（优质课件）血流感染实验室诊断

血流感染实验室诊断新进展 1 内容 什么是血流感染 血流感染流行病学特点血培养流程优化提高阳性率分析培养结果减少污染分子生物学方法检测血流感染基于PCR的技术MALDI TOFMSPNA FISH 2 概念 感染 炎症 病原体全身炎症反应综合征 SIRS 体温 38 C或90次 分呼吸频率 20次 分 或PaCO212 109 L或10 脓毒血症 sepsis 感染 SIRS 血培养可以阳性或阴性重度脓毒血症 severesepsis sepsis 脏器功能障碍 组织灌注不良和低血压感染性休克 septicshock 3 概念 败血症 septicemia 病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征 是一种严重的全身感染 病原菌主要是细菌 也可为真菌 分枝杆菌等 菌血症 bacteremia 细菌在血流中短暂出现的现象 一般无明显毒血症状 在国外文献中常与败血症通用 血流感染 bloodstreaminfection BSI 败血症和菌血症目前统称为血流感染 4 血流感染 医院获得性血流感染原发血流感染实验室证实血流感染 Laboratory confirmedBloodstreamInfection LCBI 临床血流感染 ClinicalSepsis 继发血流感染 血培养分离出有意义微生物 而且此微生物与另一部位之院内感染有关 唯不包括血管或血管内导管装置所引起之血流感染 社区获得性血流感染 5 实验室证实血流感染 LCBI 标准一 从一次或多次血标本中培养出一种一致的致病菌 而且培养出的病原体与其它部位的感染无关 标准二 病人至少具有下列症状和体征之一 发热 38 C 寒颤或低血压 并致病符合下列之一 1 从两次或两次以上不同部位抽血的标本中培养出皮肤寄生菌 如类白喉杆菌 芽孢杆菌 丙酸杆菌 凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌 2 至少一次从带血管内导管的病人血标本中培养出皮肤寄生菌群 如类白喉杆菌 芽孢杆菌 丙酸杆菌 凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌 并且主管医生开始了适当的抗菌药物治疗 3 血中抗原检测阳性 如流感嗜血杆菌 肺炎链球菌 脑膜炎奈瑟菌或B群链球菌 与实验室阳性结果一致的症状和体征与其它部位的感染无关 标准三 年龄38 C 低温 37 C 呼吸暂停 脉搏徐缓 并具有下列之一 同上3点略 6 临床血流感染 ClinicalSepsis 具有下列二条件之一者 具有非其它已知原因所引起的发烧 血压过低 收缩压 90mmHg或收缩压低于平常超过40mmHg 少尿 每小时尿量低于30ml 等临床症状任何一项 且符合下列所有条件者 未做血培养 或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者其它部位无明显感染者医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗1岁以下婴儿 具有非其它书籍原因引起的发烧 体温过低 呼吸中止或心跳过缓等临床症状任何一项 且符合下列所有条件者 未做血培养 或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者其它部位无明显感染者医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗 7 BSI流行病学特点 BSI发病率逐年增加凝固酶阴性葡萄球菌 肠球菌 真菌血流感染发病率逐年上升 革兰阴性菌下降耐药菌比例逐年增加社区获得与医院获得血流感染病原谱存在差异院内BSI患者病死率高 8 美国脓毒血症流行病学 Martinetal NEJM2003 348 1546 9 加拿大CANWORD监测2002 2009 DiagMicrobioloInfectDis 2011 69 307 10 加拿大CANWORD监测2002 2009 DiagMicrobioloInfectDis 2011 69 307 11 美国49医院BSI病原谱 CID 2004 39 309 317 12 PUMCH2012年834血培养分离株 13 PUMCH2012年144株BSI大肠埃希菌药敏结果 ESBL60 2 14 PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌药敏结果 ESBL34 4 15 PUMCH2012年61株BSI鲍曼不动杆菌药敏结果 16 PUMCH2012年76株BSI金黄色葡萄球菌药敏结果 17 PUMCH2012年46株BSI草绿色溶血链球菌药敏结果 18 2011CHIF NET489株BSI酵母菌 19 2011CHIF NET念珠菌对氟康唑的敏感性 20 2011CHIF NET念珠菌对伏立康唑的敏感性 21 2011CHIF NET其他酵母菌对氟康唑的敏感性 22 2011CHIF NET其他酵母菌对伏立康唑的敏感性 23 采血量是影响血培养阳性率的独立相关因素 CLSIM47 A 每位患者采集2 3套血培养 40 60ml SurvivingSepsisCampaignGuidelines Worldwide 抗菌药物治疗前至少采集2套血培养英国NHS血培养标准 采集2套血培养 24 采血量对血培养阳性率的影响 JCM2007 25 采血量对血培养阳性率的影响 J Clin Microbiol 2011 49 12 4047 26 J Clin Microbiol 2011 49 12 4047 RoutineSet MayoClinic 2BACTECAerobicPlusBottles 1BACTECAnaerobicLyticBottle 采血量和阳性率 27 非条件致病菌 28 在多次血培养中单次培养下列细菌阳性凝固酶阴性葡萄球菌棒状杆菌微球菌丙酸杆菌芽孢杆菌如多次培养阳性 可能为条件致病菌 需结合临床分析 血培养污染菌 非条件致病菌 MayoClinic p 0 001 为什么需氧 厌氧 29 两种组合均能检测 不同的病原菌 J Clin Microbiol 2011 49 12 4047 表皮葡萄球菌血培养阳性意义 CID1997 30 血培养阳性时间 凝固酶阴性葡萄球菌 96 86 单瓶 需氧瓶 242厌氧瓶 72需 厌 150 31 血培养阳性时间 金黄色葡萄球菌 32 如何分析血培养凝固酶阴性葡萄球菌 UniversityHospitalofBase 2003 20073060阳性血培养 654CNS 粒缺患者除外232 35 真正BSI 422 65 污染BSI由感染科医生判断 至少一份血培养CNS阳性 有感染临床表现SIRS 体温 38Cor90 min 呼吸 20 min 白细胞 12or10 未成熟中性粒细胞32 患者有1瓶以上CNS阳性 BSI68 污染12 p 0 001 没有SIRS症状 BSI5 污染29 p 0 001 ClinMicrobiolInfect 2012online 33 单瓶血培养CNS的BSI和污染患者区别 ClinMicrobiolInfect 2012online 34 单瓶血培养CNS阳性BSI与临床症状相关性 ClinMicrobiolInfect 2012online 35 ClinMicrobiolInfect 2012online 36 降低血培养污染率 严格消毒 血培养瓶消毒 70 酒精消毒血培养瓶橡皮塞 待干60秒 或70 异丙醇消毒干燥皮肤消毒 三步法70 酒精擦拭静脉穿刺点 30秒1 2 碘酊30秒或10 碘伏消毒60秒 从穿刺点向外画圈消毒 直径 3cm70 酒精脱碘一步法葡萄糖酸洗必泰作用30s 或70 异丙醇消毒后自然干燥 但不适用于2个月以内的新生儿 37 急诊血培养污染率与工作量相关 TheUniversityofMichiganHealthSystem急诊血培养大多数由采血员采集 其次为护士和医生采血员 病人 1 9 重症区护士 病人 2 3 其它区域护士 病人 1 4年病人量82521人 采集血培养者7586人11 4 至少1瓶阳性 病原菌阳性率8 0 污染率3 7 多套培养患者阳性率7 4 单套培养阳性率5 1 p 0 001 污染率无显著差别 2 2 vs 2 6 SchuylerHalverson etal JCM 2013online 38 急诊小时工作量 SchuylerHalverson etal JCM 2013online 39 繁忙时血培养污染率增加 OR 1 23 OR 0 93 SchuylerHalverson etal JCM 2013online 40 抗菌药物治疗与血流感染死亡率 死亡率 Chest115 2 1999 41 血培养三级报告制度 血培养阳性 终报告 革兰染色 传种培养 初步报告 直接药敏 鉴定菌株 电话报告 鉴定 标准药敏 42 血培养结果回报对治疗的影响 A AppropriateTherapy 正确治疗 I InappropriateTherapy 不正确治疗 ClinInfecDis24 584 602 1997 43 血流感染快速分子诊断 分子诊断不受抗菌药物使用的影响血培养阳性后分子诊断直接使用血标本进行分子诊断快速但不能提供药敏结果 44 血培养阳性瓶分子鉴定 AntigoneKotsaki etal ExpertOpin Med Diagn 2012 6 3 209 45 阳性血培养 基于PCR的检测 PCR特异性检测病原特异性PCR特定耐药基因检测 葡萄球菌mecA 肠球菌van细菌载量 肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数广谱检测 PCR扩增特定靶位多态性分析测序后续基因检测种特异性real timePCR ExpertOpin Med Diagn 2012 6 3 209 CurrOpinInfectDis 2011 24 2 137 46 qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌 Target ecfXgene血培养系统 BacT ALERT 87瓶FA 13瓶FN 涂片均显示G b对照方法 氧化酶 API20EDNA提取 0 5ml肉汤 离心后加裂解液 水煮法定量PCR 扩增 Oligonucleotideprimers基因特异性检测 fluorescent labeledhybridizationprobes 152bpfragment AnnalClinMicrobiolAntimicrob2010 9 21 47 qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌 33瓶pae 敏感性和特异性均为100 1瓶kpn pae 由于pae 20CFU ml kpn 108CFU ml PCR 检测限 将ATCC27853ecfX基因克隆至TOP10E coli AnnalClinMicrobiolAntimicrob2010 9 21 48 阳性血培养 基于PCR的检测 最常见病原体多重PCR电泳谱 ELISA杂交 多重Real timePCRHyplexBloodScreen BAG Lich Germany 多重PCR ELISA 4 5 6h完成Prove ItSepsis Mobidiag Helsinki Finland 多重real timePCR 微阵列分析 检测多种病原及mecA 3h完成多重Real timePCR ExpertOpin Med Diagn 2012 6 3 209 49 血培养阳性 多重real timePCR NEWMICROBIOLOGICA 36 65 74 2013 50 血培养阳性 多重real timePCR NEWMICROBIOLOGICA 36 65 74 2013 51 血培养阳性 PNAFISH核酸荧光原位杂交 血培养阳性肉汤革兰染色PNAFISH 革兰阴性菌 商品化试剂盒eco kpn paeEfa 其它肠球Sau scnCal cgl 其它念珠菌报道Salmonellaspp 90minPNAFISH完成 ApplEnvironMicrobiol 2010 76 4476J Clin Microbiol 2013 51 4 1301JClinMicrobiol 2009 47 247 52 MALDI TOFMS 基质辅助激光解析电离 MALDI 原理 将样品分散在基质分子中形成结晶后直接进样 当用激光照射结晶时 基质吸收了激光的大部分能量 使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离 成为带电荷的离子 基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用 使样品带上正电荷或负电荷 成为带电荷的离子基质会干扰被检测分子质谱峰的大小和浓度 不同类型的分析物选择不同的基质 53 MALDI TOFMS 飞行时间 TOF 原理 离子源产生的离子在加速电场获得动能 当进入高真空无电场飞行管道并在此管道内飞行时 质量较轻的离子飞行速度快 早到达检测器 质量较重的离子飞行速度慢 晚到达检测器 因此依据离子的飞行时间与其质荷比平方根 m z 成正比的关系 通过测定飞行时间 计算出相应离子的分子量 54 MALDI TOFMS操作步骤 55 MALDI TOFMS快速鉴定阳性血培养 使用菌落 阳性血培养肉汤鉴定快速 20分钟 从报警到鉴定出结果 MALDI TOFMS Bruker BACTEC BD 正确鉴定 193 213阴性菌 包括厌氧菌 90 61 284 319阳性菌 89 02 80 9 复数菌正确鉴定出一种 7株缓症链球菌鉴定为spnMALDI TOFMS Bruker BacT ALERT bioM rieux 388个阳性瓶 种正确率91 包括念珠 厌氧菌 15瓶复数菌 使用通用库多鉴定出一种 革兰染色后使用阴性或阳性库分析 6瓶鉴定出第二种菌 ClinMicrobiolInfect2010 16 1631JClinMicrobiol2010 48 1542 56 MALDI TOFMS VITEKMS bioM rieux 以16s为金标准 980株临床分离株 ID正确率肠杆菌科97 7 非发酵菌92 葡萄球菌属94 3 链球菌属84 8 HACEK84 酵母菌85 2 57 JClinMicrobiol 2010 48 900 PCR ESIMS 广谱PCR ESIMS 电喷射质谱 189阳性血培养和45阴性血培养 种一致率98 7 6例spn标本方法阴性提供定量结果 评估病原体载量假阴性率24 几乎均由混合感染导致5 6h完成检测结合PCR的敏感性和ESIMS特异性可以直接检测标本 不需要培养 ProcNatlAcadSci 2005 102 8012 58 血标本分子检测 种特异性 属特异性 广谱 多重PCR 微阵列分析血培养阴性的苛养菌 如Bartonellaspp 巴尔通体 Coxiellaburnetii伯氏考克斯体 Mycoplasmaspp 支原体 Chlamydiaspp 衣原体 Ricketssiaspp 立克次体 Tropherymawhipplei 59 商品化分子生物学检测方法 血标本 SeptiFast Roche multiplexreal timePCR 种属特异性荧光探针 检测重要血流感染致病菌SepsiTestTM Molzym eubacterialandpanfungalreal timePCR a16Sand18SrRNAgene baseduniversalPCR sequencing 几乎可以鉴定所有细菌 真菌VYOO SIRSLab multiplexPCR 检测重要血流感染菌 电泳分离扩增片段Plex ID Abbott eubacterialandpanfungalPCR 质谱 几乎可以鉴定所有细菌 真菌 60 IntensiveCareMed 2011May publishonline SeptiFasttest检测的病原谱 BMJOpen2012 2 e0