环境微生物综合实验报告2015

环境工程微生物学综合性试验报告环境水样微生物学指标检测学院：资源与环境学院专业：环境工程专业班级：环境131班组别：环境微生物实验B组组员： 目录前言3实验目的和要求3采样安排4医学院采样点分布图4西安工业大学采样点分布图5医学院采样过程照片5西安工业大学采样过程照片6采样数据记录表6材料方法6实验所用主要仪器设备及试剂6仪器6培养基6实验原理与步骤7实验一7实验二7实验三8实验四9实验五9实验六10结果与分析11采样记录11水样总细菌群落测定11.大肠菌群检验初发酵结果的观察14平板分离及革兰氏染色结果记录16平板分离得到的阳性菌落的相应特征记录19复发酵结果的观察和大肠菌群数目的MPN统计20大肠菌群数目的MPN统计21参考文献21使用教材及参考书21环境工程微生物学综合性试验报告综合实验环境水样微生物学指标检测前言运用综合应用微生物学基本原理和基本实验技术，独立完成培养基的制备与灭菌操作及不同类型微生物的分离、纯化、观察、描述，可初步进行鉴定、分类（此步不作要求）。可以为污水、垃圾等生物处理进行相关的实验研究。实验目的和要求自来水、河、池、湖水、纯净水中微生物学指标的检测水样来源：西安工业大学湖水和西安医学院湖水1、基本内容l 学习水样的采样方法，采用平板菌落计数技术测定水中细菌总数；采用多管发酵法（MPN）测定水中大肠菌群。说明多管发酵法检测水样中大肠菌群的原理和操作过程。l 记录并报告实验结果。l 结果分析与讨论，经与国家标准比对检查，水质状况分析。2、基本要求l 全面掌握微生物实验基本操作技能；l 掌握水中细菌总数测定方法；了解水质与细菌菌落之间的相关性；l 了解总大肠菌群数量指标在环境领域的重要性；l 掌握测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。实验操作本实验需要的基本操作训练已经在前面的一些实验中学习过，在这里不再一一列出每一操作步骤。为了帮助预习，将有关操作名称列出，这些操作在建议参考书中都可以找到。1 培养基配制和灭菌2 无菌操作分离纯化3 细菌染色和显微镜使用4 菌落特征观察和描述5 系列稀释方法6 细菌鉴定指标测定采样安排内容安排：水样采集时间：11月27日上午（一部分组员采样，一部分组员准备灭菌器具和配制培养基）步骤和注意事项：1. 按照样品采集表（表1，见结果与分析）记录样点，编号，采样时间，天气，气温，水位，水质，现场监测项目(pH)，采样人姓名。并画出采样湖的平面图，图上标示出采样点位置。医学院采样点分布图西安工业大学采样点分布图2.容器应先用混合均匀的水样充分洗涤23次，然后正式取样；注意避免搅动沉积物而使水样受污染；采集表层水样时，应注意不能混入漂浮于水面上的物质。3. 采样时的照片记录医学院采样过程照片西安工业大学采样过程照片采样数据记录表见结果与分析材料方法实验所用主要仪器设备及试剂仪器1 显微镜 2 革兰氏染色用有关器材。3 高压蒸汽灭菌器。4 干热灭菌箱。5 恒温箱。6 冰箱。7 放大镜。8 试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中160灭菌2h。培养基1乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g 、氯化钠5g、 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml 蒸馏水1000ml2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制3 伊红美蓝固体培养基成分：蛋白胨10g 、乳糖10g 、磷酸氢二钾2g 、琼脂粉25g、蒸馏水1000ml 、2%伊红水溶液20ml、 0.5 %美蓝水溶液13ml 4 牛肉膏蛋白胨固体培养基胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1000ml、用1mol/LNaOH调pH至7.0、琼脂粉20g 实验原理与步骤实验一内容安排：水样采集时间：11月27日上午步骤和注意事项：1.按照样品采集表（表1）记录样点，编号，采样时间，天气，气温，水位，水质，现场监测项目(pH)，采样人姓名。并画出采样湖的平面图，图上标示出采样点位置2.容器应先用混合均匀的水样充分洗涤23次，然后正式取样；注意避免搅动沉积物而使水样受污染；采集表层水样时，应注意不能混入漂浮于水面上的物质。3.采样时的照片记录实验二内容安排：水样总菌落数测定及大肠菌群检验之初发酵实验时间：11月29日 9:00到12:00步骤和注意事项：一按照每组检测两个水样准备要进行灭菌的玻璃器皿和试剂，包括：1.进行水样总菌落数测定和大肠菌群检验初发酵实验的试管、移液管和三角瓶等。试管18支（水样总菌落数测定中稀释6个梯度需5支，两个水样一共10支；大肠菌群检验初发酵实验发酵管需4支，两个水样一共8支）；三角瓶2个（水样总菌落数测定中初次稀释需1个，两个水样共2个）；移液管10只（水样总菌落数测定梯度稀释需10ml一支，2ml的4支，两个水样共10支）；培养皿12个（水样总菌落数测定共涂板3个梯度，每个梯度2个板子，共6个，两个水样共12个）；2.准备培养基：a.供大肠菌群检验之初发酵和复发酵实验的普通乳糖蛋白胨培养液（每只试管5到10mL，一个水样3管，两个水样共6管，加上复发酵需用的，至少准备120mL，可以一次配制300mL，供2组使用）；b.供大肠菌群检验之初发酵实验的三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（每只试管5到10mL，一个水样1管，两个水样共2管至少准备20mL，一个班配制200mL，供全部小组使用）；c.供水样总菌落数测定的蛋白胨固体培养基（每只培养皿25mL左右，12个培养皿300mL，每组至少配制300mL）3.发酵管的准备：将4支洗净的杜氏小管装入4个试管中，2个水样共准备8支装有杜氏小管的试管，然后在其中的6支中灌入普通乳糖蛋白胨培养液，2支灌入三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（注意，将大试管倾斜45度左右或更大角度，慢慢注入培养液，使培养液在进入大试管的同时缓缓进入大试管中的杜氏小管中，并将杜氏小管中的空气挤压出去，若灌完培养液后仍有气体存在，可以用指头轻弹试管壁将之震出）；4.灭菌水的准备，每组至少准备500mL纯净水进行灭菌。二灭菌：1.将配制好的牛肉膏蛋白胨固体培养基和分装好普通乳糖蛋白胨培养液和三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管，以及剩下的未用完的普通乳糖蛋白胨培养液和三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液，还有之前准备好的各项玻璃器皿包装好放入灭菌锅进行高压蒸汽灭菌。灭菌完毕后，一部分人进行水样的梯度稀释（注意，初次稀释要进行大体积稀释，例如将20mL水样加入180mL灭菌水中；每一步稀释都必须保证将水样混匀，特别是在进行试管稀释时，切记）；同时，一部分组员进行牛肉膏蛋白胨平板的倒板工作（若选择直接倒板法涂板的可不用进行此部分）；稀释用的移液管要编号保存，后面涂LB平板的时候要对应吸取稀释的水样；2.大肠菌群检验初发酵管的接种：将10mL原始水样加入到装有三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，1mL原始水样加入1支装有普通乳糖蛋白胨培养液的发酵管中；稀释10-1和10-2的水样分别加入装有普通乳糖蛋白胨培养液发酵管中将接种完毕的发酵管放入37培养箱中培养24h到48h.3.水样总菌落数测定之涂平板：从10-3到10-6稀释梯度中选择3个梯度的稀释水样进行LB平板的涂板，方法可选用倒板法（在平板中加入1mL水样后倒入20mL LB培养基（培养基温度必须控制在40以下，倒板速度要快，防止倒板过程中LB固体培养基凝固）或涂板法（将1mL菌液加入到制好的LB平板上，再使用涂布器涂匀，涂布器每次使用前都要酒精灯干热灭菌，冷却后再涂板）；涂制好的平板放入37培养箱中培养24h到48h。实验三内容安排：水样总菌落数测定及大肠菌群检验之初发酵实验结果观察和记录时间：11月29日早上9:00到12:00（一部分组员进行实验二的结果观察和记录，一部分组员进行实验四的内容，先制作伊红美蓝培养基，清洗出计数后不用的培养皿（按照初发酵实验结果，有几个阳性结果准备几个培养皿）进行包裹灭菌，和制备好的伊红美蓝培养基一同灭菌）步骤和注意事项：1.水样总菌落数测定结果的观察（记录到表2中）菌落计数：肉眼观察，可用放大镜，可标记；必要时分区计数，菌落成片者作废。计算方法：a.某稀释度的菌落数=两平板菌落数取平均值。b.计数标准：选择菌落数在30-300之间的稀释度l 仅有一个稀释度在此范围：总菌落数=菌落数稀释倍数；l 有两个稀释度在30-300之间，两梯度菌落数之比（两个稀释梯度涂板后所长的菌落数的比例）2，选较小值作为菌落数进行计算，菌落数之比300，取稀释倍数最大者的菌落数进行计算；l 所有稀释度均30，取稀释倍数最小者的菌落数进行计算；l 没有任何稀释度在30-300之间，选最接近该范围者；c.结果单位：CFU/mld.稀释度选择及细菌总数结果记录2.大场菌群检验初发酵结果的观察按照表3进行初发酵结果的记录，产气变色、产气不变色、变色不产气和不产气不变色但变浑浊均为可疑阳性予以记录，不产气不变色也不浑浊为阴性记录，产气不变色不浑浊为操作失误。实验四内容安排：大肠菌群检验之平板分离实验时间：11月30日19:30到21:00步骤和注意事项：1.伊红美蓝固体培养基的配制按照课本上的方式配制伊红美蓝固体培养基，按照初发酵实验结果（有几个阳性结果准备几个培养皿）准备所需培养基量（每个平板20-25mL）；2.灭菌将准备好的伊红美蓝培养基以及倒平板所需的培养皿（按照初发酵阳性结果数目进行准备）；3.倒板将灭菌好的伊红美蓝培养基倒入灭菌培养皿完成制板；4.涂板或划线将初发酵实验中阳性管中的菌液稀释一定倍后(菌液浑浊度大的稀释倍数适当放大）吸取1mL稀释菌液进行涂板，或者直接使用接种环沾取初发酵阳性菌液进行平板划线，划线方式按图1进行，划线后的平板放入37培养箱培养24h。实验五内容安排：大肠菌群检验之平板分离实验结果观察、革兰氏染色和复发酵实验时间：12月2日10:00到12:00（一部分组员进行实验四结果的观察和记录并进行革兰氏染色，另一部分组员进行复发酵实验需用的普通乳糖蛋白胨培养液的准备，之后对灭菌后的复发酵管进行接种）步骤和注意事项：1.复发酵管的准备直接准备4个装有杜氏小管的发酵管，按照实验二的介绍加入实验二时剩下的普通乳糖蛋白胨培养液（每管5或10mL，若剩下的培养基已经受污染，则必须重新配制）。2.灭菌将步骤1中准备好的复发酵管进行灭菌。3.平板分离实验结果观察在灭菌等待过程中，进行平板分离实验结果观察，其中平板上的菌落若符合以下颜色特征则标记为阳性菌落。深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。4. 革兰氏染色挑取步骤3中的阳性菌落的一小部分进行革兰氏染色（步骤如下），记录结果。a用培养1824h的培养物涂片，涂层要薄；b将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后用水洗去；c滴加助色剂，1min后用水洗去；d滴加脱色剂，摇动玻片，直止无紫色脱落为止（约2030s），用水洗去；e滴加复染剂，1min后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。5.平板分离及革兰氏染色结果记录平板分离得到的阳性菌落的相应特征按照表4进行记录，并补充革兰氏染色结果。6.复发酵管的接种使用接种环挑取步骤4中革兰氏染色阴性的菌落的另一部分，直接接种于复发酵管中，注意做好编号记录，放入37培养箱培养24h。实验六内容安排：复发酵结果的观察和大肠菌群数目的MPN统计时间：12月4日8:00到10:00步骤和注意事项：1.复发酵结果的观察记录按照实验三中步骤2的方式进行复发酵实验结果（参照P418页产酸产气情况分析）的记录。2.大肠菌群数目的MPN统计依据步骤1的结果，根据附录六表3（P450页），报告总大肠杆菌群数。结果与分析采样记录表1水样采集记录表（1）西安医学院采样记录表观测项目水样编号1水样编号2水样编号3采集时间11:1211：3011:35采集时温度10.810.89.7采集地点ABC水体颜色淡黄色淡黄色淡黄色水体浑浊度轻度浑浊轻度浑浊轻度浑浊水体面积180平米180平米180平米水体漂浮物（有无大面积藻类）无无无水体pH值7.07.07.1水体周围环境（人员流动密度）较多较多较多（2）西安工业大学采样记录表观测项目水样编号1水样编号2水样编号3采集时间10：0010：0210：17采集时温度666水体颜色黄绿色黄绿色黄绿色水体浑浊度轻度浑浊轻度浑浊轻度浑浊水体漂浮物（有无大面积藻类）无无无水体pH值787878水体周围环境（人员流动密度）稀少稀少稀少水样总细菌群落测定医学院（稀释浓度依次为10-2 10-3 10-4）西安工业大学表2水样总细菌群落测定结果记录表稀释平均菌落水样来源稀释液及菌落数两稀释度菌落数之比细菌总数（个/g或个/ml）报告方式（个/g或个/ml）10-210-310-4西安工业大学-50-500000500000西安医学院-235356.71350000350000.大肠菌群检验初发酵结果的观察初发酵结果（照片）西安医学院西安工业大学表3初发酵结果记录表(1)医学院记录表管号是否变色是否有气体产生是否浑浊备注1 是是是可疑阳性2 否否是可疑阳性3 否否否阴性（2）西安工业大学管号是否变色是否有气体产生是否浑浊备注1 是是是可疑阳性2 否否是可疑阳性3 否否否阴性平板分离及革兰氏染色结果记录革兰氏染