通过VIGS技术研究ATG8基因在小麦与叶锈菌互作过程中的HR反应.doc

毕业论文题 目：通过VIGS技术研究ATG8基因在小麦与叶锈菌互作过程中的HR反应学 院： 专业班级： 学 号： 学生姓名： 指导教师姓名： 指导教师职称： 二O一二 年 六 月 十四 日通过VIGS技术研究ATG8基因在小麦与叶锈菌互作过程中的HR反应摘要：由小麦叶锈菌(Puccinia triticina)引起的小麦叶锈病在世界各地产麦区均有发生。植物抵抗病原体侵入所诱发的超敏反应在小麦抵抗叶锈菌侵染的过程中占有主要地位。ATG8基因参与了小麦抵抗叶锈菌侵染过程中的自噬发生，ATG8蛋白家族作为一种已被鉴定的膜结合蛋白，在自噬功能中具有重要作用。本实验通过VIGS技术沉默掉小麦中自噬相关基因ATG8，进而利用HR荧光染色技术研究分析在小麦与叶锈菌互作过程中ATG8基因对HR反应的影响，为进一步探讨ATG8基因和自噬功能的研究奠定了基础。关键词：小麦;叶锈菌;自噬;HR;VIGSThe hypersensitive response of ATG8 gene in Wheat-leaf Rust Interaction researching by VIGS technologyAbstract:Wheat leaf rust caused by Puccinia triticina is a serious and widely distributed disease of wheat.The Hypersensitive Reaction (HR) induced by the invasion of pathogens in the plants plays a very important part in the process of the wheat resistant to the pathogen. ATG8 genes involved in the process of autophagy during wheat resistance to leaf rust infection.As a confirmed membrane-binding protein family, ATG8 plays an important role in the autophagy function. In this article we Silent out ATG8 genes,the autophagy-related genes in wheat, via VGIS technology and then use the HR fluorescent staining technique to study the impact of ATG8 genes on the HR response in the wheat leaf rust interaction.And all of this laid the foundation for further study of the ATG8 genes and autophagy functions.Keywords: Wheat;leaf Rust; Autophagy;HR;VIGS1 引言11.1 小麦与叶锈菌11.2 PCD11.2.1 PCD与HR11.2.2 自噬11.3 VIGS技术21.4 本试验的研究目的22 材料与方法32.1 材料32.1.1 小麦、供试菌与病毒32.1.2 主要试剂及仪器32.2 方法42.2.1 幼苗的培养42.2.2 摇菌提质粒42.2.3 酶切线性化52.2.3 接菌62.2.4 取样62.2.5 HR荧光染色63 结果63.1 体外转录结果检测图63.2 病毒侵染小麦结果73.3 HR荧光染色结果74 讨论与分析84.1 病毒侵染小麦结果的分析84.2 HR荧光染色结果分析84.3 本试验问题分析95 结论9101 引言1.1 小麦与叶锈菌小麦（Triticum aestivum）是世界上分布范围最广、栽培面积最大、总产量最高的粮食作物。小麦叶锈菌是一种严格的活体寄生性真菌，同寄主之间存在着高度的小种一品种专化性，并在小麦上形成夏孢子和冬孢子，冬孢子萌发产生担孢子。该菌在华北、西北、西南、中南等广大麦区的自生麦和晚熟春麦上以夏孢子连续侵染的方式越夏，秋季就近侵染秋苗，并向邻近地区传播，其越冬形式和越冬条件与条锈病类似。该菌夏孢子萌发后产生芽管从叶片气孔侵入，气温2025经6天潜育，在叶面上产生夏孢子堆和夏孢子，进行多次重复侵染1,2。1.2 PCD1.2.1 PCD与HR程序性细胞死亡（Programmed Cell Death，PCD）是有机体在漫长的进化过程中发展起来的细胞自杀机制，在生物体生长发育、清除无用、多余或癌变的细胞，维持机体内物质循环及环境稳态方面发挥重要作用。PCD最早在动物中研究发现，是生物体生长发育到一定阶段，在特定组织器官中出现的一种主动的、由特定基因控制的生理性细胞死亡3,4。由于植物生长发育和细胞结构的特殊性，植物细胞PCD的研究起步较晚。1994年Greenberg等首次提出在植物抵抗病原体侵入所诱发的超敏反应(Hypersensitive Reaction，HR)中也存在着类似动物细胞程序性死亡的现象5,6。HR即过敏性坏死反应是植物基本的抗病反应，特点是当寄主植物受到病原物侵染时，在侵人点周围的少数细胞迅速死亡，产生枯斑，从而限制病原物扩展、蔓延的一种主动防卫反应7。现在人们习惯上都把HR归为PCD的重要表现形式之一，并以HR-PCD表示。虽然HR的形态特征已经被详尽描述了，但PCD的诱发和终止机制目前还不清楚。在侵染部位形成的HR-PCD必须通过专门的机制被精细的控制，从而使寄主的损伤控制到最小。而对于HR-PCD诱发和控制的理解，绝大部分来自枯斑模拟突变体的研究8。PCD分为两种类型：I型细胞死亡即是指细胞凋亡；II型细胞死亡则是自噬性细胞死亡（Autophagic cell death）9。1.2.2 自噬自噬（Autophagy），指细胞在营养缺乏或应激条件下，通过降解细胞内衰老的长寿命蛋白质、受损伤的细胞结构和细胞器，为细胞的重建、再生和修复提供必需原料，实现细胞的再循环和再利用，是生物体一种重要的防御和保护机制10。自噬主要分为三种类型:巨型自体吞噬(Macroautophagy)，微型自体吞噬(Microautophagy)和分子伴侣介导自噬(Chaperon mediated autophagy)。而在植物中目前确定的自噬机制包括巨自噬（Macroautophagy）和微自噬（Microautophagy）两种。目前，研究最广泛最主要的自噬形式是巨自噬11。自噬的形成过程可划分为4个主要阶段，即诱导、自噬小泡的形成、自噬小泡识别并与液泡(溶酶体)融合，以及自噬小体的降解。首先，细胞接受到自噬诱导信号后(饥饿条件或营养因子缺乏)，在细胞浆中产成相当量的游离扁平的双层膜结构，该结构类似“脂质体”，被称作隔离膜，围绕在被降解物的周围。其次，隔离膜不断延伸，将胞浆完全包绕起来，包括细胞器等，形成密闭的球状的自噬体。然后，自噬体形成后，可与细胞内吞的内吞泡、吞饮泡在体内融合。最后，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，在此期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，二者的内容物合为一体，同时自噬体中的降解物被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中供细胞重新利用，而残渣或被排出体外或滞留在胞浆中。1.3 VIGS技术病毒诱导的基因沉默( Virus Induced Gene Silencing，VIGS)属于转录后的基因沉默，指携带植物功能基因cDNA片段的重组病毒，在侵染植物体后诱导植物发生基因沉默而出现表型突变，可以通过植物表型或生理指标上的变化来反映该基因的功能12。VIGS技术现已被开发为快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术。BSMV是最早成功应用于单子叶植物(大麦和小麦)基因沉默的 VIGS 载体。八氢番茄红素脱氢酶(Phytoenedesacturase，PDS)是类胡萝卜素合成所必需的酶，其对应的基因常作为VIGS体系的指示基因13。VIGS与动物RNAi机理上有许多相似之处。VIGS启动时一般先形成双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)，dsRNA被类似动物Dicer、称为Dicerlike(DCL)的RNaseIII酶切割约为21224nt的siRNA(shortinterfering RNA)，siRNA作为VIGS促发因子以单链形式与Argonaute(AGO)RNA结合蛋白以及其他RNase结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA Induced Silencing Complex，RISC)，这一RISC复合体能够特异地与同源的靶标mRNA结合，并降解这些靶标mRNA14,15。VIGS诱导基因沉默的机制非常复杂。它因所使用的病毒载体的类型和宿主，甚至特定的靶基因片断不同而产生不同的效果。沉默过程中病毒对靶基因沉默效率的影响也因具体的体系不同而有明显差异16。基于瞬间表达的VIGS技术，为植物功能基因组的研究提供了一个高通量分析的技术平台。随着越来越多的基因组序列的测定，与传统的研究基因功能的方法相结合，VIGS将在植物基因功能研究中广泛的应用17,18。1.4 本试验的研究目的本实验室长期以来从事小麦抗叶锈菌侵染生理机制的研究工作，前期工作基础条件优越，研究技术有保证，跟踪国内外研究前沿，至今已积累了大量的文献资料，并在前期试验中熟练运用VIGS、HR荧光染色等技术，得到了很多关键的结果。并已知ATG8基因是自噬过程中的重要功能基因。而本试验主要研究小麦与叶锈菌互作过程中自噬与HR-PCD的关系。通过采用VIGS技术沉默掉自噬相关基因ATG8，然后利用HR荧光染色技术将样品染色，并将供试组样品的HR-PCD面积和数量与对照进行比较，观察基因沉默前后变化情况来确定自噬对HR-PCD中的影响。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 小麦、供试菌与病毒本试验本试验采用小麦（Triticum aesetrum L.）品种洛夫林10（Lovrin 10）。供试菌种为小麦叶锈菌（Puccinia triticina）生理小种260（单孢菌系繁殖）。洛夫林10与叶锈菌小种组成不亲和组合。大肠杆菌DH5。2.1.2 主要试剂及仪器 主要试剂：甲醇、氯仿、乳酚油（苯酚20g、20甘油40mL、乳酸20mL、水20mL）、95%乙醇、50%乙醇、0.5M氢氧化钠（NaOH 2g 水100mL）、Tris-Hcl缓冲液（PH8.5）、0.1Florensent Bnghthener（FB）、25甘油、北京TransGen Biotech有限公司的EasyPureTM Plasmid MiniPrep Kit、TaKaRa Biotechnology公司的Spe酶和Mul酶、Ambion公司的mMESSAGE mMACHINET7转录试剂盒10GD、FES根据下表配制VIGS药品，如下：表1 10GD的配制Tab.1 Protocol of 10GD组分加入量Glycine18.77gK2HPO426.13gddH2O用于定容总体积500mL用ddH2O将配制的药品定容止500mL，然后高压灭菌20分钟。表2 FES的配制Tab.2 Protocol of FBS组分加入量10GD50mLSodium Pyrophate（焦磷酸）2.5gBentonite（皂粘土）2.5gGelite 545 AW Course（硅藻土）2.5gddH2O用于定容总体积250mL用ddH2O将配制的药品定容止250mL，高压灭菌20分钟。用具与仪器：离心机、水浴锅、安瓿瓶、电子天平、磁力加热搅拌器、荧光显微镜、小型离心机、861旋涡混合器、DYY-2稳压稳流电泳仪、pH计、全套微量移液器、超低温冰箱、制冰机2.2 方法2.2.1 幼苗的培养先将小麦种子在一定的温度与湿度下催芽一夜，然后选取饱满健硕且萌发一致的种子播于直径15cm的花盆中，每盆种12-16粒种子，覆盖薄薄一层细土，将花盆放于人工气候培养室中进行培养，昼夜温度25/20摄氏度，光照周期14h/d，日光型镝灯照射，光照强度400 W/m2，培养至一叶一心时期，进行病毒感染。2.2.2 摇菌提质粒将含有目的基因载体的大肠杆菌在培养基中摇菌过夜，按照TransGen Biotech公司的EasyPureTM Plasmid MiniPrep Kit的操作步骤提取质粒。步骤如下：（1） 取1.5 mL过夜培养的细菌10000g离心1min，尽量吸尽上清。（2） 加入250L无色溶液RB（含RNase A），震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。（3） 加入250L蓝色溶液LB，温和的上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，（形成蓝色的透亮的溶液，颜色有半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解，不宜超过5min）。（4） 加入350L黄色溶液NB，轻轻地混合5-6次（颜色由蓝色完全变为黄色，指示完全混合均匀，中和完全），直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min。（5） 15000g离心6min，小心吸取上清加入吸附柱中。（6） 15000g离心1min，弃去流出液。（7） 加入650L溶液WB，15000g离心1min，弃去流出液。（8） 15000g离心1-2min，彻底去除残余的WB。（9） 将吸附柱放于干净的离心管中，在柱的中央加入30-50L EB或去离子水（pH7.0）室温静置1min。（10） 10000g离心1min，洗脱DNA于-20保存。2.2.3 酶切线性化将上一步提出的质粒中BSMV-，BSMV-0，BSMV:PDS和BSMV:ATG8用Mlu进行酶切线性化，BSMV-用Spe进行酶切线性化。酶切体系如下：表3 酶切体系的配制Tab.3 Protocol of digestion system组分加入体积Spe /Mul 2.5L质粒提取液9L10M Buffer5L灭菌水33.5L总体积50L 离心混匀，37水浴2h。 2.2.4 体外转录与转染参照试剂盒说明书进行体外转录。转录体系如下：表4 体外转录体系的配制Tab.4 Protocol of in vitro transcription system组分加入体积NTP10L10M Buffer2LDNA6L酶2L总体积20L 离心混匀，37水浴2h。取5L的转录后的体系进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，剩余溶液分装，用于后续转染。在幼苗生长7d后（第一片真叶完全展开时），各取2L的BSMV-、BSMV-和BSMV:ATG8等量混合于19.5L的FES，用手将混合后的溶液均匀涂抹于幼苗的第2和第1叶片上，再向叶面均匀喷雾，然后将幼苗置于保湿箱中黑暗保湿12-14h后，移入培养室内继续培养。 同理，各取2L的BSMV-、BSMV-和BSMV:PDS等量混合于19.5L的FES，和各取2L的BSMV-、BSMV-和BSMV:0等量混合于19.5L的FES，用手分别将混合后的溶液均匀涂抹于两组幼苗的第2和第1叶片上，再向叶面均匀喷雾，然后将幼苗置于保湿箱中黑暗保湿12-14h后，移入培养室内继续培养。2.2.5 接菌 在幼苗接病毒10d后，用毛笔蘸取叶锈菌夏孢子粉，均匀涂于叶表，再向叶面均匀喷雾，然后将幼苗置于保湿箱中黑暗保湿16-18h后，移入培养室内继续培养。2.2.6 取样分别在抹菌后的72h，96h，120h的幼苗上取样，取幼苗的第一片叶子中间部分，取1.5cm长的样品3-5片，放于安瓿瓶中，标清时间与植株抹病毒情况。染色备用。2.2.7 HR荧光染色荧光染色坏死细胞所有步骤在27-29下进行：（1） 将装有样品的安瓿瓶中加入1mL的甲醇和2mL的氯仿（视情况而定，体积比1:2），透明处理6h。（2） 转入1mL乳酚油和2mL乙醇（视情况而定，体积比1:2）中煮沸1.5min，为防止暴沸可放入牙签，放置过夜，整个过程在通风橱中进行。（3） 50乙醇冲洗两次，每次15min，用蒸馏水迅速冲洗2-3次，每次10min。（4） 放入0.5M的氢氧化钠中漂白透明两次，每次15min，用蒸馏水冲洗2-3次，每次10min。（5） 将样品浸入Tris-Hcl缓冲液中浸泡30min，然后将缓冲液去除干净。（6） 用0.1Florensent Bnghthener（FB）染色5min，（ FB可回收再利用），迅速转入蒸馏水中，清洗4次，每次清洗10min。（7） 转入25甘油中，浸泡30min后，用含有少量乳酚油的甘油作浮载剂制片。（8） 在荧光显微镜下观察样品。3 结果3.1 体外转录结果检测图取5L的转录后的体系进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果，如图1所示：M 1 2 3 4 5目的条带 图 1 转录产物电泳分析（15表示、0、PDS、ATG8对应的条带）结果表明体外转录获得了目的条带，可以用于后续试验。3.2 病毒侵染小麦结果接种叶锈菌生理小种260后120h小麦叶片结构显示，如图2所示： ATG8 120h 0 120h图2 ATG8 120h与0 120h的叶片结构对比图（红框中白斑代表坏死斑）沉默ATG8基因后的小麦经叶锈菌生理小种260侵染120h后叶片上出现坏死斑，而0病毒转染后的小麦经叶锈菌生理小种260侵染120h后叶片上未出现坏死斑。说明带有目的基因的病毒已转入小麦体内，可进行后续试验。3.3 HR荧光染色结果图3 ATG8与0转染的叶片经病毒侵染不同时间段的HR荧光染色结果图（AC表示ATG8转染的叶片经病毒侵染72h、96h、120h；ac表示0转染的叶片经病毒侵染72h、96h、120h）4 讨论与分析4.1 病毒侵染小麦结果的分析由于ATG8基因是重要的自噬功能基因，它的沉默会限制小麦自噬过程的正常发生，而由图可知沉默ATG8基因后的小麦经叶锈菌生理小种260侵染120h后叶片上出现坏死斑，而0病毒转染后的小麦经叶锈菌生理小种260侵染120h后叶片上未出现坏死斑。说明自噬对HR-PCD有负调控作用。因此当ATG8基因被沉默后便表现为HR-PCD失控, 蔓延到未受感染的正常组织，而由空载病毒转染后小麦自噬过程正常进行，因此出现了沉默ATG8基因后的小麦叶片出现的坏死斑而0病毒转染后的小麦叶片未出现坏死斑。4.2 HR荧光染色结果分析在72120h内，随着时间的变化，ATG8被沉默后，叶片上坏死斑数量逐渐增多，且单个坏死面积逐渐增大。而0病毒转染后的小麦叶片出现的坏死斑数量少于沉默ATG8基因后的小麦叶片出现的坏死斑数量，且面积小于沉默ATG8基因后的小麦叶片出现的坏死斑。4.3 本试验问题分析在HR荧光染色结果中A图与B图对比中，A图中的坏死斑比B图中数量多与理论结论矛盾，但单个坏死斑的面积比B图中小，可能的原因是由于接菌不均匀导致菌量多于样品。5 结论由于基因ATG8是自噬过程中重要的功能基因，它影响自噬过程的正常进行。通过采用VIGS技术沉默掉自噬相关基因ATG8，然后将样品中发生HR-PCD的面积和数量与对照进行比较，比较得出结果为沉默掉自噬相关基因ATG8后HR-PCD的面积增大且数量增多，由此表明自噬对HR-PCD具有负调控作用，即当ATG8基因被沉默后便表现为HR-PCD失控，从而蔓延到未受感染的正常组织，而由空载病毒转染后小麦自噬过程正常进行，HR-PCD被有效控制在侵染点附近。参考文献1 杨文香,田平素,黄燕等.小麦叶锈菌离体培养研究J.河北农业大学学报,2001,24(4):58-61.2 王智折.小麦叶锈菌侵染对不同抗病性小麦品种的生理生化差异J.赵可夫,植物抗性生理研究.山东:科技出版社,1992:173-178.3 张占全,宋水山,张春英等.异三聚体G蛋白参与小麦抗叶锈病反应的研究J.中国农业科学,2009,42(1):117 -123.4 Greenberg,J T,Guo A,et al. 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