冬虫夏草菌无性阶段的分离和鉴定

真菌学报 8 1 35 40 1989 Acta Mycologica Sinica 冬虫夏草菌无性阶段的分离和鉴定冬虫夏草菌无性阶段的分离和鉴定 刘锡 王 进 郭兰英 中国科学院微生物研究所 北京 俞永信 曾纬浙江省中药研究所 杭州 四川省中药研究所 重庆 摘摘 要要 分离工作在四川康定及北京进行 方法是将康定收集的 14 批 新鲜冬虫夏草 经整体灭菌后 分别割取子座 柄和虫体三部 然后将 各部切割成绿豆 大小样的接种体 置于含 1 胨的 PDA 上 在 20 温 箱中让其生长 也少量地进行了子囊孢子分离 结果获得 90 以上是同 一种分生孢子阶段真菌的培养物 而且对该培养物的鉴定表明 是被毛 孢属 Hirsutella 一新种 中国被毛孢 Hirsutella sinensis sp nov 并根据这些多批次且大数量接种体 1000 个以上 多途径且重复持续 分离 连同子囊孢子分离以及 1988 年康定点上再次分离的相互验证 皆 得到同一种真菌 中国被毛孢这一事实 我们初步结论 中国被毛 孢是冬虫夏草菌 Cordyceps sinensis Berk Sacc 的无性阶段 关关 键键 词词 冬虫夏草菌 中国被毛孢 冬虫夏草 Dong Chong Xia Cao 系一种虫生真菌 Cordyceps sinensis Berk Sacc 寄生于鳞翅目蝙蝠蛾 Hepialus spp 的幼 虫所成 是一种药用和食用的珍品 在我国古代已对其价值有较广泛 而深刻的认识并较早地由我国传入世界各地 特别是东南亚地区 近 年来随着国内外的深入研究 进一步认识到冬虫夏草于人体的滋补和 医疗方面的重要性 从而促使现阶段需求量激增 而自然资源又深感 不足 所以一些研究机构在积极地进行人工栽培技术的研究 但由于 菌种的分离方法不当和其无性阶段的报导有所混淆 影响了人工栽培 工作的进展 为此 我们于 1987 年赴四川康定产地进行了冬虫夏草菌 的分离和培养 现报道此菌分离物 即冬虫夏草菌无性阶段的特征和 鉴定的结果 菌种的分离培养 一 供试采集物 除在康定市场购买 2 批外 其余 16 批采集物系先后赴各产地点上 收集的新鲜 质佳 完整的冬虫夏草 此外 还在点上收集了正在掷 射的子囊孢子于培养基上 并连同一批新鲜冬虫夏草经过处理带回北 京保存和分离 二 组织分离 将收集来的 18 批采集物中的 14 批在康定陆续进行组织分离 方 法是每批采集物大多选 5 条 仅 2 批选 2 条的新鲜完整的冬虫夏草进 行表面灭菌处理之后 将每一条分割成子座 柄和虫体三部分 然后 再将子座切成 5 6 块 柄部 3 4 块 虫体 8 9 块作为接种 体 分别接种于 10g 胨 1000ml PDA 或 10g 蚕蛹煎汁 1000 ml PDA 上 试验中发现二者对菌生长几无差别 置 20 温箱中培育 此外 在北京还按上述方法少量地将虫体进行组织分离 或将子座和虫体用 无菌镊子掰开 直接取其中心白色菌丝组织接种于培养基上 三 子囊孢子分离 在康定点上取含子囊孢子待放的子座进行灭菌 在无菌条件下将 整个子座的两端使悬于培养皿盖上 然后将此盖盖于盛有培养基的培 盖皿上 或将子座用细线拴其柄部悬吊于陈 PDA 斜面试管内 以上方 法均可获得子囊孢子 再经处理带回北京镜检 挑取萌发的子囊孢子 分别移殖于 73 个斜面试管中 置 20 温箱内让其生长 四 结果 分离工作主要在康定进行 在北京也进行了组织分离和子囊孢子 分离 以便获得资料与康定的相互验证 在康定的大量分离中 接种 了 1000 多个接种体 其中有 900 多个发生的真菌是同一种分生孢子阶 段菌 其余的近 10 种杂菌 大多是真菌 也有细菌 由于它们的出现 没有规律性 所以易于识别和汰除 在北京进行的子囊孢子分离中 分别移殖的 73 个萌发子囊孢子的斜面试管 除 2 管污染外 只有 18 管长出同组织分离一致的真菌 1986 年四川省中药研究所也从子囊孢 子中分离到一株这种菌 其余的虽未污染却久久不再生长 嗣后取 出其接种体镜检仍能清楚看到萌发的子囊孢子 另外 北京的组织分 离 和直接取子座中心菌块分离 以带回的材料少 仅小量地每隔 1 个月 进行 1 次 但分离出的菌与康定分离的和子囊孢子分离的都是同一种 菌 即使已保存 9 个月之久的材料分离出的也是如此 这些试验结果 表明 从冬虫夏草大规模分离出的分离物 90 以上是同一分种生孢子阶 段的真菌 同时也表明 这种分生孢子阶段的真菌同冬虫夏草菌的有 性阶段 Cordyceps sinensis Berk Sacc 有着多么密切的联系 据此 我们按康定产区大量分离所获得的 90 以上的菌和远离产区北京 实验室组织分离和子囊孢子分离的都是这一种真菌这一事实 初步得 出结论 这种分生孢子真菌是冬虫夏草菌的无性阶段 特征和鉴定 冬虫夏草菌是一种嗜较低温度的真菌 15 20 为其适温 在 25 以上则抑制生长 在试验中将接种体虫体置于盛有胨 PDA 的培养 皿内在 20 温箱中培育 6 7 天后方在虫体上长出灰白 继而转变成 棕黄乃至黑色 在子座及柄部上则生长出棕黄色至黑褐色的菌苔 但 很久不扩展延及于培养基上 为了避免快速生长的杂菌覆盖污染 遂 及时将其分别移殖于斜面试管中培育 这样移殖后 2 星期 始见接种 体渐渐变黑而且有的稍膨大 其上有极不发达短而稀疏的菌丝体 2 个 月后以接种体为中心形成直径 6 8mm 的圆形黑色菌落并有黑色色素渗 入培养基内 3 个多月后 斜面上菌落直径才达 1 5cm 左右 这时 接 种体中心里黄褐色 其较宽的周缘呈黑色且表面光滑 有稀疏平贴的 纤细菌丝体 一般菌落较坚硬 之后 在中心部分出现极为稀疏的白 色菌丛 是冬虫夏草菌的菌丝体和分生孢子 但在某些特殊处理下 也可获得产生较多的菌丝体和分生孢子 特别是在一些 特殊培养基上 既可产生高达 2 3cm 似蚯蚓粪泥状的隆起黄褐色子座 组织 也可生长出丰茂白色含分生孢子的菌落 中国被毛孢中国被毛孢 新种新种 图 1 HirsutellaHirsutella sinensissinensis Liu Guo Yu et Zeng sp nov Species similis Hirsutellae guyanae ex larva Saccharosydne saccharivora et H verticillioidi in Leptopharsa hevae quae differunt illa conidiophoris infasciculatis cellulis conidiogenis rarius polyphialidicis conidiis latioribus haec conidiophoris infasciculatis cellulis conidiogenis plerumque polyphialidicis conidiis brevioribus 图 1 中国被毛孢 Fig 1 Hirsutella sinensis Liu Guo Yu et Zeng Mycelium in medio 1 Peptone PDA laxum superficiale raro immersum hyalinum septatum ramosum laeve vel verrucusum 2 2 4 3 5 4 m latum Conidiophora hyalina solitaria vel 2 8 in fasciculo non ramosa vel ramosa vel ad cellulae conidiogenae sessiles reducta terminalia vel lateralia hyphis in vegetabilis vel cellae conidiogenae et 1 6 aliarum cellularum composita vel cum 2 6 cellulis conidiogenis disposita laevia vel verrucusa 56 0 103 0 4 8 8 7 m Cellulae conidiogenae monophialides enteroblasticae hyalinae laeves vel verrucusae aciculariae vel subuliformiae erectae vel magnopera curvatae 17 3 47 6 m longae apicem acutae 1 0 2 0 m latae basim 3 2 5 4 m latae Conidia hyalina aseptata laevia reniformia vel longe ellipsoidea 5 4 14 0 3 2 4 3 5 4 m plerumque 2 4 6 in muco involuta limoniformia 6 5 19 5 4 3 16 2 m Cultura sicca typi ex larva Hepiali sp isoclata Huoshaoshan Kangding Sichuan Provincia Sinica V 1987 leg Yu Yong xin Fang Liang zhen et Hua Wei wei HMAS 55469 Typus 菌丝体 在 1 胨 PDA 上 稀疏发生 表生 较少基生 无色 有 隔膜 分枝 平滑或具微疣 宽 2 2 4 3 5 4 m 分生孢子梗无 色 单生或 2 8 本簇生于无色球形细胞组成的小子座上 不分枝至分 枝 但不形成孢梗束 最简单的仅为无柄产孢细胞单生于营养菌丝的 顶端或作为侧校几乎呈直角伸出 或为 1 产孢细胞和 1 6 个支撑细胞 组成 有的还在主梗顶部第 1 3 隔膜下轮生出产孢细胞或分枝 每隔 膜下 2 6 个 直立或向外强烈弯曲 56 0 103 0 4 8 8 7 m 产孢 细胞系瓶形小梗 无色 单点内壁产孢 平滑或具微疣 针形或钻形 长 17 3 47 6 m 基宽 3 2 5 4 m 逐渐向上尖削成一狭窄的颈部 颈顶宽 1 0 2 0 m 分生孢子无色 无隔膜 平滑 肾形或长椭圆形 5 4 14 0 3 2 4 3 5 4 m 大多 2 4 6 个一群为一粘被膜所 包围 粘被膜柠檬形 6 5 19 5 4 3 16 2 m 中国被毛孢 Hirsutella sinensis 8706 2 870525 III 菌株系自四川康定火烧山采集的冬虫夏草新鲜质佳的样品分离 俞永 信 方良珍 华巍巍 1987 年 5 月采 模式菌株干培养物 HMAS 55469 保存于中国科学院微生物研究所真菌标本室 中国被毛孢与 Minter 和 Brady 1980 发表的两个新种 生于同 翅目甘蔗长飞虱 Saccharosydne saccharivora 的圭亚那被毛孢 Hirsutella guyana 和生于半翅目橡胶树瘦蝽 Leptopharsa heveae 的轮生被毛孢 Hirsutella verticillioides 相近似 但 后两菌的分生孢子梗均不簇生而且较窄 6 m 支撑细胞少或无 前一菌 1 2 个 后者则无 产孢细胞均兼有多点芽茁产孢方式且 不呈强烈弯曲 粘被膜均较小 前者 8 13 后者 6 11 m 甚至分 生孢子的量度上也有差异 前者 8 12 3 7 后者 6 8 3 5 m 因 而中国被毛孢是一新种 讨讨 论论 冬虫夏草的人工栽培必须将四个方面的条件完好的解决才能顺利 完成 这四个条件是 1 菌种 2 繁殖蝙蝠蛾的技术 3 侵 染途径和 4 摹拟产地的生态环境 特别是土壤 土壤和大气的温 湿度和光线 显然 菌种是其中的一个关键性条件 近期以来 各研 究机构都各自分离得到了菌种 但由于还在保密阶段 所以有关冬虫 夏草菌种的报导较少 沈南英等 1983 曾报道过冬虫夏草菌的分离 培养 但迄今未见到该菌种的鉴定结果 同年 小林和清水 1983 在其 冬虫夏草菌图谱 一书中叙述并图示过冬虫夏草培养产生的不 完全阶段菌 是无色分生孢子的葡萄穗霉属型 Stachybotrys 翌 年 陈庆涛等 1984 以在康定分离冬虫夏草得到的菌株 发表了中 国拟青霉 Paecilomyces sinensis Chen Xiao et Shi 新种并认为 可能是冬虫夏草菌的无性阶段 不过 在我们大量分离中 连同杂菌 在内却从未发现过 1 株葡萄穗霉属的菌 虽然在试验中确有拟青霉属 Paecilomyces 菌的出现 但我们观察到频率极低且发生无规律性 故认为是杂菌 至于陈庆涛等 1984 在同一产区却未能获得同我们 分离出的同一种真菌 可能是在过高温度 25 下培养之故 中 国被毛孢在此温度下已不能生长 当然 将分离出的分生孢子菌株在产地接种蝙蝠蛾幼虫体或在实 验室人工离体培 养 使之生长出含子囊孢子的子座来 才是准确无 误地检测该菌株是否虫夏草菌的无性阶段的最好方法 但是 要做到 这些 正如陈庆涛等 1984 和梁宗琦 1985 所述 还有不少困难 故现阶段报导虫草属 Cordyceps 各个种的相应分生孢子阶段 国内 外多系基于间接的证据 Petch 1937 1944 Mains 1951 1958 陈庆涛等 1984 梁宗琦 1985 为此 我们根据 1987 1988 年 多批次且又大数量接种体和多途径且又持续分离以及子囊孢子分离 24 66 中国被毛孢 2 74 污染菌 72 60 未长菌 的结果资料 连同 1988 年四川省中药研究所 尹定华 傅善全私人通讯 在康定点 上再次分离验证的 皆得到同一种真菌 中国被毛孢这一事实 可 以认为 中国被毛孢是冬虫夏草菌的无性阶段 参 考 文 献 1 陈庆涛 肖生荣 施至用 1984 中国拟青霉新种及其与虫草的 关系 真菌学报 3 24 28 2 小林义雄 清水大典 1983 冬虫夏草菌图谱 保育社 280 页 3 梁宗琦 1985 古尼虫草分生孢子阶段的分离和鉴定 真菌学报 4 162 166 4 Mains EB 1951 Entomogenous species of Hirsutella Tileachlidium and Synnematium Mycologia 43 691 718 5 1958 North American entomogenous species of Cordyceps Mycologia 50 169 222 6 Minter DW Brady BL 1980 Mononematous species of Hirsutella Trans Br mycol Soc 74 271 282 7 Petch T 1937 Notes on entomogenous fungi Trans Br mycol Soc 21 34 67 8 1944 Notes on entomogenous fungi Trans Br mycol Soc 27 81 93 9 沈南英 曹璐 张显耻 善智 魏世录 周中蓉 1983 冬虫夏 草真菌的分离 食用菌 5 1 3 ISOLATIONISOLATION ANDAND IDENTIFICATIONIDENTIFICATION OFOF THETHE ANAMORPHICANAMORPHIC STATESTATE OFOF CORDYCEPSCORDYCEPS SINSIN ENSISENSIS BERK SACC BERK SACC LIU XI JIN GUO YING LAN Institute of Microbiology Academia sinica Beijing Yu Yong xin Zeng wei Zhejiang Institute of Chinese Materia Medica Hangzhou Sichuan Institute of Chinese Materia Medica chongqing ABSTRACTABSTRACT A new spe