【毕业学位论文】（Word原稿）芽孢杆菌PCR鉴定方法的建立和应用-微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 学位论文 芽孢杆菌 定方法的建立和应用 I 摘 要 准确快速鉴定产品中的微生物种类 是保 障 微生物肥料安全和有效的前提。传统的鉴定方法 存在一些不足的地方，费时费力，有时又准确度不高 ，分子鉴定方法是解决 微生物肥料质量 检测中菌种判定难、效率低 的有效途径 ，但目前应用仍较少 。本文 根据种 特异性基因序列设计引物，利用聚合酶链式反应（ 立一套简单 、 快速鉴定 7 种常见 芽孢杆菌 的 方法，从而为微生物肥料产品的质量和安全性 检验 提供技术支持。 1. 通过基因序列的 同源性 分析， 筛选出具有种（群）特异性的基因作为 靶序列。利用软件设计了 枯草芽孢杆菌 （ 、解淀粉芽孢杆菌 （ B. 、地衣芽孢杆菌 （ B. 、短小芽孢杆菌 （ B. 、巨大芽孢杆菌 （ B. 、蜡样群芽孢杆菌 （ B. 、胶胨样群芽孢杆菌 （ B. 引物，通过互联网比较分析得到 7 对具有种群特异性的引物。设计筛选的引物分别是 ：根据 据 因设计了引物 100 / B. 168/ 因的基础上设计的引物 引物 214/625，根据 16S 因设计了引物 415/ 引物 354/ 2. 采用设计的种特异引物，通过优化 应的 退火温度、引物浓度、 度等 关键因子， 分别建立了 不同种 （群）的特异 应体系。 经过 3 个属 15 个种的模式菌株和（或）标准菌株（共 41 株）的 实验验证，每个反应体系在 种（群） 内 均能扩增出目标条带， 而与 其他种群中无交叉反应 （仅短小芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌引物与部分菌株有阳 性反应），显示了良好的特异性 。 在灵敏度测试中，每个反应体系至少能检测到 100 度的基因组 枯草芽孢杆菌和胶胨样群芽孢杆菌的敏感性达到了 10高的灵敏度满足 定和检测菌种的要求，微生物含量较低的样品中也能扩增出目标条带。 术鉴定不仅可以准确鉴定不同种（群）的菌株，而且还能重新界定菌株的归属，在本文中将参考菌株 枯草芽孢杆菌中归类至解淀粉芽孢杆菌。 3. 在单重 础上分别建立 了 枯草群复合 应体系 （含四对引物） 和巨大 /蜡样群复合 系 （含两对引物） ， 其中枯草群复合 应可同时鉴定或鉴别枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌和蜡样群芽孢杆菌的复合 应可同时鉴定或鉴别巨大芽孢杆菌和蜡样群芽孢杆菌。 经过 3 个属 15 个种的模式菌株和（或）标准菌株特异性验证，复合 应具有良好的特异性和敏感性， 与单重 异性一致，只是灵敏度有所下降（约一个数量级），在 1001000 围内 ， 在大量、快速鉴定 和 鉴别枯草群和巨大 /蜡样群芽孢杆菌中具有重要意义。 4. 对产品中 23 株枯草群菌株、 10 株巨大芽孢杆菌和 蜡样群芽孢杆菌、 10 株疑似胶胨样群芽孢杆菌的基因组 行的 增结果和典型生化实验结果显示： 所有枯草群菌株均有扩增产物，依据产物大小判断的菌株分类地位与生化实验结果一致，巨大和蜡样群菌株亦是如此；疑似胶胨样群菌株中有扩增产物的菌株表现典型的培养特征和菌体特征，而非胶胨样群菌株则无扩增产物，在菌落或菌体方面与其存在显著差异。因此 特异 术用于鉴定生产菌种准确可靠， 有良好的应用价值。 5. 通过产品特征的分析和研究，建立了产品洗涤、菌体悬浮、珠式破碎、酚 异丙醇抽提的 微生物肥料产品 取方法 ， 解决了微生物肥料中腐植质含量高难去除和芽孢难破壁的取难题 。使用该方法获得的样品 无色或浅棕色，大小约 9过 增，液体样品的 敏性 达到 104FU/固体草炭样品灵敏度达到 107 虽然该方法失较多，敏感性稍差，但是成本低，效率高，可直接用于 为 法直接检测产品提供了前提条件。 6. 利用 以上 取技术获得 16 个 微生物肥料产品 的 经过特异 增，除了两个产品中一种目标微生物含量太低（低于检测限）无扩增产物外，其他产品均有 目标菌的扩增产物，根据扩增条带的大小对产品的鉴定 与传统分离培养及生化 鉴定结果一致，而且 应的特异性没有受到产品中其他微生物的干扰。实验结果表明 本文建立的种（群）特异 术 和 取方法可用于微生物肥料产品的直接检测 ，在提高微生物肥料的检测水平和检测效率方面有着巨大的应用潜力。 通过大量参考菌株和生产菌株以及微生物肥料产品的试验表明：基于序列分析和种（群）特异引物的基础上建立的单重 复合 法，在鉴定 和 鉴别 7 个种（群）的芽孢杆菌菌株上具有快速、准确、敏感的优点，该方法不仅能够用于纯菌 株 的鉴定 和 鉴别，在含有复杂微生物群体和基质的微生物肥料产品中也具有良好的应用前景。 关键词 ：特异 种鉴定 /检测，芽孢杆菌，微生物肥料 he in of be to of F of to in a CR to F By of of 6S of or B. B. B. B. . . B. . B. . . . 100 /. 168/B. . 214/625 . 415/ . 354/6S of of on of or CR by NA 3 5 . . CR on at 00 pg NA of . . 0 . . by on of 3 5 of CR as . . B. B. . of B. B. . . B. B. . of CR 00 1000 of 23 . 0 . B. 0 . of of CR F by Kb 04FU/mL in F 07 in IV to of 6 MF CR to CR by in F. It a of F V 目 录 第一章 绪 论 . 2 究目的和意义 . 1 内外分子生物学检测细菌的研究进展 . 2 论文研究的内容、方法和技术路线 . 10 第二章 芽孢菌鉴定的单重 术的建立 . 12 验材料 . 12 验方法 . 15 果与分析 . 19 论 . 30 章小结 . 33 第三章 芽孢菌鉴定的复合 术的建立 . 34 验材料 . 34 验方法 . 34 果与 分析 . 35 论 . 38 章小结 . 39 第四章 术鉴定芽孢杆菌的应用研究 . 40 验材料 . 40 验方法 . 40 果与分析 . 41 论 . 44 章小结 . 45 第五章 术在微生物肥料产品中的应用 . 46 验材料 . 46 验方法 . 47 果与分析 . 49 论 . 54 章小结 . 55 第六章 结论 . 57 参考文献 . 59 致 谢 . 64 作者简历 . 65 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 苄青霉素 基对 氧核糖核酸 磷酸脱氧核糖核酸 化乙锭 二胺四乙酸 硫氰酸胍 丙基 大或然数 合酶 链式反应 二烷基硫酸钠 醋酸 冲液 （羟甲基）氨基甲烷 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 究目的和意义 随着农业的可持续发展和社会主义新农村建设力度的加大，微生物肥料 在培肥地力、提高化肥利用率、修复土壤、促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用、提高农产品品质等方面 的作用 受到 更多的重视。 近 三十 年我国微生物肥 料行业发展迅速，产品种类不断增加，而产品的核心 特定的微生物 已达 100 多种。种类繁多的菌种拓展了微生物肥料的应用范围，提高了作用效果，同时也给 微生物肥料生产企业的质量检验和 微生物肥料产品的质量监督和检验带来了新的考验。例如，多个企业使用相同的菌种，而同一菌种的不同菌株即使在同一种培养基上也可能表现出不同的菌落形态；或一个企业使用多个菌种 /菌株，这些菌株 有 可能菌体相同而菌落形态完全不同 。这些菌株中有作用效果较好的菌种，也有存在生物安全隐患的菌种，必须对所有菌种进行的 准确 识别和 判断 ，否则容易引起产品质量误判，甚 至造成病原菌的大规模扩散。 芽孢杆菌在自然界中广泛存在，许多芽孢杆菌有溶磷和（或）解钾的能力，同时菌体中的芽孢对不良环境具有一定的抗逆性，易于生产、储存和运输，已经成为 许多 企业首选的生产菌种。在生产中广泛使用的枯草芽孢杆菌 （ 、地衣芽孢杆菌 （ B. 、解淀粉芽孢杆菌 （ B. 、短小芽孢杆菌 （ B. ，从系统发育上看属于同一个进化分支，这四种 芽孢菌 的菌落形态复杂多样，菌体大小相近，在实际样品检测过程中 很难进行准确 判定 ；而在 速鉴定系统中几种菌 相似值经常很高， 采用 测定群容易定种难；应用 16S 列分析的方法也不能根本解决 枯草芽孢杆菌 与 地衣芽孢杆菌 和 解淀粉芽孢杆菌 之间的菌种识别问题， 因为三个菌种的 16S 似性达到 (et 1991)。 生产中常用到的菌种除了芽孢杆菌属的菌株外，还常见类芽孢杆菌属和短芽孢杆菌属的菌，如固氮类芽孢杆菌（ 多粘类芽孢杆菌（ P. 侧孢短芽孢杆 菌（ ，这些菌种在菌落或菌体与芽孢杆菌虽然在菌体的不同阶段（即芽孢囊阶段）与芽孢杆菌属的菌株有区别，但在其他阶段则难以区分，将这些菌株作为实验材料探索快速、准确方法有利于 法的推广和应用。 巨大芽孢杆菌 （ B. 和蜡样芽孢杆菌 （ B. 作为 常用 的溶磷细菌，具有 较 强的溶磷能力，在生产中应用多，效果也比较明显。蜡样芽孢杆菌以其菌体繁殖速度快、成孢迅速的优势深受企业青睐。根据 109生物肥料生物安全 通用技术准则的规定，在生产中不能使用具有溶血反应的菌株，蜡样群 芽孢杆菌 （ 包括 蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌 （ B. 、蕈状芽孢杆菌 （ B. 和炭疽芽孢杆菌 （ B. ）菌株都有溶血反应，已 禁止 使用。巨大芽孢杆菌和蜡样群芽孢杆菌在菌体和菌落形态上非常相似，菌种的 鉴定 不准确易引起安全问题。 胶胨样群芽孢杆菌 能 分解硅酸盐类物质，是微生物肥料生产中最常使用而且效果很好的菌种。胶胨样群芽孢杆菌包括胶胨样芽孢杆菌 （ B. 和土壤芽孢杆菌 （ B. ，这两个种在无氮培养基上形成透明的玻璃珠状的大菌落，菌体为一至数层多糖粘液包裹。土壤中形成透明菌落或产生荚膜的菌种很多，其中一些为禁止使用的菌种，如肺炎克雷伯氏菌 （ 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 、产酸克雷伯氏菌 （ ；还有一些需要做急性毒性试验（ 菌种，如环状 类 芽孢杆菌 （ P. ，而这些细菌与胶胨样群菌株在菌落形态或菌体形态上不容易区分，所以准确区别和鉴定胶胨样群芽孢杆菌是保证该类产品安全的前提。 传统的微 生物鉴定方法主要采用形态观察和生理生化实验，需要花费大量的时间和精力，在样品的快速检测中受到了很大程度的限制。分子鉴定菌种是近年来人们 新发展 的方法，这种方法不受环境 影 响、微生物数量、形态、发育阶段以及生存状态的影响，通过简单的聚合酶链式反应，以目标微生物的遗传物质 模板、扩增目标序列，通过分析扩增产物大小、碱基组成、核酸排列顺序等判断微生物的种类，甚至可以测定目标微生物的数量。分子生物学方法不需要昂贵的仪器设备和种类繁多的化学试剂，仅需对样品或菌种进行简单处理（利于 取）即能获得理想结果。分子鉴 定技术兼具有快速、准确、敏感和经济的优点，在微生物 肥料产品的 菌种鉴定方面有巨大应用价值。 分子生物 学方法在在基因诊断、流行病学调查和食品安全等方面已经广泛应用，但是在土壤微生物方面的应用还较少。本文针对以上提到的三个类群的菌种应用分子生物学方法进行分析和研究， 试图 建立一种快速有效的分子鉴定方法，以解决在微生物肥料样品检测过程中常出现的因菌落形态、菌体、生理生化特性相近而无法进行准确识别菌种的难题，为鉴定微生物肥料产品中常用菌种提供理论依据， 为产品的质量和安全监督提供 快速、准确和可靠 的方法。 内外分 子生物学检测细菌的研究进展 人们日常接触的微生物种类复杂多样，其中不乏一些容易引起人类各种疾病的病原菌，如沙门氏菌、 出血性大肠杆菌 伤寒沙门氏菌、 黄色葡萄球菌等。 随着微生物肥料产品中使用菌种的不断增加，有可能将对人、动物或植物不安全的菌种引入生产中，进而引发环境和安全问题，一旦由于把关不严，将机会性病原或病原微生物作为生产用菌种其后果将会十分严重。国内过去曾有将铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）作为生产用菌种，以致发生传染、导致重大事故的教训。国内外对使用菌种的安全性非常重视，不同的国家有不同 的要求， 安全、有效 是基本原则。 因此，确认每一个菌种的分类地位就显得非常重要。只有在了解微生物特性的基础上，才有利于微生物菌种功效的发挥和利用，尽可能减少人为的向生产、生活中引入病原菌，这也是生产单位、科研部门以及管理部门的责任和义务。 微生物分类和鉴定的方法多种多样，如传统分类法，数值分类法和脂肪酸甲酯分析技术（ 自动化检测、基于遗传物质的核酸序列分析技术等。经典的传统分类法和数值分类法，虽然耗时和繁琐，但因不需要昂贵的仪器和设备，仍然是使用最 多最广泛的方法。脂肪酸甲酯分析技术主要根据细胞壁脂肪酸的气相色谱图，经过计算机处理并与已知菌株的色谱图进行比较，实现对细菌的快速鉴定。自动化检测系统通常利用微生物的生理生化特性、化学结构成分，设计成高通量、标准化的快速检测技术，如法国梅里埃公司的 菌鉴定系统和美国 菌鉴定系统是最常用的仪器，但这些仪器设备较为昂贵，鉴定成本较高，一般实验室较难配备；并且对有些细菌只能鉴定到属，到种水平比较困难。分子生物学在近年来发展很快，已经是研究微生物分类和应用等领域的实验室的必 需设备，基于遗传物质的核酸序列分析技术已经成为微生物分类和鉴定的重要手段。几种常用分子生物鉴定方法的特点见表 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 表 几种常见分子生物鉴定方法的比较 /对比分析 of in 方法 难易 解释 分析 分辨力 需要时间， d 实验室内重复性 实验室间重复性 设备和材料费用 每个实验的费用 序列测定 难 中等 高 2 好 好 高 高 易 易 中等 1 好 好 中等 低 易 易 高 1 好 中等 中等 低 易 易 高 1 中等 差 中等 低 等 易 高 2 好 好 高 中等 特异 易 易 高 1 好 好 中等 低 寡核苷酸探针 中等 易 高 1 好 好 中等 低 基因芯片 中等 易 高 1 好 好 高 高 核酸序列分析在微生物分类和鉴定中的作用 研究细菌进化和亲源关系的重要指标，它含量大（约占细菌总 的 80%）。 中高度保守，有 细菌化石 之称，是细菌系统分类中一个最常用和最有用的分子钟。从 16S 因序列分析发现，它的 1540 个核苷酸是由保守区域和变化区域交替排列而成， 16S 10 个可变区，不同细菌甚至同种细菌的不同菌株之间都存在不同程度的差异( ， 1996)。利用软件分析各种微生物间碱基序列的差异，通常将 16S 列的相似性大于 97%视为同一个种（ et 1995）。直接利用遗传物质为微生物分类，摒弃了以前因培养条件、培养方式 等原因造成的菌株表观的差异，也为那些不可培养的细菌提供了鉴定依据。 16S 因序列测定法创造了一个全新分类理念和思维方式，已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法 (， 1996； A， 1993)。在公开发布的核酸数据库中已经有 21639 个16S 序列（ 截 止 2007 年 02 月 14 日 ），为大量使用该方法提供了前提和保障。目前，使用这个方法已经为很多菌株细菌确定了分类地位，理清许多分类系统混乱的现象，更正了一些菌株的分类错误（焦振泉， 1998）。 16S 列测定在各个领域得到了广泛应用，但在鉴定一些种时也显得无能为力，因为1500碱基在细菌整个基因组 106基当中的比例毕竟还是相当小的，有时不能代表整个细菌基因组的变化 (. 2005； K. S. 2004)。 K. S. et 2004)用通用引物扩增了 16S 分序列，测序后发现， 100%，其中 B. 支和新发表的两个种 B. B. 列一致性为 100%。 B. 中 B. B. B. B. 列只存在一个碱基的差异，相似性在 远远不能满足新种的要求。 23S 为 16S 因特点类似，进化上相对保守，全长序列有 21 个保守序列，其间分布着很多高度变异区，保守区和部分变异区内存在大量 马赛克 变异序 列，高度保守区相对较少。由于序列相对较长储存的信息量大，现在渐为人们采用。很多研究人员根据保守区和变异区设计引物来分辨微生物，有人研究比较了 21 属 46 种病原微生物的 23S 列，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 其构建的系统发育树分析结果与 16S 分析结果是一致的 (洪帮兴， 2004； 2000)。 当人们发现许多 16S 因序列差异不明显时，开始关注其他基因序列在分类上的使用价值。由此一些基因序列也逐渐用于微生物的分类，如 因， 因， 因、 16因区间（ ，这些基因有着与 16S 因相似的特点，即存在较为保守的区段但序列的变异性更大（ ， 1998； i， 2001； 998； A， 1993； 2001； 2001） 。 细菌 旋酶由 个亚单位组成，酶的活性结构是由 2 个 A 亚基和 2 个 (。 有 1400 个碱基，碱基替换频率较高， 16S 平均碱基替换率是每 5000 万年 1%，而 每 100 万年 因的变异速度也较其他蛋白质速度快，其序列分析可应用于种水平的鉴定 (， 2003；侯晓丽， 2005)。 因序列较长（约 有着与 似的特点，也已经用于菌株的多样性分析 (. 994)。 因是编码 合酶的 亚单位，是细菌鉴定和序列多态性分析的一个标记序列，而且 因是一 个高度保守的看家基因，在所有细菌种类中均有一个拷贝，在细胞代谢过程中起着重要的作用（侯小丽， 2005）。 码 亚单位）一起组成 合酶五聚体接触反应中心，根据该基因的碱基差异，已经被用于 菌属鉴别和系统发育分析 (i， 2001； 2004； S， 2003)。 原核生物中， 因位点 (括 5S 16S 23S 个基因，分散排列在染色体上，其间插入有许多间隔序列，这些间隔序列在不同种属细菌之间显示出长度和碱基的差异，长度的差异通常是由于其间夹杂有不同数目的 不同的 导致，同时这种差异性在不同种属细菌之间也是高度保守的 (1998)。国外研究证明 16进化 率要强于 16S 因 10 倍，同时具有保守性和可重复性的特点，已经用于菌种鉴定，在菌株的分型上作用尤为明显 (1996； ， 1996)。 因具有串联重复和多态性特点，已经被用于炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌分子分型的研究，建立相关多态性数据库，用于菌株的溯源研究。 15 株蜡样芽孢杆菌的 子分型与传统生化试验分型结果相同，甚至比生化分型更细 (扈庆华， 2003)。因此， 因序列更适用于菌株的分型和种以下水平的鉴定。还有一些基因由于其突变发生的频率高， 在种类鉴定、生物多样性研究和菌株分型以及抗药性研究等方面广为采用，如 因等 (， 2001; ， 1998)。 随着核酸测序成本的降低，测序准确性的提升，核酸序列分析为细菌的鉴定提供了非常便利而有效的方法。从网上公开发表的基因序列看，主要以 16S 因为主，其它基因序列的数据很少，一些新分离到的菌株因无与之相似的序列比较，无法了解该菌种的系统发育情况。而一些已经发表的核酸序列菌株的具体分类地位还值得商讨，所以以此为参考对未知菌株进行系统发育分析，其结果的 准确性更加不可靠。因此，核酸序列分析技术在菌种分类和鉴定方面的使用受到了一定的限制。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 纹图谱分析用于细菌的分类和鉴定 列的碱基排列顺序可以用于微生物的系统发育和分类地位的研究，基于基因组和功能基因序列的特点建立的 16S23S 长度多态性指纹图谱分析方法，已广泛应用于细菌的分类和鉴定中。 使用不同的引物以细菌基因组 模板进行 增，然后对扩增产物进行酶切和电泳（各种不同电泳条件、电泳介质），不同的属、种甚至同种的不同菌株 可呈现出不同的图谱多态性，好象人的指纹一样，通过软件分析与数据库中的指纹图谱比较，找出最接近的谱型确定细菌的分类地位。下面介绍几种常用的指纹图谱分析方法。 机扩增多态性 1990 年建立的采用核苷酸序列的随机引物进行基因组 增，非特异性引物可以结合在模板 多个位点，产生多个 物，采用琼脂糖凝胶电泳将产物分离开，将每株菌在每条引物下扩增后产生的图谱合成为针对某一株菌的单一图谱，再通过软件进行聚类分析 。细菌种、株间基因特异性可通过获得 断大小、数量以及条带强度来确定。 （ 2002）用一 对来自 16S 因的引物 进行 增 ，产生了 其他参试菌株的指纹图谱。 菌株产生了相同的条带数目，而与其他参试菌株的图谱不同，从而可以对 菌株进行检测。 于区分亲缘关系近的细菌非常有效。 1999）利用 术研究如何将 区分开时，发现引物 扩增出一条 838产物，对于 个种具有群的特异性，对扩增产物用 的其他种区别出来。 酶切图谱不仅能容易的将蜡样群的不同菌种分开，甚至能将 127 分在不同的分子群中。 （ 1994）使用 42 对随机引物对 22 个黄单胞属的不同种和致病变种进行 增，通过图谱分析发现三对引物均可从 扩增出一条 片段来，而且在其他测试菌株上无此片段。研究者将此片段进行测序，设计出一对专一性非常强的引物，能将 X. 其他黄单胞菌种和致病变种甚至一些腐生菌快速的检测出来。 与其他方法相比较， 法快速，区别程度高，不需要对基因组 更深入详细的了解，其引物没有种属界限，同一 套引物可以用于任何物种的检测，具有广泛性和通用性 (2000)。但引物的选择需要很好的经验，而且此方法的结果可重复性差，近年来一般不单独使用。 制性片段长度多态性 制性片断长度多态性技术是 1974 年由 创立的。不同细菌有其独特的核苷酸序列，用同一种限制性内切酶切割不同细菌基因组 物后会产生不同长度的限制性片断，酶切片段的大小和数目都是特异的，这种 限制性片断长度多态性可通过电泳分析表现出来，可以做为这种细菌的 指纹 。 为检测细菌种内或种间 平的最敏感的方法之一，近年来已应用于微生态细菌，尤其是双歧杆菌分类及根瘤菌分类当中。 可显示各菌株之间 异，这使得 以为菌株分群（幺山山， 2003）。 et 2004）中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 在对 16行 发现， 用 16S