石见穿中丹参素和原儿茶酸在大鼠体内的药动学研究.doc

编号： 牡 丹 江 医 学 院学生科研项目立项申报书学 科 分 类：药 学项目名称：石见穿中丹参素和原儿茶酸在大鼠体内的药动学研究 申请人： 所 在 学 院： 牡丹江医学院药学院 指导教师：高 静教授 填表日期： 2012.03.06 类 别：药 学科学发明创造学术研究科研调查是否推荐重点项目（由二级学院填写）：是 否是否重点项目（由科研处填写）：是 否牡 丹 江 医 学 院年月填 表 说 明1、 写申报书前，请先认真阅读牡丹江医学院大学生科研立项管理办法和相关通知。2、 填写申报书各项内容时，必须实事求是、明确严谨，并用黑色签字笔填写或打印。页面不够时可加页，不得破坏后面表格的完整和美观。对于填写不合要求、内容含糊不清、字迹潦草者，不予受理。3、 递交的申报书一式两份，在项目获准后申报书由学生处签署意见并存档，一份由申请人保留。4、封面总编号由学生处统一编写。5、该申报书纸张大小为A4纸，各单位或个人可以从学生处网站/xsc/Html/Main.asp下载中心中自行下载或翻印，但格式、内容、大小应与原件相同。申请人姓名性别民族出生日期所 在 学 院专业年 级项目名称石见穿中丹参素和原儿茶酸在大鼠体内的药动学研究电子信箱移动电话项目类别科学发明创造 学术研究 科研调查 一般项目 重点项目研究起始时间2012年 5 月 完成时间2013年12月 申请人参加科研的经历何年何月至何年何月参加的项目担任的工作申请承诺我承诺对本人填写的各项内容的真实性负责，保证没有知识产权争议。如获准立项，我承诺以本表为有约束力的协议，遵守牡丹江医学院大学生科研立项管理办法的有关规定，按计划认真开展研究工作，取得预期研究成果，按时结项。申请人签字：年月日项目组其他成员（不包括申请人和指导教师）姓名性别专 业年 级联系方式分工签名研究项目简介1、选题意义：国内外研究现状、意义。中药药代动力学对阐明中药作用机制及其科学内涵；设计及优选给药方案；促进新药研发和剂型改进等方面起着重大作用。中药药动学是近十多年兴起的中药药理学分支，是中药新药临床前研究的重要组成部分，为中药剂型设计、生产工艺路线的选择和质量的评价与监控提供了有效手段与方法。中药成分十分复杂，即使单味中药，其有效成分也有数种，而且多以复方给药，其有效成分及作用机制尚不清楚。中药药代动力学过程复杂，成分多样。本研究是以石见穿中丹参素和原儿茶酸药代动力学研究。通过高效液相色谱法，检测石见穿提取物中的丹参素和原儿茶酸在体大鼠体内药代动力学研究。为石见穿提取物制剂的开发提供理论依据。2、研究内容：本项目研究的基本思路和主要观点。石见穿系唇形科植物华鼠尾草( Salv ia chinensis beth. )的干燥地上部分。亦名紫参、小丹参、月下红、石打穿、紫丹花、红参根等，广泛分布于江苏、安徽、江西、湖北、湖南、广东、广西、四川、云南等地。性凉，味微苦、辛、平，归胃、肝、肺经。有清热解毒，活血理气止痛、散结消肿等功能。该药临床应用广泛，在肝炎、胃炎、妇科疾病等方面疗效确切，在恶性肿瘤的治疗中，石见穿取得良好的效果。石见穿中含有多种化学成分，酚酸类成分是其主要活性成分之一，本研究拟选用石见穿药中的2种酚酸类单体活性成分丹参素和原儿茶酸在大鼠体内的药动学研究进行研究。丹参素和原儿茶酸结构式如下： 图1. A丹参素、B原儿茶酸(1) 石见穿成分2种酚酸的HPLC的分析方法：建立丹参素和原儿茶酸的HPLC分析方法，并用HPLC测定石见穿中参素和原儿茶酸两个单体活性成分的含量变化。(2) 石见穿药中的2种酚酸类单体活性成分丹参素和原儿茶酸在大鼠体内的药动学研究进行研究：建立大鼠血浆中丹参素和原儿茶酸的HPLC分析方法，对石见穿药中的丹参素和原儿茶酸在大鼠体内的药动学进行研究。3、研究方式和进度安排：拟采用的研究方法、技术路线及进度安排。3.1拟采用的研究方法* 药材提取 取石见穿粉末( 40 目)，干燥至恒重，精密称取丹参 100.0 g, 以800.0 mL水浸泡 30.0 min，加热回流提取 2 次，每次 1.5 h。合并 2 次提取液，减压抽滤，滤液旋转蒸发至 50.0 mL，高效液相色谱法测得丹参素、原儿茶酸的含量分别。* 血浆样品处理 取空白血浆 0.2 mL，加入 20 L 10% 三氯乙酸水沉淀蛋白，加入 0.11 gL-1间羟基苯甲酸 10 L，涡旋 2 min，加 0.6 mL乙酸乙酯萃取，涡旋 2 min，8000 rmin-1离心 10 min，取上清液，重复 3 次。合并乙酸乙酯层，氮气保护吹干，加0.2mL流动相（甲醇-0.2%甲酸水溶液 15:85 ）溶解，0.45 m水系微孔滤膜过滤，4 冷藏备用。* 对照品、内标溶液的制备 精密称取丹参素（DSS）4.4mg，原儿茶酸（PA）1.4mg，用15%甲醇-0.2%甲酸水溶液溶于10.0mL棕色量瓶中，稀释并加至刻度，摇匀，制备成质量浓度分别为440.0，140.0mgL-1的 DSS，PA混合对照品溶液。精密称取间羟基苯甲酸适量，加水制备成110.0 mgL-1的内标溶液，4 保存，备用。* 空白血浆加标准供试溶液的制备 取 0.2 mL空白血浆，精密加入“对照品、内标溶液的制备”项下混合对照品和内标溶液各 10.0 L，按“血浆样品处理”项下样品处理方法处理，即得空白血浆加DSS，PA混合标准供试品溶液。* 给药与取血方案 取 SD 大鼠 18 只，随机分成 3 组，每组 6只，雌雄各半，给药前禁食 12 h，不禁水。按 10 mLkg-1量分别灌胃低、中、高剂量（合50、100、150mg/kg剂量）药液，分别于给药后10，20，30，45，60，75，90，120，180，300，480 min眼底静脉丛取血 0.5 mL，立即移入经肝素处理的 1.5 mL离心管中，3000 r/min离心 10 min，取血浆, 于 -20保存待测。* 色谱条件 Agilent C18色谱柱( 4.6 mm250mm，5.0m )；流动相甲醇 0.2% 甲酸水溶液 15:85；流速 0.8 mLmin-1；柱温 25；检测波长 280 nm；进样量50L。* 专属性及检测限 在拟定分析条件下，注入空白血浆供试品溶液和空白血浆加DSS，PA混合对照品溶液各50.0L，记录色谱图。对比空白血浆中的杂质是否干扰DSS，PA的测定。并测定检出限和定量限。图2. 空白血浆(a)、空白加混标(b)、石见穿提取液含药血浆(c)的HPLC图* 线性关系考察 精密吸取血浆 0.2 mL，加入适量 DSS，PA 混合对照品溶液，110.0 mgL-1间羟基苯甲酸 10.0 L，制得系列浓度供试品溶液按“血浆样品处理”项样品处理方法制备样品，在拟定色谱条件下进样 50.0 L，记录峰面积。以待测物峰面积与内标的峰面积比值为纵坐标(Y)，进样浓度为横坐标(X，mgL-1 )进行回归分析，得回归方程。 * 精密度和回收率 取空白血浆适量，加入适量 DSS，PA 混合对照品溶液，配制成系列浓度血样，按“血浆样品处理”样品处理方法制备样品溶液，在拟定的色谱条件下日内重复进样 5 次；将上述样品溶液在 5 d内连续测定 5 次，记录峰面积，分别计算日内，日间精密度和回收率。* 稳定性试验 取空白血浆样品，加入适量DSS，PA混合标准溶液，得到低、中、高浓度(1.0，2.5 mgL-1)的空白血浆加对照品溶液, 室温下放置4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0 h，按样品处理方法进行处理，在拟定分析条件下进样50.0 L，测定 3 个浓度的 RSD。* 血药浓度及药代动力学研究 取“给药与取血方案”下血浆样品50 L，在拟定的色谱条件下，按标准曲线丹参素、原儿茶酸在大鼠体内的血药浓度进行分析，以时间( t )为横坐标，血药浓度( c )为纵坐标绘制药时曲线。3P97药动学软件拟合房室模型，并计算其药代动力学参数，探究其在大鼠体内的分布规律。3.2 拟采用技术路线测定石见穿中参素和原儿茶酸含量统计分析、总结、形成论文石见穿药材活性成分提取分离建立大鼠血浆中丹参素和原儿茶酸HPLC分析方法对丹参素和原儿茶酸在大鼠体内的药动学进行研究3.3项目的进度安排预期时间研究进展202012年05月2012年09月查阅资料，设计实验，准备试验用品、试剂和材料。202012年09月2012年12月石见穿中丹参素和原儿茶酸在大鼠体内的药动学研究。202012年12月2013年03月实验结果处理、数据进行统计分析，并做出结果。202013年03月2013年12月完成并发表论文，结题。4、预期价值和成果形式：研究的理论创新程度或实际应用价值，结项提交的成果形式。4.1 研究的实际应用价值本论文以石见穿为研究对象，最终确定以石见穿中水溶性成分丹参素、原儿茶酸为指标性成分，利用高效液相色谱为分析手段，在已建立检测方法的基础上，通过丹参素、原儿茶酸在大鼠体内的血药浓度进行分析，计算药动学参数，探究其在大鼠体内的分布规律。为石见穿药材的体内药动学提供一定实验依据。4.2 研究的成果（1）据不同阶段的研究成果，整理成论文分期发表，拟在国家核心级学术期刊上发表章1-2篇。（2）根据试验结果，拟申请国家专利1项。（3）根据论文水平和质量，申报科技成果奖。5、研究项目有何创新、有何特点。1）建立了SD大鼠含药血浆中丹参素和原儿茶酸的HPLC分析方法。2）在已建立检测方法的基础上，对灌胃后的正常组大鼠进行检测，并用3P97对数据进行整理，计算药动学参数。3）在已建立检测方法的基础上，通过丹参素、原儿茶酸在大鼠体内的血药浓度进行分析，计算药动学参数，探究其在大鼠体内的分布规律。为石见穿药材的体内药动学提供一定实验依据。6、主要参考文献。1 许美娟,林永乐,石金城,等. 石见穿化学成分的研究J.中草药,1987,18(9): 46.2 金家隆. 石见穿汤治疗慢性盆腔炎80例J. 浙江中医杂志, 2000, 35(8): 337.3 高巍. 活血散瘀法治疗子宫内膜异位40例临床观察J. 中医杂志, 2000, 41(9): 545-546.4 李达. 丹参饮加味治疗子宫内膜异位性痛经J. 现代中西医结合杂志, 2001, 10(4): 347 - 348.5 奚嘉. 内异方治疗子宫内膜异位症临床观察J. 山东中医杂志, 2000, 19(10): 594-595.6 王业玲, 李占林, 刘涛, 等. 石见穿化学成分的分离与鉴定J. 沈阳药科大学学报, 2009, 26 (2): 110-156.7 康琛, 李曼玲, 王谦, 等. 石见穿化学成分的提取分离及定量分析J. 中国实验方剂学杂志, 2009, 15 (7): 1-3.8 郑海音, 徐伟, 郑晓燕, 等. 石见穿多糖的提取及其对肝癌细胞增殖的抑制作用J. 中国中医药科技, 2008, 15 ( 5):360-362.9 游勇基, 程广强, 陈铭辉. 丹参注射剂中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛和丹酚酸B的同时测定J. 药物分析,2004,24(1): 46-49.10 周芝兰, 耿娅, 付惠娣，等. 中药血清药理研究方法中几种血清预处理方法对消除正常血清活性的比较J. 中药药理与临床, 1999, 15(3): 46-47.11 韩瑛, 熊志立, 杨春娟, 等. 高效液相色谱法测定大鼠血浆中的原儿茶酸J. 色谱, 2007, 25(2): 207-210.12 庄燕黎, 晁若冰. 高效液相色谱法测定大鼠血浆中丹参素和原儿茶醛J. 药学学报, 1999, 34(8): 613-616.指导教师姓名高静性别女政治面貌党员职称教授所在单位牡丹江医学院药学院电子信箱电话138363689101、对申请人的专业基础、学风及研究能力的评价：该学生为XX级XX专业学生，在校期间能努力学习，勤于进取，成绩优异，思维敏捷、缜密，工作踏实，具备一定的实验操作能力。2、对申请课题的价值、研究方案的可行性、工作基础等方面的评价：该项目设计合理。试验方法及实验技术有具体成形思路，并进行了初步研究。1.具备天然药物化学和药代动力学实验室及常用的仪器设备、水、电和边台通风橱等条件。2.已有较完善的技术路线设计方案及实施手段。3.指导教师多年来一直从XXX方面的教学和科研工作，先后发表省级以上论文15余篇，主持省级科研立项XXX，参与完成黑龙江省教育厅XXX、黑龙江省卫生厅XXX的课题研究工作。指导老师（签名）： 2012年03月09日所在学院意 见 签章： 年 月 日 专家评审意 见同意不同意该项目为牡丹江医学院 学年学生科研立项