植物抗旱抗旱机理及其相关基因研究进展.doc

植物抗旱机理及其相关基因研究进展摘 要：提高植物的抗旱能力已经成为现代植物研究工作中的关键问题之一。近年来，随着分子生物学的应用与发展，该领域的研究也已引起国内外学者广泛的兴趣和重视，在抗旱机理研究及相关基因克隆及表达调控方面已取得可喜进展。本文综述了植物对于干旱胁迫在细胞水平、生理生化水平以及基因表达调控水平上的响应，重点介绍了基于细胞信号转导和基因调控的抗旱基因工程以及渗透保护物质积累的抗旱基因工程的新进展，最后对通过基因工程改善植物抗旱性所存在的问题进行了探讨，并对其前景进行了展望。关键词：抗旱机理；渗透调节；信号转导；基因调控；渗透保护物积累。Progress of the Research on Plant Drought-resistant Mechanism and Related GenesAbstract: In recent years，with the application and development of molecular biology，the research in the drought-resistant mechanism and the relevant gene cloning and expression regulation have aroused wide interest and attentionamong domestic and foreign scholars，which has made gratifying progress. In this article, the plant responses to drought stress at cell, physiological and biochem ical levels as well as geneexp ressed and regulated levels, and mainly introduced the latest advances of drought stress tolerance engineering of plantbased on signal transduction, gene regulation and accumulation of osmotic adjustments1were summarized. In addition, the problem s of improving drought stress tolerance of plant through gene engineering were discussed, and the outlook was alsoanalyzed in paper1Key words: Drought-resistant mechanism; Osmotic regulation; signal transduction; gene regulation; accumulation of os-motic adjustments干旱已是世界性的问题， 世界干旱， 半干旱地区已占陆地面积的三分之一以上， 干旱对植物的影响在诸多自然逆境因素中占首位。显然， 对植物抗旱机理的研究显得尤为重要。在长期的进化过程中， 高等植物通过一系列生理变化来响应环境的水分胁迫。这些变化体现在渗透调节， 保护酶体系，抗旱基因与遗传特性等方面. 随着现代分子生物学与生物技术的发展, 植物如何通过细胞感受逆境信号、传导逆境刺激、激活一系列分子途径并调控相关基因表达和生理反应以适应逆境， 已成为科学家1研究的热点。本文对上述几方面的研究进行了综述， 旨在总结植物抗旱的新机制， 以利于我们更好的进行抗旱工作。1植物对干旱生理生化上的响应干旱胁迫的环境下， 通常会造成植物在生理、生化代谢途径上的改变，在细胞水平上主要表现为:细胞膨胀的消失，细胞膜流动性的改变，细胞内可溶物浓度的变化，以及蛋白和蛋白，蛋白和脂类间的相互作用2 。植物也能通过自身的调节和适应来避免体内水分的丧失。例如，光合作用效率降低3,细胞内有机酸及渗透类物质的积累，解毒物质的过量合成，糖类物质代谢的改变等。其中，光合效率的降低主要是由于气孔的关闭和光合作用相关酶活性的降低造成。而渗透保护物质包括氨基酸 (脯氨酸 ) 、多胺、季胺、多羟基化合物、糖类 (果糖、蔗糖、海藻糖等 )，在植物受到干旱胁迫时大量积累，有助于调节植物细胞内渗透压与外界的平衡，防止水分丢失。植物细胞还能够产生超氧化物歧化酶 ( SOD )等物质分解在水分胁迫下产生的对细胞结构有毒性的大量活性氧和超氧负离子等物质。此外，植物在干旱胁迫下，碳水化合物的代谢发生变化，植物体内的多羟基复合体的羟基群能通过氢键的作用结合细胞膜磷酸脂的极性端，这种相互作用能显著增强细胞膜的稳定性3-4 。2 干旱胁迫信号的感知及传导植物抗旱机能的实现要通过对水分胁迫的感知、胁迫信号的传导及相关基 因的表达调控等一系列复杂的生理生化过程。 植物适应水分胁迫的能 力主要由以下几方面决定：即该植物具有水分胁迫基因；水分胁迫信号感知与传导途 径的畅通；干旱情况下胁迫基因能够被启动；水分胁迫基因转录后的调控，包括表达产物功能修饰。其中最关键的是细胞如何感知、转导水分胁迫信号，并诱导水分胁迫基因的表达。尽管从分子水平上，人们还不能完全阐明这些过程，但已有一些研究发现，植物细胞可以通过膨压变化或膜受体的活性变化感知水 分胁迫，从而将胞外信号转为胞内信号，触发信号传递途径，并可导致第二信使（Ca2+、IP3等）生成。在通过蛋白的磷酸化和去磷酸化逐级传递并放大信号，2种途径依赖ABA,1种途径不依赖ABA。2.1 依赖 ABA 的途径植物在干旱脱水等胁迫下，一种主要的生理变化是胁迫信号激发ABA合成 酶的作用，从而使内源ABA水平显著增加。内源ABA通过ABA受体被细胞感知，从而触发第二信号系统，即ABA通过cADPR/IP3使胞内Ca2+升高，引发MAPK磷酸化/去磷酸化反应而传递信息，然后激活特定的转录因子，转录因子与相应的顺式作用元件结合从而诱导特定基因的表达。其中途径是ABA通过一种具有亮氨酸拉链结构域的调节蛋白bZIP（Leu-zipmo-tif）和具有ACGT或G盒的ABA反应元件ABRE（ABA responsive element）结合来指导诱导基因的表达；途径是通过转录因子MYC/MYB与相应的顺式作用元件结合指导蛋白质的合成5（图1）。2.2 不依赖 ABA 的途径水分胁迫被细胞膜上“渗透感受器感知，不需要ABA介导，直接触发第二 信号传递系统（Ca2+ /IP3/CAPK磷酸化和去磷酸化反应）传递信息，最终激活 相应的转录因子而导致特定的基因被诱导表达。目前通过RD29A、KIN2、RD17、DREB1、DREB2等脱水诱导基因已鉴定出参与转录调节的顺式作用元件和反式作用因子（转录因子），即含有一个9 bp的同向重复序列TACCGACAT的顺式作用元件DRE（dehydration responsive element），其核心序列为CCGAC，并相继分离了含有AP2/EREBP结构域的DRE的反式作用因子CBF1、DREB1、DREB2 6（图 1）。3 渗透调节物质渗透调节物质是在盐胁迫或干旱胁迫下，为消除胁迫所造成的伤害，维持渗 透平衡和体内水分，在细胞中产生和积累的一些小分子有机化合物，主要包 括，（1）氨基酸及其衍生物，如脯氨酸、甜菜碱等；（2）低分子糖类，如海藻糖、果聚糖等；（3）多元醇，如甘油、甘露醇、山梨醇等；（4）渗调蛋白（osmo-tin，OSM）。其中海藻糖、甜菜碱是次生代谢产物7 ，它们有许多相同之处：极性电荷少，溶解度高，分子表面有较厚水化层等，不仅能调节渗透势，还能稳定细胞质中酶分子的活性，保护其不受渗透胁迫的直接伤害8，防止酶变性失活。3.1 脯氨酸抗旱机理及合成酶基因大量实验研究证明，在盐碱、干旱等逆境胁迫下，植物体内游离脯氨酸含量明显增加9.10，表明脯氨酸是许多植物对抗外界环境胁迫的调渗物质。Kaviishor等11将从乌头叶豇豆中克隆到的吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）基因与CaMV35S启动子连接后转入烟草，发现转基因烟草中脯氨酸含量比对照高1018倍。在干旱胁迫下，对照烟草中脯氨酸含量由0.08mg/g鲜叶重增加到3mg/g；而转基因烟草脯氨酸含量由1mg/g增加到6.5mg/g。在干旱胁迫下，转基因烟草落叶少且迟，根比对照长40%，生物量比对照增加2倍。3.2 甜菜碱抗旱机理及合成酶基因甜菜碱（betaine）属于四甲基铵类化合物，是植物的另一种重要的渗透调节物质。许多高等植物特别是藜科和禾本科植物，在受到水分胁迫时大量积累。常见的甜菜碱有4种：甜菜碱、甘氨酸甜菜碱、丙氨酸甜菜碱和脯氨酸甜菜碱。其中对甘氨酸甜菜碱研究比较深入。甜菜碱在植物中是以胆碱为底物经2步合成的，即胆碱加单氧酶（cholinemonooxyge-nase，CMO）催化胆碱氧化成甜菜碱醛，然后甜菜碱醛脱氢酶（betainealdehydedehydrogenase，BADH）催化甜菜碱醛形成甜菜碱。如下所示：3.3 海藻糖抗旱机理及合成酶基因海藻糖（trehalose）是由两个葡萄糖分子以，1，1-糖苷键构成的非还原性糖（图2）。它在理论上存在3种不同的正位异构体（anomers），即，-海藻糖（又叫蘑菇糖，mycose），-海藻糖（新海藻糖，neotrehalose），-海藻糖（isotrehalose）12。海藻糖的性质非常稳定，海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，其原因是海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下，能在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质、核酸等生物大分子的结构，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境，表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。自然界中存在一种隐生生物（hiddenlife），这类生物在极端干燥的条件下，可将体内99%的水脱去，仍能以一种极低的新陈代谢或停止生命活动的状态生存下来，在重新给与水分时，又能恢复到正常的生命活动状态，其奥秘就在于它们的细胞中含有大量的海藻糖13。3.4 果聚糖抗旱机理及相关基因果聚糖（fructan）是蔗糖与一个或多个果糖相连的聚合物，是水溶性的、非还原性多糖。聚合度（DP，单糖数目）最小的是果聚三糖（DP=3）。已知有3种果聚三糖，每一种均是通过一个果糖的糖苷键与蔗糖分子中的3个羟基基团的任意一个连接而形成的。当果糖与蔗糖分子中的果糖基1碳位相连便形成1-蔗果三糖（1-kestose）或异果三糖（isokest-ose）；当果糖与蔗糖分子中果糖基6碳位相连接便形成6-蔗果三糖（6-kestose）或蔗果三糖（kestose）。这两种果聚三糖均含有一个末端葡萄糖和一个末端果糖。当一个果糖基于蔗糖分子中的葡萄糖基6碳位连接便形成新蔗果三糖。近年来，已发现了多种果聚糖合成酶基因，其中果聚糖蔗糖酶基因（sacB）是较早被克隆的基因。1995年Pilon-Smits等14研究发现，转sacB基因的烟草在正常条件下，与对照作物无明显差异；而在干旱胁迫下，转基因烟草的果聚糖含量比对照高7倍，其鲜重和干重分别比对照重35%和59%，特别是转基因的烟草的根比对照重73%。由此可以推测植物体内果聚糖增加，刺激了植物根系生长发育，因而提高了植物吸收水分的能力。随后Hellwage15在GenBank上发表了洋蓟（Cynarascolymus）的果聚糖果糖基转移酶基因（FFT）的mRNA序列（AJ0-00481）。果聚糖果糖基转移酶由617个氨基酸残基组成。3.5 甘露醇抗旱机理及相关基因糖醇是一种多元醇，含有多个羟基，亲水性能力强，能有效的维持细胞内水活度。甘露醇（mann-itol）是一种六碳糖醇（图3），在芹菜和块根芹中，占韧皮部所运输的光合同化物的50%。甘露醇不仅是韧皮部运输的一种重要的光合同化产物，也是介导耐盐和耐渗透的一种重要的溶质。因此，人们试图通过基因工程手段使不含甘露醇的植物产生它，从而使植物具有耐胁迫的能力。已有研究将编码细菌1-磷酸-甘露糖醇脱氢酶基因（mtlD）与35S启动子融合后转入本身不能合成甘露糖醇的烟草和拟南芥中，结果转基因植株能积累甘露糖醇且耐盐性提高。3.6 渗调蛋白渗调蛋白（osmotin，OSM）是和脯氨酸等小分子物质有所不同的另一种渗透调节物质，是在盐胁迫、脱水或低水势条件下，植物在对渗透压力适应过程中所合成的一类蛋白。渗调蛋白是一种阳离子蛋白，多数以颗粒状存在。可能在渗透胁迫下，其本身吸附水分或改变膜对水的透性，减少细胞失水，维持细胞膨压；或鳌合细胞脱水过程中浓缩的离子，减少离子毒害作用。还可能通过与细胞膜上的离子通道的静电相互作用，减少或增加液泡膜对某些离子的吸入，改变离子在细胞和液泡中的浓度，来传递胁迫信号，诱导胁迫相关基因的表达，从而增加植物对胁迫的适应性16。4 离子区域化和水通道蛋白4.1 离子区域化离子区域化是指植物将过量的有毒离子阻隔于细胞内某些部位（如液泡中）或其它生命活动影响小的器官（如老叶）中的现象，这也是植物能够产生耐盐和避盐的根本原因17。离子区域化依赖于离子跨膜运输。4.2 离子通道离子通道是由蛋白质大分子组成的的跨膜孔道系统，它的开关是由化学信号或环境信号控制的。目前已知的阳离子通道有K+通道和Ca2+通道；阴离子通道有Cl-通道以及供有机离子通过的有机离子通道。Guggenheim发现，植物受到胁迫时，由于Cl-的积累，能降低对NO3-的利用，从而致使P的利用率降低。而Dutt发现，盐胁迫时，Na+的积累，将降低植物体内K+、Ca2+和Mg2+的利用率。不过在Cl-和Na+可能引起的胁迫中，Cl-导致的盐害症状首先出现18，19。5植物抗旱基因工程5.1基于细胞信号转导和基因调控的抗旱基因工程 目前，利用 cDNA和寡核苷酸基因芯片技术在植物受到各种胁迫时的基因表达模式的研究，已经逐步揭示了植物在各种逆境条件下的调控网络20 。在拟南芥中已经发现了许多干旱应答基因，基本可以分为干旱应答基因 rd ( respon-sive to dehydration gene)和早期干旱应答基因 erd ( early re-sponse to dehydration gene)两类21-23。植物在水分胁迫下，基因表达水平上的应答至少包括四条途径，其中两条不依赖于 ABA,另外两条依赖于 ABA。在 ABA 缺陷型 ( aba)和ABA非敏感型 ( abi)拟南芥突变株中，一些基因也能够由干旱、高盐和低温诱导表达，表明这些基因在低温或干旱诱导下的表达并不需要 ABA 的参与，但却能够应答外源ABA的作用24。这类基因包括 rd29A ( lti78 ， cor78) ，kin1， cor616 ( kin2)及 cor47 ( rd17)，而在这些基因的上游启动子区，都存在一个干旱应答顺式作用元件 DRE /CRT( dehydration - responsive element/C - repeat)，这个顺式作用元件不但与植物的干旱应答有关，而且与低温和高盐应答基因的表达密切相关。在拟南芥中过量表达 DRE /CRT结合蛋白 DREB1 /CBF,使转基因拟南芥植株内 40多个逆境诱导基因的表达发生了变化，从而导致了转基因植株对干旱、高盐、低温的耐受性25-27 。5.2渗透保护物积累的基因工程渗透保护物质是在一定摩尔浓度下对细胞无毒的一类中性小分子，是一种能够抵抗渗透胁迫对细胞功能所造成的变性作用，稳定蛋白和细胞膜的物质。渗透保护物质是在能够耐受胁迫的生物体中自然积累的，而许多主要的农作物缺乏合成这种特殊物质的能力。由此，国内外学者设想利用基因工程的方法将这种渗透保护物的合成途径导入植物细胞中很可能是一种提高农作物胁迫耐受性的有效方法28。目前，通过遗传工程操作改变植物体内渗透保护物质的代谢途径而生成这类物质，如甘露醇、果聚糖、海藻糖、脯氨酸、糖胶甜菜碱等的积累，使植物提高抗旱性已经成为可能。但是这些渗透保护物质如何提供保护的机理还不是完全清楚29。通常这些渗透保护物质都是定位在植物细胞质中的，渗透保护物质积累的激活会减少细胞的渗透潜力，使细胞维持膨胀。但是，对于渗透保护物质积累的分子调控并不是使植物一直处在应对胁迫的渗透调节状态。另外一些应答也发生在干旱胁迫中，如胞内 ROS( reactive oxygen species)的清除，具有保护蛋白结构的分子伴侣及类似活性物质的诱导以及代谢解毒等30。6前景展望目前通过对植物转录水平，蛋白水平和代谢水平的研究，已经鉴定分离得到一些能够被干旱胁迫诱导的植物基因并且阐明了与其相关的信号转导和调控途径，此外，近年来在干旱胁迫和其他主要非生物胁迫信号转导途径之间交互关系上取得的研究成果为植物多重胁迫耐受提供了可行性。在过去 20年的时间里，我们在与抗干旱相关的基础研究中取得了很大的进步，如胁迫信号感知和转导，逆境相关的分子调控网络和高通量转化技术等，这些进步使得利用基因叠加或共转化获得多抗胁迫植株成为可能;近年来对调控元件遗传工程的研究不仅增加了植物在干旱条件下的存活率，还提高了作物在水分缺失环境下的产量;此外，组织特异性和干旱诱导启动子的获得和研究也为生产抗旱的转基因作物提供有利的支持。但是抗旱是由多基因控制的数量性状，其生理生化过程是各基因间以及基因和环境间相互作用、共同调节的结果。现在对于植物抗旱基因工程的研究仅仅是一个开始,在植物抗旱性研究中还存在一些问题，比如大部分的研究都是利用模式植物,而农作物的抗旱基因工程还处在早期研究阶段,在自然缺水条件下进行田间试验或正在检测的转基因农作物的数量还相当少;大部分对于干旱耐受的基础和应用的研究都是集中在植物发育阶段，而不是开花前后,但是,作物的生殖器官才跟产量相关,所以未来在生产干旱耐受作物的同时还应该对提高作物繁殖率进行更深入的研究。此外,对干旱胁迫下主要代谢途径的根本了解可以为将来耐旱作物的代谢工程提供方向和理论基础。最后,通过基因工程培育的抗旱作物最终还是需要通过田间种植来证明它们的应用价值。水资源正日益成为全球战略性资源，2世纪,水资源和能源一样,成为直接影响经济结构和布局,直接关系到经济、社会生态的可持续发展的核心资源。我国中长期科学和技术发展规划纲要 (2006-202年)已经把水资源列到重点领域及其优先主题上。为了减小水资源危机，通过基因工程改良作物的抗旱性具有非常重要的战略意义。随着分子生物学技术及研究手段的不断发展,以及各国对此研究的重视及资助力度的加大,用基因工程方法提高植物的抗旱性,必将会取得可喜的进展。参考文献：1 Urao T，Yamaguchi-Shinozaki k，Urao S. 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