【毕业学位论文】（Word原稿）日本血吸虫性别差异蛋白质组及抱雌沟蛋白基因功能研究预防兽医学论文

密级 论文编号 : 中国农业科学院 学 位 论 文 日本血吸虫性别差异蛋白质组及抱雌沟蛋白基因功能研究 on on 国农业科学院博士学位论文 摘要 I 摘 要 血吸虫病分布广泛，危害严重，为人畜共患的重大疾病之一。雌雄虫合抱是血吸虫雌虫发育成熟和产卵的关键， 成熟雌虫所产生大量虫卵而引起肝脏病变是造成宿主主要病理损害和疾病再传播的前提。 本论文针对此特点开展了日本血吸虫性别差异蛋白质组和雄虫特异性表达的抱雌沟蛋白基因的功能研究，以探索血吸虫雌雄虫合抱、发育成熟的分子机理，开拓免疫预防新途径。 一、 关于日本血吸虫性别差异蛋白质组研究 。本研究利用蛋白质组学技术首次对日本血吸虫虫卵、童虫（ 14 天）、成熟雌虫和成熟雄虫的可溶性蛋白、疏水性蛋白和膜蛋白进行了系统 分离，构建了各自的高分辨率双向电泳图谱。表明虫卵、童虫、成熟雌虫和成熟雄虫在可溶性蛋白组份分别分离到 1016 67, 1808 89, 1142 45 和 1288 32 个蛋白斑点；在疏水性蛋白组份分别分离到 1425 108， 952 59， 847 75 和 965 69 个蛋白斑点；在膜蛋白组份分别分离到 78 3、67 3、 108 4 和 122 4 个蛋白斑点 。比较分析获得合抱后雌雄成虫特异呈现的性别差异蛋白质谱，雌雄成虫分别独特呈现 23 2 和 41 4 个可溶性蛋白斑点； 26 3 和 11 1 个疏水性蛋白斑点； 4 和 5 个膜蛋白 斑点。鉴定了 28 个合抱后雌雄成虫特异呈现的蛋白。结果提示参与细胞间信息传递的信号分子、参与基因转录和蛋白翻译调控分子和参与代谢酶类、发育调节因子等在合抱后雌雄虫呈现表达差异。本研究为深入揭示雌雄虫合抱后虫体的发育、雌虫成熟产卵的机制提供了分子基础，对开发新的疫苗候选抗原和药物靶标具有重要价值。 二、 关于日本血吸虫抱雌沟蛋白基因的功能研究 。抱雌沟蛋白为血吸虫雄虫特异性表达，在与其合抱的雌虫体表广泛分布一种性别特异性蛋白。本论文利用 扰技术对抱雌沟蛋白基因的功能进行了研究。根据日本血吸虫抱雌沟蛋白基因序列 设计 3 对 子（ 分别按低和高浓度（ 50 200入培养体系以干扰抱雌沟蛋白基因的表达。利用 免疫荧光分析证明能显著抑制抱雌沟蛋白基因的转录，可高达 84%。又分析了 子干扰的剂量效应，结果表明 子（ 制抱雌沟蛋白基因具有剂量依赖性，当 子终浓度为 100用 7 天时，抱雌沟蛋白基因的转录水平降低 75%。对虫体雌雄虫合抱效应的观察表明，干扰后雌雄合抱受到不同程度的影响，其中两个高浓度干扰组（ 合抱现象完全受到抑制。利用扫描电子显微镜分析合抱完全受到抑制的雄虫抱雌沟表膜结构，与对照组相比其结构呈现瘠的间断，瘠间隙大和刺短的变化。进一步利用 阵列对干扰抱雌沟蛋白基因后引起的虫体相关基因表达变化进行了初步探索，结果显示参与信号转导和转录调控因子功能的基因呈现表达下调，参与膜转运、能量和离子代谢及应激蛋白等基因呈现表达上调。通过上述研究发现抱雌沟蛋白基因具有影响血吸虫雌雄虫合抱功能，本论文结果也是国内外首次明确某种物质能影响雌雄虫的合抱，对于开拓抗血吸虫发育生殖新途径的理论基础和实践 应用具有重要意义。 本研究还采用尾静脉动态注射技术将 子导入到血吸虫感染的小鼠体内。结果表明在中国农业科学院博士学位论文 摘要 物体内血吸虫抱雌沟蛋白基因的转录和表达明显降低，雌雄虫的合抱受到显著抑制。据作者查询所知，这是在动物个体水平上实现利用 术成功干扰寄生虫基因功能的首例，揭示了基因治疗用于血吸虫病防治的可能性。 三、首次克隆获得日本血吸虫真核翻译起始因子 5 基因的完整 并进行了产物表达和动物免疫保护效果的评估，结果显示有一定的免疫保护效果。 关键词：日本血吸虫，雌雄虫合抱，蛋白质组， 雌沟蛋白基因，真核翻译起始因子 5 基因 中国农业科学院博士学位论文 摘要 is an of is of a of in of of on of by in NA in to of 1. of by 016 67, 1808 89, 1142 45 288 32 1425 108, 952 59, 847 75 65 69 8 3, 67 3, 108 4 22 4 of 42 1 4 3 2 11 1 6 3 S S to 2 6 a of in of of of or 2. of is in in to of 4% in in s1,of 国农业科学院博士学位论文 摘要 IV of on of in of on of be 5% of 00 of by of of On of of in in of is To it in of of in to of of to an in 00 by by of of as of To it of NA in NA us a 3. of by a of 国农业科学院博士学位论文 目录 1 目 录 中文摘要 . 英文摘要 . . 第一部分 引言 . . . 1 第一章 前言 . . . 1 第二章 蛋白质组学研究技术及其在寄生虫学中的应用 . .三章 血吸虫发育调控的信号转导研究进展 . . 8 第四章 术及其在血 吸虫研究中的应用 . . . 12 第二部分 研究内容 . 一篇 日本血吸虫性别差异蛋白质组研究 . . . .一章 日本血吸虫合抱后性别差异蛋白质组研究 . . . 二章 日本血吸虫虫卵、童虫和雌雄成虫膜蛋白的双向电泳 . .二篇 扰日本血吸虫抱雌沟蛋白基因的功能研究 . . .一章 扰日本血吸虫抱雌沟蛋白 基因影响雌雄虫合抱的研究 . .二章 动物体内的日本血吸虫抱雌沟蛋白基因 扰研究 . 三章 日本血吸虫抱雌沟蛋白基因 扰的 量研究 . . .四章 日本血吸虫抱雌沟蛋白基因作用相关分子初探 .三篇 日本血吸虫编码翻译起始因子 5 基因 克隆、表达和功能 分析 .国农业科学院博士学位论文 目录 2 结 论 考文 献 谢 101 附 录 102 附录 1 日本血吸虫合抱后雌雄虫特异呈现的性别差异蛋白谱 103 附录 2 日本血吸虫合抱后性别差异蛋白质谱鉴定图 106 附录 3 部分代表性论文 . .者简介 173 中国农业科学院博士学位论文 引言 1 第一部分 引 言 第一章 前 言 血吸虫病（ 由血吸虫（ 染引起的一种严重危害人畜健康的寄生虫病，仅次于疟疾的第二重要热带病。全球 76 个国家和地区流行，共约 2 亿患者， 6 亿人群受威胁（陈名刚， 2002）。目前，在我国尚有 108 个县和 57 个县级农场流行，仍有患者 82万，病畜数十万头， 9000 余万人口和数千万头家畜的健康受到威胁，每年为防治此病支出巨大（郑江， 2003）。 特别是近年来由于生物、自然和社会、经济等因素变化较大，我国血吸虫病疫情回 升显著，主要表现为血吸虫病患病人数增多，急性感染人数呈上升趋势，局部地区钉螺扩散明显，感染性钉螺分布范围逐渐扩大，部分已经达到传播控制标准和传播阻断标准的地区疫情严重回升，出现向城市蔓延的趋势，对人民健康、经济发展和社会进步构成威胁，血防工作形势严峻 （郑江， 2003； 2003） 。 为有效防治血吸虫病，迫切需要对血吸虫的生长发育和病理损害机理进行系统研究。现代分子生物学技术特别是后基因组和蛋白质组研究的迅速发展，为从分子水平认识和控制血吸虫和血吸虫病展现了新天地。 血吸虫成虫主要寄生于终末宿 主的肠系膜和肝门静脉系统，成虫在脊椎动物体内不繁殖，危害不大（周述龙等， 2001）。而性成熟的雌虫产生的大量虫卵在宿主肝脏形成肉芽肿是导致发病和疾病传播的主要原因（ ， 2001； 1984； ， 2001）。研究表明，雌虫的性成熟与雄虫的合抱密切相关（ 1997）。合抱是雌虫生殖系统正常发育和产卵的前提（毛守白， 1990； D. A.， 1973； J. 1985）。因此，利用蛋白质组学研究技术，对不同发育阶段及合抱后的血吸虫雌雄虫体进行大规模、整体性蛋白质水平的分析，对揭示血吸虫雌雄性别差异蛋白特别是合抱后性别发育调控相关蛋白具有重要意义（程国锋等， 2004），利用 术、微阵列技术、酵母双杂交技术等对差异蛋白及其基因和信号转导调控网络进行研究，将能深入阐明血吸虫性别发育机制，开拓抗血吸虫发育生殖新途径（程国锋等， 2004）。 第二章 蛋白质组学研究技术及其在寄生虫学中的应用 近十年来，随着人类基因组工作序列草图完成和几十种生物的全基因组测序结束，人们 工作重心将从揭示生命的遗传信息转到对功能的研究方向发展 （ ， 2001）。蛋白质作为生物体功能的体现者和执行者，既具有表达的动态性，即在不同细胞周期，不同发育阶段，不同生长和营养状况会呈现表达差异，又具有结构与功能的高度复杂性，即基因翻译后的修饰、加工，转运定位、蛋白质之间及和其它生物分子的相互作用等独特的机能。但以上种种并不能从生物体的遗传信息上完全预测，例如，研究表明蛋白质与 相关系数仅为 计学表明一个基因在大肠杆菌中可表达 蛋白，在酵母中可表达 3 种蛋白，在人中为10 种（ 1999）。故而，一门研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的蛋白质组中国农业科学院博士学位论文 引言 2 学应运而生。蛋白质组的概念是由澳大利亚 学的 1994 年意大利 向电泳会议上提出，并于 1995 年 7 月发表于 志（ 1999）。蛋白质组（ 基因组所表达的全套蛋白质，即一种细胞至一种生物所表达的全部蛋白质，其实质是从蛋白质的水平研究认识生命活动的机理和疾病发生的 分子机制（ ,1999）。 目前，随着蛋白质组学的逐步发展，又提出了从整体上研究蛋白质表达变化的表达蛋白质组学（ 研究蛋白质在细胞内行为、运输相互作用的细胞图谱蛋白质组学（ （ ,1999）；分析有机体基因编码所有蛋白质结构的结构蛋白质组学（ 研究一定阶段或一定生理现象相关蛋白质功能的功能蛋白质组学（ 概念（ 1999；李伯良 ,1998）。 蛋白质组学研究的发展离不开相关技术的应用、提高和改进，现就目前蛋白质组研究技术某些进展及其在寄生虫学中的应用作一简要综述： 蛋白质组学研究的核心技术为：蛋白质组份分离技术，蛋白质组份的鉴定技术，利用蛋白质信息学进行蛋白质结构、功能预测。 白质组份分离技术 生物体内蛋白质种类繁多，将供试样品中蛋白组份充分分离并可供检测是开展蛋白质组学研究的基础，利用蛋白质分子量和电荷差异性建立 的双向电泳技术成为目前蛋白质组份分离的基本方法，并通过不断改进以逐步达到高分辨率、高灵敏度和高重复性的要求。双向电泳是 1975 年分别独立建立的 (O1975； .,1975)。第一向为等电聚焦电泳，根据蛋白质等电点不同将之分离。目前，有 非平衡 度电泳（ H 种方法（郭尧君 ,2002）。其中在 80 年代初发展的固相 度（ H 电聚焦电泳。 过电解质（ 定化共价偶合于丙烯酰胺产生固相的 度。具有克服 性蛋白丢失的缺陷，还有上样量大，重复性好，分辨率高，样品中盐的干扰少，无边缘效应等诸多优点。现 向电泳技术已成为蛋白质组分析的核心之一， 采用窄的 度，结合特殊的 条，可将蛋白上样量提高到 (1998;1993)。在上样方式上，除了传统的阴极或阳极加样外，还发展了胶内加样方式， 认为此加样方式提高了电泳的分辨率，并可加大上样量 (1994)。但 试验表明在 条的酸、碱两端同时加样能提高分辨率 (1997)。 已研制出 宽胶条，分离距离达 24提高分辨率 (1999)。但目前仍需提高低丰度和疏水性蛋白的进入效率。双向电泳的第二向是 根据分子量不同将之分离。经过两次电泳，蛋白质分子便依各自分子量和等电点呈现在电泳图谱不同位置。 白质组样品处理技术 高分辨率、高重复性的电泳图谱离不开高质量的样品处理技术，蛋白质组样品的处理要求：剔除干扰物质，力求样品中蛋白质洁净；尽可能提高样品蛋白质的溶解度，保持其完整性；某些特殊种类的蛋白质也能在电泳图谱中充分展现。 中国农业科学院博士学位论文 引言 3 品中干扰物质的去除 样品中的核酸、脂、多糖、盐等会影响蛋白质的可溶性和 2复性。可采用超离心、透析，加入核酶等方法来清除干扰物质。 用化学变性解聚和溶解蛋白 主要参与的试剂有： 1）离液剂 主要利用其能与多肽主键竞争氢键，改变溶液中氢键的结构，将蛋白质变性以解聚疏水区。常用脲（ 硫脲（ 利用硫脲和脲联合应用可提高蛋白质的溶解，发现硫脲有助于蛋白特别是膜内在蛋白的溶解 (1997)。 2）表面活性剂 又称去污剂，其主要通过破坏蛋白质分子内的疏水相互作用，从而使蛋白质更好地溶解在样品中。常用的有离子型： 离子型： 两性 离 子 型 ： 3-(3- 胆 胺 丙 基 ) 二 甲 氨 基 磺 酸 (3-(3等。近来， 常用，但在高浓度离液剂中，其溶解能力有限， 0） 比 为有效，但脲浓度大于 l 时仍不溶，而最近合成的 4） 和 有更多极性的集团，能溶于高浓度脲中，且有更强的膜蛋白溶解能力（ 2000）。利用 在双相电泳图谱上呈现跨膜蛋白（ 1998）。 用于溶解疏水性较强的蛋白质，如可从 溶解 型体，此蛋白是在双相电泳中呈现的最疏水性蛋白（ 1998）。）还原剂 主要使维系蛋白构象的二硫键打开，使其变性更加充分。常用的试剂有： 硫苏糖醇（ 二硫赤藓糖醇（ 三丁基膦（ 由于前三者与二硫键反应为平衡反应，在 电聚焦时，体系 释放还原剂易使蛋白质被再次氧化，造成电泳图谱水平条纹（ 2000）。而 不带电荷还原剂，始终能保持蛋白质的还原状态，减少了蛋白质沉积（ 1998）。最近，有人使用 解富含二硫键的羊毛角蛋白，双相电泳图谱表明分离了四个分子量和等电点比较相似的蛋白质，这是以前使用 未得到的（ ,1977）。 一个特点是与烷基化试剂如丙烯酰胺、 为双向电泳平衡环节提供了更加简便的操作（ ,1977）。目前，样品处理试剂上有了许多突破，加上不同试剂联合应用的鸡尾酒溶解法提升了蛋白质的溶解度。 白质的预分离和分步抽提技术 为了提高蛋白质双相电泳图谱质量和满足对特殊种类的蛋白质进行研究的需要，样品处理上除了全蛋白常规提取外，还常应用蛋白质预分离技术和蛋白质的分步抽提技术。 蛋白质预分离技术现主要分以下几种：）利用超离心或密度梯度离心技术分离目的细胞器的蛋白。此技术常用于亚细胞蛋白质组学研究。 种碘化密度梯度离心介质）密度梯度离心对鼠肝细胞进行亚细胞器分离 ，得到了高尔基体等亚细胞器蛋白，在双相电泳中各细胞器分别呈现出自己的标志蛋白（ 2001）。）利用制备型色谱富集特定的蛋白。 用羟基磷灰石色谱法分级分离大肠杆菌蛋白质，不同组分进行双相电泳，结果约有 130 个蛋白质在总蛋白质双相电泳图谱中未呈现而在色谱富集以后呈现出来（ 1999）。）利用层析技术。 利用肝素亲和层析技术成功富集了大肠杆菌 160 个胞浆蛋白。他们又利用层析聚焦技术富集到约 125 个蛋白质，其中 17 个蛋白质首次通过此方法得到，且多为低丰度的功能性酶，还利用疏水层析法富集了流感嗜血杆菌中国农业科学院博士学位论文 引言 4 大约 150 个蛋白质，其中 30 个为首次发现（ ,2001）。）高丰度蛋白预去除。 种亲和基质）有效地去除了 95%以上人血清白蛋白和 97%以上人 过 理后的血清蛋白质双相图谱大为改观（ ,1999）。蛋白质的预分离技术虽然能满足某些特殊种类蛋白质分析需要，但此技术还存在操作复杂，蛋白质成份易丢失等缺点，可作为蛋白质 组整体分析的补充。 蛋白质的分步抽提技术是指根据蛋白质溶解性差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行顺序抽提，从而分离出具有不同溶解度范围的蛋白质组亚群。 先提出并应用顺序抽提（ ,即利用三种逐渐增强的溶解液来抽提不同性质的蛋白（ ,1998）。第三步抽提物经鉴定有 11 个膜蛋白，其中 5 个是以前在常规样品处理方法中从未在 出现过的。 又把第三步抽提沉淀物用含 解液再次抽提，结果表明能得到高纯度的外膜蛋白。 离特殊种类蛋白质技术 丰度蛋白质分析技术 目前为检测低丰度蛋白质有三种方式： 1）增加总蛋白的溶解度和电泳时的上样量，但高丰度蛋白易造成背景效应，影响低丰度的蛋白分离和探测。 2）预分级和窄 条相结合技术。即将总蛋白组分成蛋白质亚群，再用 度小于个 位的 条进行等电聚焦分离。R 小组设计了一种样品分离仪器，样品处理后可直接在 行等电聚焦电泳，适合于复杂样品的分离（ ,2001）。 3）蛋白质组重叠群（ ,1997）。即利用多块在 合图象分析技术拼接成一张完整的双相电泳图。蛋白质组重叠群结合样品分离技术，可使更多的低丰度蛋白得到分辨和展示。 子量特大或特小蛋白质分离技术 在常规 上，分子量小于 8大于 200蛋白质不易分离到，这可能是在冲系统中，样品和电泳缓冲液中的游离十二烷基离子将持续积累 浓缩，与小分子量蛋白发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低了小分子量蛋白的分辨率（詹显全等 ,2002）。瑞士一个小组在研究流感嗜血杆菌中用含脲素的麦黄酮（ 分离了很难分离到的 5围的蛋白质（ 1998）。建立虚拟双相电泳图谱来对细胞内蛋白质组份及其动态变化进行研究，结果表明此方法比传统双向电泳具有更高的分辨率，并能减少双向电泳由第一向到第二向转移平衡所造成的蛋白质丢失，特别是高分子量蛋白的丢失（ .,2000）。 白 质图谱呈现技术 将双向电泳分离的蛋白质斑点呈现才能对电泳分离结果进行分析。目前，呈现蛋白质斑点有考马斯亮兰 考马斯亮兰 酰胺黑（ 丽春红 S （ 银染、负染、荧光染色方法等。银染和考马斯亮兰染色是蛋白质组研究中最为广泛使用的两种染色方法， 其中银染达 1分辨率，考马斯亮兰染色达 1001999），负染中锌染和铜染由于可逆性和高灵敏度，近年来逐渐受到重视，其中锌染的灵敏度 与银染相当，铜染的灵敏度高于 法。荧光染色技术是新近开始应用于双向电泳图谱显示，它具有灵敏度高（达 方便等优点，但需较高费用和专门的荧中国农业科学院博士学位论文 引言 5 光检测仪才能呈现染色的蛋白质。 白质组鉴定技术 蛋白质组鉴定技术主要是对双向电泳图谱和呈现的蛋白质斑点进行分析鉴定。目前，所选用的技术包括对蛋白质图谱的图像分析技术、与质谱相关的鉴定技术、氨基酸组份分析技术等。 向电泳图像分析技术 双向电泳图像分析的实质是图谱数字化，并实现蛋白质的定性化和定量化。首先，为图象采集，主要利用电荷 耦合（ 相机、文件扫描仪（ 后，采集的图象进入分析过程，包括斑点检测、背景削减、斑点匹配和数据库构建（ 2001；贾宇峰等 ,2001）。所有的都完成后，图像输出可根据个人需要以 件输出。有的软件（如 D）还可将分析数据自动创建成网页，点击参考胶任何一个蛋白质点就可以访问相关数据。 质谱相关的蛋白质鉴定技术 80 年代中期出现的两种新的电离技术：电喷雾电离（ 基质辅助激光解吸电离（ 这两种技术所具有的高灵敏度和高质量检测范围，使得在 至 平检测生物大分子成为可能 ,从而开拓了质谱在生物学中应用的新天地。这两种电离方式结合不同质量分析器构成了两种生物学中常用的质谱仪：电喷雾（四级杆）质谱器（ 基质辅助激光解吸 电离飞行时间质谱仪（ 陈竺等 ,2001）。此外，离子阱（ 谱和付立叶变换离子回旋共振质谱（ 可用于生物大分子的测定。液相色谱 四级杆飞行时间串联质谱仪（ 带有串联功能的 者是在传统的电喷雾质谱仪的基础上采用飞行时间质量分析器代替四级杆，提高了仪器的分辨率，灵敏度和质量范围；后者是在质谱中 加入了源后降解（ 式或传碰撞诱导解离（ 式，可测序生物大分子 ( ,2000)。 质谱在蛋白质组学研究中应用为： 序列分析和肽质量指纹谱测定 双向电泳分离的蛋白质点被切割下来，进行胶内酶解或转移到 上，进行膜上酶解。酶解产物可采用 S 测定肽序列。 应用纳喷串联质谱（ 在 上测得肽段序列（ 1996）。 利用羧肽酶Y 酶解法并结合 样可测得 C 端肽序列（ ,1995）。 发展一种称为 方法，可推测出 N 端序列（ ， 1993）。利用质谱进行肽序列测定克服了 解法周期长，费用高等缺点。也可用 用 数据库查询，以鉴定蛋白质（ .,2000）。 有翻译后修饰的蛋白质鉴定 质谱在鉴定蛋白质翻译后修饰具有独特的优势，可通过质谱对特征离子监测确定磷酸化肽，通过串联质谱确定磷酸化位点来鉴定磷酸化修饰；在糖蛋白分析方面，可以通过质谱，蛋白