactor BF 1976年发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子 故称为T细胞生长因子 Tcellgrowthfactor TCGF 1979年统一命名为白细胞介素2 interleukin2 IL 2 IL 2别名BF blastogenicfactor Costimulator EDF eosinophildifferentiationfactor KHF killercellhelperfactor LMF lymphocytemitogenicfactor LCMfactor lymphocyte conditionedmediumfactor LPF lymphocyteproliferationfactor MAF CI macrophage activatingfactorforcytotoxicityI PFC EA plaqueformingcellenhancingfactor SCIF secondarycytotoxicT cellinducingfactor TCGF T cellgrowthfactor TCPA Tcolony promotingactivity TDF thymocytedifferentiationfactor TMF thymocytemitogenicfactor TMF T cellmaturationfactor TMF T cellmitogenicfactor TRF 3 T cellreplacingfactor 3 TSF thymocytestimulatingfactor 1983年Taniguchi从ConA刺激的Jurkat白血病T细胞中克隆成功IL 2含有133aa 分子量为15 5kDaN端有糖基化修饰三个半胱氨酸 58 105 125位 IL 2主要产生细胞 主要由活化CD4 Th1分泌 CD8 T和NK也能产生T细胞肿瘤细胞系 如人Jurkat和小鼠EL 4T淋巴细胞杂交瘤 FS6 14 13 HT 24A等IL 2受体 CD25 CDl22 CDl32 c IL 2的生物学活性 作用具有沿种系谱向上有约束性 向下无约束性 1 促进活化的T细胞进入S期 维持细胞的增殖 刺激产生 MHCII IFN IL 4 5 6 LT CSF 2 促进杀伤细胞分化和效应 CTL NK LAK 诱导杀伤细胞 IFN TNF 产生 增强CTL穿孔素表达3 直接 间接作用于B细胞 促进增殖分化 Ig分泌4 促进巨噬细胞通过ADCC机制杀伤肿瘤 IL 2主要生物学活性 白细胞介素2超家族 oneimportantfamilyoftypeIcytokinesisthecommoncytokinereceptor chain c family whichconsistsofIL 2 IL 4 IL 7 IL 9 IL 15andIL 21 andissonamedbecausethereceptorsforthesecytokinesshare c alsoknownasIL 2R andCD132 YrinaRochmanetal NatureImmunology 2009 9 480 490 2 集落刺激因子 Colony StimulatingFactor CSF 能够刺激多能造血干细胞和不同发育阶段的造血祖细胞增殖分化 并在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子 根据刺激不同造血细胞系或不同分化阶段的细胞有不同的命名 G CSF 粒细胞集落刺激因子 1983年命名 1986年克隆成功 人G CSF基因位于17号染色体 人类有两种不同的G CSFDNA 分别编码含207和204个氨基酸的前体蛋白 均有30个氨基酸的先导序列 除了在35位插入了3个氨基酸外 其余序列相同 有5个半胱氨酸36 42 64 74 17游离 来源多种细胞可产生内毒素 TNF IL 1 IFN 活化单核 巨噬细胞可产生 刺激成纤维 内皮细胞也可产生 某些肿瘤细胞可产生 生物学活性 主要作用于中性粒细胞谱系造血细胞的增殖 分化和活化对人粒细胞 单核细胞 成纤维 平滑肌细胞等有趋化作用 G CSF与临床 1 粒细胞减少症2 肿瘤化疗引起血细胞减少症3 贫血和骨髓发育异常综合症 3 干扰素 Interferon IFN 具有干扰病毒感染和复制功能的细胞因子 1957年从病毒感染细胞培养中分离到一种生物活性物质 因它可以干扰其它病毒的复制而被命名为干扰素 干扰素的命名 20世纪60年代根据来源及对酸的耐受程度 将干扰素分成I和II型 I型 IFN IFN 耐酸 pH2活性稳定 其中白细胞产生的称白细胞干扰素 成纤维细胞产生的称成纤维干扰素 II型 IFN 不耐酸 是抗原或有丝分裂原刺激PBMC产生又叫免疫干扰素 80年代又将其称为IFN IFN IFN IFN 是异质性的 包括14个亚型 编码基因成串排列在9p23 产物高度同源 IFN IFN 均定位9号染色体 单外显子 许多刺激剂可活化基因表达 IFN IFN 分子结构有相似之处 成熟的IFN 各亚型有166个氨基酸 IFN 2165个 高度同源 4个保守的半胱氨酸 成熟的IFN 有166个氨基酸 3个半胱氨酸成熟的IFN 由143个氨基酸组成 以同源双体形式存在 对酸不稳定 生物学活性 IFN 和IFN 1 抗病毒活性 诱导抗病毒蛋白 2 5A合成酶 催化寡核苷酸PPP 活化RNaseL 降解病毒RNA 蛋白激酶PKR 肽起始因子eIF2磷酸化而灭活 抑制病毒蛋白的合成 2 抗细胞增殖 与抗病毒蛋白合成的机制相似 3 免疫调节 上调巨噬细胞IgGFc受体促进ADCC 活化NK 促进杀伤 诱导MHCI II类分子表达 增强免疫应答水平 有抗病毒 抗肿瘤的活性 但免疫调节的作用比IFN 重要的多 有较严格的种属特异性 IFN 1 上调MHCI类 II类分子的表达 2 促进Th1细胞分化 3 激活NK 巨噬细胞 4 抑制Th2细胞 肥大细胞和嗜碱性粒细胞 病毒 病毒复制 抑制病毒复制 信号转导 IFN a IFN 诱导蛋白 诱导刺激 胞核 胞核 I型干扰素 抗病毒 10 12g干扰素能在培养组织中保护一百万个细胞免受一千万个病毒颗粒的感染 4 肿瘤坏死因子 Tumornecrosisfactor TNF 1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质 该因子对多种肿瘤细胞系具有细胞毒作用 而且在多种动物模型中可引起肿瘤坏死 将其命名为肿瘤坏死因子 TumorNecrosisFactor TNF 1984 TNF 的cDNA得以克隆 后来相继克隆了该家族的多个成员 构成了TNF超家族细胞因子 TNF超家族特征 绝大多数成员为II型膜蛋白 在特异性金属蛋白酶作用下 形成可溶形式活性形式多为同源三聚体 TNF超家族包括TNF TRAIL FASL等 此外 尚有一批与TNF 序列同源 但缺乏诱导凋亡活性的TNF家族成员 TNF 巨噬细胞产生 TNF 又称为淋巴毒素 lymphotoxin LT 主要由活化T细胞产生 TNF 和TNF 共用受体 功能相似 TNF 功能广泛 为炎性因子 引起发热 诱导急性期蛋白合成 介导内毒素性休克可诱导凋亡 5 趋化因子 Chemokine CK 是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子 主要功能是招募血液中的单核细胞 中性粒细胞 淋巴细胞等进入感染部位 参与免疫调节和免疫病理反应 包括CXC CC C CX3C亚家族趋化运动是指细胞向高浓度刺激物方向的定向运动 根据蛋白质一级结构进行分类 CXC CC C CX3C亚家族 主要功能 1 趋化作用 2 上调整合素的表达 活化白细胞 3 促进细胞脱颗粒和生物活性物质释放 4 调节血管生成 5 调控免疫细胞分化 发育 成熟 在周围免疫器官正确定位 相互作用 并回到相应组织发挥生物学作用 6 生长因子 Growthfactor 具有促进不同类型细胞生长效应的细胞因子 如TGF FGF EGF VEGF NGF PDGF等 VEGF VEGF A VEGF B VEGF C VEGF D PlGF placentalgrowthfactor TheVEGFfamilyofreceptorsconsistsofthreeprotein tyrosinekinases VEGFR1 VEGFR2 andVEGFR3 andtwonon proteinkinaseco receptors neuropilin 1andneuropilin 2 Thesecomponentsparticipateinnewbloodvesselformationfromangioblasts vasculogenesis andnewbloodvesselformationfrompre existingvasculature angiogenesis InteractionbetweenVEGFR1andVEGFR2orVEGFR2andVEGFR3altersreceptortyrosinephosphorylation 血管内皮生长因子 VEGF ThegeneencodinghumanVEGFconsistsofeightexonsseparatedbysevenintronsThefirst26a a inVEGFconstitutethesignalingpeptideshowingthatVEGFisasecretedprotein AlternativesplicingoftheVEGFgeneproducesfourdifferentisoforms VEGF121 VEGF165 VEGF189 VEGF206VEGF145andVEGF183InVEGFsecretingcells themostfrequentisoformisVEGF165 ahomodimerwithmolecularmass45kD thereisamechanismthatenablesselectionofjustsomeendothelialcellsinsidethecapillarytoinitiateangiogenicexpansion Thesecellscalled tip cells occupytheleadingpositionwhilenewvesselsgrow theyreacttotheVEGFAgradientthatspecifiesthedirectionoftheirmigrationandmoveforwardofthegrowingcapillary Angiogenicstimuluscausesmajorchangeinthetip cellphenotype Theyacquiresuchpropertiesasinvasivenessandtheabilitytomigrate Theyalsoactivatesecretedorcellsurfaceproteasesforpartialdestructionofadjacentbasementmembrane 7 转化生长因子 TGF TGF 超家族是一组调节细胞生长和分化的蛋白质家族 这个家族至少有25个成员 除了TGF 外还有活化素 抑制素 骨形成蛋白 胶质细胞源性神经营养因子家族等TGF 的命名是根据这种细胞因子能使正常的成纤维细胞的表型发生转化 即从贴壁 琼脂中生长 分子结构和编码基因1985年克隆成功 哺乳动物有 TGF 1 TGF 2 TGF 3 TGF 4四个亚型 前三种为同源二聚体分子Pre pro TGF Pre pro TGF Npro TGF TGF 有活性 TGF 的产生1 机体多种细胞都可分泌非活性状态的TGF 2 活化的淋巴细胞TGF 水平增高 3 几乎所有肿瘤细胞均可检测到TGF mRNA 生物学活性 1 抑制细胞增殖 对大多数细胞的增殖具有抑制作用 因此TGF 具有形态发生 免疫抑制和肿瘤抑制的作用 2 它在肿瘤的转移中又可以发挥促进作用 特别是在EMT中发挥了重要作用 3 对细胞表型的调节 抑制IL 2诱导T细胞表达IL2R TfR等 抑制IFN 诱导黑色素细胞表达MHCII抗原4 促进Treg Th17细胞的增殖分化 抑制细胞因子的产生 如TNF IFN IL 4 IL 12 上皮间质变迁 epithelial mesenchymaltransition EMT EMT是细胞转分化的一种方式 特点 上皮细胞的极性消失 细胞与细胞之间的连接丧失 细胞骨架和细胞器的分布状态发生改变等 细胞表达间质细胞特有的某些分子如波形蛋白 vimentin 上皮细胞的标志分子如E cadherin则消失 细胞出现迁移和运动能力 EMT的核心过程是细胞极性模式的变迁 上皮细胞的稳定极性模式消失 代之以间质细胞的动态极性模式 上皮间质变迁与癌细胞演变 癌症的传统定义是上皮组织的恶性细胞病变 起源于上皮组织的癌细胞从原发上皮细胞的稳定极性模式演变为少数具有迁移能力的细胞才具有的动态极性模式 从而获得了侵袭和转移的能力 此即癌细胞演进的EMT学说 与EMT相关分子 许多抑癌基因的功能丧失性突变或表达下调与EMT有关 如 APC CDH1 catenin PTEN等 许多生长因子参与了EMT 如EGF TGF HGF FGF等 特别是TGF 在EMT中起到了重要作用 在多条通路中都发挥作用 一个新的抑制EMT细胞因子的发现 Part E Cadherinredistribution down regulation SylviaJulienGrilleetal TheProteinKinaseAktInducesEpithelialMesenchymalTransitionandPromotesEnhancedMotilityandInvasivenessofSquamousCellCarcinomaLines CancerRes63 no 9 May1 2003 2172 2178 AKTSTABLE shRNAA549稳转株迁移能力显著增强 Cltr B Cltr C Cltr E sh3 A sh3 C sh3 E 0H 24H 36H 0H 24H 36H 细胞因子受体 细胞因子发挥广泛多样的生物学功能是通过与靶细胞膜表面的受体相结合并将信号传递到细胞内部 因此 了解细胞因子受体的结构和功能对于深入研究细胞因子的生物学功能是必不可少的 从细胞因子结合其受体开始 到某些基因转录的启动 要经历复杂的细胞内分子间的相互作用 这样的作用过程称为细胞因子的信号转导 细胞因子受体都是跨膜蛋白 由胞膜外区 跨膜区和胞浆区组成 1 I型细胞因子受体家族 造血因子受体家族 2 型细胞因子受体家族 干扰素受体家族 3 型细胞因子受体家族 肿瘤坏死因子受体家族 4 趋化性细胞因子受体 CKR 家族 1 造血细胞因子受体超家族 I类 结构特征 是细胞因子受体中最大的一个家族 多数成员属于多亚单位受体 其中一种或两种亚单位多肽负责结合细胞因子膜外区序列结构相似于EpoR 即膜外N端含4个高度保守Cys 近膜侧含1个Trp Ser Xaa Trp Ser WSXWS 的基序 D200 2 IFN受体家族 II类细胞因子受体家族 结构特征 两条肽链组成 胞外区Fn3样结构域由200个氨基酸残基组成 也称D200 并含有4个不连续的半胱氨酸 包括IFN和IL 10受体 3 TNFR超家族 主要包括 TNF Fas CD40 神经生长因子受体等结构特征 这类受体富含半胱氨酸 在与细胞因子结合后三聚体化 胞外区有3 5个由40个氨基酸残基组成的重复亚单位 每个重复亚单位含有4 6个保守的半胱氨酸 形成 配体结合区域 TNFRI P55 CD120a 胞内同源序列即 死亡结构域 TNFRII P75 CD120b 不含死亡结构域 L 肿瘤坏死因子受体可发挥免疫调节作用 肿瘤坏死因子受体家族的CD40和FAS具有重要的免疫调节作用 CD40 B细胞 巨噬细胞CD40L FASL 效应T细胞CD40L B细胞CD40 B细胞增生 Ig类别转换CD40L 巨噬细胞CD40 巨噬细胞分泌TNFFAS FASL 表达FASL的CTL可清除表达FAS的淋巴细胞 这是一种重要的免疫应答的负反馈调节机制 4 趋化因子受体超家族 结构特征 是G蛋白偶联受体G bindingproteincoupledreceptor G PCR 由7个疏水性的跨膜区组成 又称7个穿膜区受体超家族 和相应的配体结合后 经偶联GTP结合蛋白而发挥生物学效应 CKR分类1 根据结合配体的不同 分为CXCR CCR XCR CX3CR 2 根据特异性不同 分为特异性受体 共享性受体 杂合性受体 DARC Duffy血型抗原 红细胞趋化因子受体 孤儿受体 病毒受体等 CXCR4和CCR5是HIV感染的共受体 Coreceptors HIV 1病毒嗜细胞特性 与HIV有关的趋化因子受体还有CCR2 CX 3 CR1等 二 细胞因子受体的几个特点1 细胞因子受体共同链 两个或更多细胞因子受体亚单位组成异聚或多聚体形式 包括一特异性配体结合 链 低亲和力受体 和一个参与信号转导链 链 参与高亲和力受体形成和信号转导 C IL 2受体 gC突变导致T细胞发育障碍 CytokinereceptorsthatsharegCsubunitandtheirfunctions gp130参与造血因子受体家族高亲和力受体形成和信号转导 不直接参与配体结合 细胞因子受体共用链的意义 节约 细胞因子功能替代 共用链缺失或功能缺陷 将引起严重后果 如IL 2R亚家族的g链缺陷 将引起SCID 2 可溶性细胞因子受体 sCKR 产生方式 大部分为膜受体脱落 如SIL 1R SIL 2R sTNFR sIFNrR sGM CSFR sIL 5R sIL 6R等小部分为分泌型 如sIL 4R sG CSFR sIL 5R sIL 6R生物学活性 膜受体正常代谢途径膜受体相应配体 竞争抑制剂 应用 检测 治疗 sCKR与临床 检测 sIL 2R 恶性肿瘤 自身免疫性疾病 病毒感染与其他传染性疾病 移植排斥反应等sIL 6R 炎症与自身免疫性疾病 感染性疾病 肿瘤和白血病等sTNFR 炎症与自身免疫性疾病 感染性疾病 肿瘤和白血病 骨髓移植等治疗 大多数sCKR与细胞因子结合后阻断细胞因子与膜受体结合 从而抑制细胞因子的生物学活性 应用sCKR为减轻或防止细胞因子造成的病理损害提供了新的治疗途经 3 细胞因子受体有天然拮抗剂 IL 1受体拮抗剂病毒产生的细胞因子结合蛋白 TNF IL1 细胞因子受体的信号转导 细胞因子受体的信号转导主要利用2个信号转导途径 JAK Januskinase STATRas MAPK激酶途径 细胞因子介导的信号转导Cytokineinducedsignaltransduction 细胞因子结构与功能特点 结构 同源性低 小分子蛋白 多为单链 少为双链 三聚体 TNF 多含糖基量微而活性强 pmol L 细胞因子作用是作为细胞之间的信使 细胞因子作用特点 旁分泌或自分泌 瞬时 距离范围小通过与相应受体结合发挥作用细胞因子诱导的受体亚单位聚合可以活化蛋白酪氨酸激酶 JAK 导致转录因子STAT酪氨酸磷酸化而激活靶基因转录多效性 重叠性 拮抗性 协同性 网络性 生理调节 病理反应 89 细胞因子间可相互诱生 IL 1能诱生IFN IL 1 IL 2 IL 4等 IL 2能诱生TNF IL 2 LT等 细胞因子可调节细胞因子受体的表达 IL 1 IL 5 IL 6等可促进IL 2受体的表达 IL 1能降低TNF受体的密度 细胞因子与生物活性之间的相互影响 B细胞和T细胞活化过程中 常需要两种以上细胞因子的协同作用或彼此调节 多效性 重叠性 丰裕性 拮抗性 协同性 细胞因子的作用具有网络性 主要生物学效应 抗感染 细菌和病毒 肿瘤 刺激造血细胞增埴分化免疫细胞的分化免疫调节作用细胞因子佐剂其它 促进血管生成 参与炎症反应 各种细胞的生长和分化 参与免疫应答与免疫调节免疫应答识别 感应 阶段IFN g刺激APCMHC II的表达IL 10抑制抗原递呈免疫应答细胞扩增阶段IL 2 IL 4 IL 5 IL 6等促进T B细胞的增殖与分化TGF b抑制淋巴细胞增殖免疫应答效应阶段趋化因子吸引炎症细胞TNF a IL 1 IFN g GM CSF等激活巨噬细胞 增强吞噬杀伤活性TNF a TNF b具有细胞毒性并刺激中性粒细胞IFN g抑制病毒复制在免疫应答过程中 免疫细胞之间通过细胞因子相互刺激 彼此约束 对免疫应答进行调节 维持免疫系统的稳态平衡 细胞因子与疾病 细胞因子及受体缺陷细胞因子过高表达可溶性受体水平升高 细胞因子的检测 用于判断机体免疫功能 进行疾病辅助诊断 判断病程 预后 评价治疗效果 细胞因子检测常用方法 生物活性检测法 biossay 检测细胞因子的生物学活性免疫学检测法 immnuossay 检测细胞因子蛋白质的抗原特性分子生物学检测法 检测细胞因子的mRNA表达 生物活性检测法 增殖实验 应用某一细胞因子能特异刺激或抑制某些指示细胞的增殖 通过 3H TdR摄入 MTT 反应待测细胞因子的活性水平 集落形成实验 半固体培养系统 造血因子集落刺激因子诱导干细胞形成某一或某些种类的集落 直接杀伤靶细胞 3H TdR 51Cr释放法抗病毒活性 干扰素抑制病毒致病变的程度 计算样品中IFN的活性单位凋亡实验 各种试剂盒 流式细胞仪趋化实验 琼脂糖中的趋化实验 微孔小室趋化实验迁移 侵袭实验 划痕试验 transwell 细胞增殖常用方法 3H thymidineincoroperation法将PBMC2 106 ml置於96 wellplate 再加入RPMI培养基或添加有LPS lipopolysaccharide ConA PHA PWM等细胞丝裂原的培基 於37 CO2培养箱2天後 加入1 Ci well3H 胸腺嘧啶 thymidine 继续培养8小时后 以cellharvester收集细胞于滤纸上 风干后以闪烁计数仪测3H thymidine含量 计算细胞增殖能力 MTT法基本可以替代 CellCountingKit 8简称CCK 8试剂盒 是一种基于WST 8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒 WST 8是一种类似于MTT的化合物 在电子耦合试剂存在的情况下 可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan 参考图1 细胞增殖越多越快 则颜色越深 细胞毒性越大 则颜色越浅 对于同样的细胞 颜色的深浅和细胞数目呈线性关系 Transwell将Transwell小室放入培养板中 小室内称上室 培养板内称下室 上室内盛装上层培养液 下室内盛装下层培养液 上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔 我们将细胞种在上室内 由于聚碳酸酯膜有通透性 下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞 从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长 运动等的影响 肿瘤细胞迁移实验8 0 12 0 m膜 上室种肿瘤细胞 下室加入FBS或某些特定的趋化因子 肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑 计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力 肿瘤细胞侵袭实验8 0 12 0 m膜 原理与肿瘤细胞迁移实验类似 transwell侵袭实验 原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开 细胞放在低营养的培养液里 为了找吃的 细胞会往高营养的培养液里面跑 但是有膜挡着 所以要穿过膜才行 我们在膜上涂上一层基质胶 模仿细胞外基质 于是细胞要把基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面 最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了 免疫学检测法 1 可溶性细胞因子检测 放射免疫测定 RIA 特异Ab包被 待测样品和同位素标记的细胞因子 竟争抑制实验酶联免疫吸附实验 ELISA 双抗体加心法WesternBlot检测单个细胞分泌的细胞因子 细胞斑点 酶联斑点 免疫学检测法 2 细胞内和细胞膜上的细胞因子的研究检测单个细胞结合的细胞因子 生物素 碱性磷酸酶 免疫荧光检测细胞内的细胞因子 细胞内的细胞因子的荧光检测 分子生物学检测 SouthernBlotNorthernBlot原位杂交RT PCR 体内功能研究 基因敲除 转基因利用特异性抗体观察细胞因子在体内的生物学作用 细胞因子的应用 在临床治疗 补充和添加抗肿瘤细胞因子 IL 2 IFN 促进造血的细胞因子 G CSF GM CSF EPO IL 11阻断和拮抗IL 1RA TNF单抗 可溶性TNFR生物佐剂 增强抗原性 细胞因子的临床应用举例 1 重组细胞因子 IFN 治疗肝炎 GM CSF G CSF治疗白细胞减少 2 细胞因子抑制剂 1 可溶性细胞因子受体 可溶性TNF 受体治疗RA类风湿性关节炎 RA 2 细胞因