【毕业学位论文】（Word原稿）水稻半矮秆和早衰突变体遗传分析与分子定位作物遗传育种硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 水稻半矮秆和早衰突变体遗传分析与分子定位 of t) t) in of t) t) in - I - 摘 要 矮生性是水稻重要的产量性状之一，矮秆水稻品种的选育和推广是 20 世纪水稻育种工作的最主要的成就之一。 水稻非 生基因的发掘和利用历来受到水稻遗传育种学家的重视， 开发新的水稻矮源并及时加以利用，是避免矮秆良种遗传单一化从而带来遗传脆弱性的重要研究课题。 本研究以中花 11 的半矮杆突变体为材料，通过遗传分析和改良，发现了一个有希望用于水稻育种的一个新的半矮杆基因。还对一个早衰突变体进行了遗传研究，并初步将早衰基因定位在第 11 条染色体上。 1、 对新花矮和矮中花两个突变体的农艺性状和半矮生性状遗传进行了研究。结果表明它们的半矮生性都是由一对基因控制的。其中矮中花中的半矮生基因与 位。而新花矮中的半矮生基因 t)与 等位， t)在 谢调控路径中可能位于 下游 。 2、 对新花矮中的半矮生基因 t)与其他的几个半矮生基因的等位性 进行了分析。研究表明， t)与 半矮生基因 不等位。在苗期用赤霉素和多效唑进行处理，发现新花矮对它们都很敏感。暗处理试验表明，它是一个与 关的突变体。 3、 对新花矮中的半矮生基因 t)的遗传性状表现进行了研究， 新花矮不仅有优良的农艺性状，而且 t)可以与大粒性、穗粒数和高结实率结合， t)的副作用可以通过遗传背景的改良而得以改善。表明 t)有望在水稻育种中利用。 4、 选择突变体“ 试验材料，开展了遗传分析及初步分子定位研究 ，表明早衰基因 t)是显性的，利用 记，采用 体表型为野生型的单株，将 t)定位在第 11 条染色体引物 间的 范围内。 关键词： 水稻 (.)，半矮生基因，遗传分析，早衰突变体 - is of in of of in in 0th of in of in us by of of in In by a be in of a t) t) 1. 1. of HA ZH by in ZH to HA to is by t) in 2. t) t) to A3 at of t) a in 3. of t) of by t) as of be by of t) be in 4. of by SR 2 t) on of 1,.9 cM .), - 目 录 第一部分 水稻新半矮生基因的发掘与研究 第一章 绪 论 . 1 1. 1 水稻矮源概述 . 1 1. 2 国内外研究现状 . 1 本论文选题的意义和目标 . 12 第二章 新矮秆突变体农艺性状及株高遗传 . 13 2. 1 材料和方法 . 13 2. 2 结果与分析 . 14 2. 3 结论与讨论 . 21 第三章 t)等位性分析与 激素生理研究 . 23 3. 1 材料与方法 . 23 3. 2 结果与分析 . 24 3. 3 讨论 . 28 第四章 半矮生基因 t)的遗传改良 . 30 半矮生性与大粒性的结合 . 30 半矮生性与大穗型的结合 . 32 半矮生性与高结实率的结合 . 33 本章讨论 . 34 第二部分 水稻早衰突变体 t)的遗传及分子定位 第一章 绪 言 . 36 述 . 36 老分子生物学研究技术与方法 . 36 植物衰老的几种假说 . 37 水稻早衰的研究现状和意义 . 39 第二章 早衰突变体的发现及基因 t)的定位 . 40 料与方法 . 40 结果与分析 . 42 讨 论 . 46 研究展望 . 46 参考文献 . 47 - 附 录 . 54 致 谢 . 55 个 人 简 历 . 56 - 1 - 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 第一部分 水稻新半矮生基因的发掘与研究 第一章 绪 论 1. 1 水稻矮源概述 栽培水稻中发现的含有矮秆、半矮秆基因的种质都叫矮源。水稻的矮生性是指成熟期水稻的株高比正常植株缩短的遗传特性，广义上可以把矮秆分为半矮秆，矮秆和极矮秆 3 种类型。狭义上，矮秆指成熟期时的株高等于或小于正常亲本株高一半的矮秆变异；半矮秆是指株高介于矮秆和正常高度之间的突变类型（谷福林等， 2003）。 正常的水稻植株，成花诱导的完成伴随着末梢 4 或 5 个节间的伸长，而底部 的其他节间不伸长，水稻矮秆突变体的分类就是建立在末梢节间伸长类型不同的基础上（ et 2003）。（ 1969）和 1977）将水稻矮秆突变体分成 5 类： 节间的伸长方式与野生型相似，只是各节间按比例缩短； 2 节间特定的缩短； 部节间伸长程度减少，下部节间伸长； 上面节间不伸长（图 图 种不同水稻矮秆突变体节间伸 长方式示意图（引自 1977； 999） 1 of of of 1977； 999) 1. 2 国内外研究现状 水稻最初的矮秆变异来源于自然条件下自发产生的突变，包括所有的突变是生物变异的重要- 2 - 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 来源，也是生物进化的基础（江树 业， 2003），当然自发突变的频率较低。除了自然发生突变产生的矮源以外，人工诱变是创造矮源的重要的方法，如物理因素，化学药剂，组织培养， 空诱发及遗传操作等，均能诱发矮秆变异。 1934）首先报道了利用 X 射线诱导一个粳稻品种产生矮秆突变。其他方法，如射线， 32P 处理等方法都取得了成功。上世纪八十年代，先后通过 X 射线和 137射台中 65 和品种，得到了 多个半矮生基因（ 1994； 1989、 1994）。朱 旭东等（ 2004）利用射线对粳稻品种“中花 11”进行辐照，经 选获得各类突变体 431份，为水稻功能基因组研究提供了基础材料。其中有半矮生、小粒矮生、大粒矮生、多糵矮生、少糵矮生、特矮生、长剑叶矮生、畸形矮生等多种矮生型，约占总数的 30。 化学诱变就是利用化学物质来处理植物（一般是种子）来诱发产生突变。现在最常用的诱变剂是 导矮秆的效果也很显著， 产生矮秆的频率在 右（陆兆新等， 1992）。 （ 2002） 已经获得了 14,000 个水稻 变群体，为水稻定点突变的筛选奠定了基础。 组织培养的方法，结合化学诱变及辐射技术也是产生矮秆突变的有效方法。此外，重组自交系（ 双单倍体群体（ 近等基因系（ 群体中也常出现可供利用的突变体。 将某些元件插入到水稻基因组中后，相应位点的基因的表达就可能受到抑制，插入元件同时又可用作标签，从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。目前，水稻中最为常用的插入元件主要是 座子及反转录转座子等（江树业， 2003）。水稻 入突变库的构建 工作也取得可喜进展，如 （ 2000）已经筛选出至少 30,000 个 入突变体；中国水稻研究所已经建成我国第一个水稻 入突变体库，得到 4,500 份突变体材料，表型分析和分子检测表明所获得的植株 95为转基因植株，单位点插入株系占 2/3。 利用返回式卫星搭载植物种子进行空间诱变处理是近十几年来一个新的诱变方法。徐建龙等利用卫星搭载的特早熟粳稻 95诱变后代鉴定出一个株高 56 效分蘖数多达 60 个以上，株型良好，籽粒正常的多糵矮秆突变体 建龙等， 2003）。 自从印度学者 1922 年首次报道了一个隐性单基因控制的自然矮秆突变系以来，科学家对水稻矮秆的遗传进行了广泛的研究。 粳稻中的矮生性遗传有两种情况：一是受隐性单基因控制，并伴有作用较明显的修饰基因，二是由微效多基因控制（朱立宏等， 1984）。在籼稻中，矮生性多数是由单隐性基因控制，少数受 2 至 3 对隐性基因控制，仅有极少数的矮源受多基因控制（朱旭东等， 1997）。水稻株高由单一隐性矮秆基因控制时，表现半矮秆或矮秆，受两对矮秆基因控制时，植株往往表现为特矮。当然，也有特矮 突变体是由一对矮秆基因控制的。据网络数据库检索，至 2004 年 2 月 稻突变体库中收集的水稻矮秆、半矮秆基因分别为 44 个（编号： 和 16 个（编号： 原日本水稻基因连锁群和命名委员会的 d 编号（ 3 - 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 中的矮秆、半矮秆基因也编录在内。其中，除了 余的都是隐性基因（ ）。与其他的一些性状不同，矮生基因的显隐性是相对的，在杂合状态下，都有部分的表达。这和植物内源激素复杂的合成代谢过程有关。 度对矮生水稻的影响 “ 1”是通过对品种“ 行射线照射处理而得到的，它是由一个隐性基因控制的（ 1968） 。同时得到的还有另外一个比 1 稍高的矮秆突变体“ 后来作为一个栽培品种曾在日本北部被广泛种植。 （ 1981）比较了“ 1”和原品种“ 不同温度处理下的株高变化：在 25 30 的条件下，“ 株高只有46 为“ 56 %；在 18 23 的条件下，其株高达到 60 野生性高度的 84%。 （ 1990）研究发现，“ 1”中的矮秆基因和“ 秆中的矮秆基因等位的，后者是用吖丙啶（ 理“ 得到的（ et 。他们的研究还发现，当平均 温度超过 26 时，“ 1”节间的伸长被抑制，主要影响第三（从最上面数）到第五节间的伸长，这和 的研究结果是一致的。由此可以推断“ 1”中的矮秆基因对赤霉素的合成有阻碍作用，在低温条件下，表达强烈，导致水稻植株矮化；也有可能存在另外的抑制矮秆基因表达的基因，该基因在低温条件下不表达，因此在低温条件下才表现出矮化。 此外，携带矮秆基因 植株在低温条件下的表型为矮秆小粒，在高温条件下表现正常。（ 2003）的研究结果表明， k 在总苞期对提高水稻耐冷性具 有多效性作用，可以用来培育超耐冷性的水稻品种在天气冷的地区种植。 我国对矮源的发掘从 50 年代开始就没有停止过。顾铭洪等（ 1979）发现了 因，并育成了含有此基因的品系新桂矮，随后的研究将 位到第 5 染色体上。随后陆续发现 80t) 和 t)（朱立宏等， 1984；万安良等， 1984）；还有从矮泰引 t)（梁国华等， 1995） ；籼稻矮生品种广丛中的矮生基因 t)（蒋志谦等，1997）；对赤霉素反应很敏感的江苏矮，与 禾矮早的 等位，暂时将此基因命名为 t)（钱前等， 1997） ；马良勇等（ 2002）发现的含有 t)新黔矮；徐建龙等（ 2003）诱变特早熟粳稻 95定出的多糵矮秆突变体 有吴成等（ 2003）在杂交水稻亲本恢复系蜀恢 162 中发现的小粒矮秆突变体“ 162d”。但是，这些矮秆种质在育种中的利用价值，有待进一步的研究。 目前，已经发掘了超过 60 种的矮秆突变体，大多数矮秆、半矮秆基因已经被 定位到除第 10条染色体以外的 11 条染色体上（表 少数已经进行了克隆和分离，矮化机理已经研究清楚。 - 4 - 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 表 已经报道的矮生、半矮生基因 因 名 称 基 因 符 号 基 因 别 称 代 表 种 质 等 位 基 因 连锁群 参考文献 d2 d3 d5 d7 国矮 d 8 粒矮 t) t) t) t) t),237dt dC dW d dB t) 大黑 夷矮 多糵矮 多糵矮 多糵矮 夷糯 闭颖大黑 晚力神 62, 雪矮等 三体 青森糯 14 7237 92 白世 州 栽稻 (, 1 4 6 2 7 7 6 1 4 2 3 1 3 6 1 11 11 2 2 4 2 12 et 1998） et 003) et 984) et 984) Yu et 1995 ） et 997) et 984) et 990) Yu et 1995） et 2000） et 2002) 968) et 984) et 2000) et 2002) et 2000) et 991) 1984) et 1995b ) 974) 1984) 1974) Yu et 1995） 1984) et 989) Yu et 1995） et 974) et 989) et 1992) et 1997) - 5 - 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 * * 叶舌矮 d K8 d 53, D K3 d K5 d K6 d K7 d(x) 粒矮 t) sd(t) t)* t) t) t) t) t) Sd(t) t) 341 107 京 11 号 新泰矮 一支腊 162d 桂阳矮 1号 (, 8 3 11 1 1 3 9 6 7 1 7 1 5 5 4 5 3 5 et 1982) 1984) et 1985) 1984) et 1989b) et 1989b) et 1985) 1976) et 1996) et 1996) et 1996) Wu et 1999) 1993) et 995) et 002) 978b) 978b) 979) 986) 1987) et 996) et 996) 997) 997) et 996) 李欣等（ 2001） 李欣等（ 2001） 李欣等（ 2002） et 003) 梁国华等（ 1994） 以上根据 ）、 ）、 - 6 - 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 * 等位基因； * 等位基因； * 等位基因 生基因作用机理研究与应用 最初，有关水稻矮秆机理的研究主要限制在对水稻外部性态的研究，随着细胞生物学的发展，对矮秆机理的研究深入到细胞水平。例如， （ 1985）通过对近等基因矮秆系的研究，发现节间的缩短主要是细胞数目的减少造成的，而与细胞的长度无明显的相关性。现在，分子生物学和分子遗传学的飞速发展，对水稻矮秆机理的研究已经深入到分子水平，特别是后基因组时代的到来，水稻矮秆作用的分子机理已经逐渐被揭示出来。 植物激素突变体是研究植物激素合成、代 谢途径以及信号转导的重要植物材料（韩碧文，1993）。各种各样的因素会使植物矮化，但最近通过对拟南芥（ 其他双子叶植物矮秆突变体的分子遗传研究表明，赤霉素（ 称 油菜素类固醇（ 称 决定植物株高的两个最重要的因素 (et 2003)。对水稻矮秆、半矮秆突变体的研究结果也是如此。 1)、水稻矮生性与赤霉素（ 图 高等植物中赤霉素生物合成与分解代谢的主要途径 （ . et 2002） he of A) in 的名称用黑体字表示，在箭头的下面或右侧。 别转化成 A， - 7 - 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 in or to of be A1 A8 一个很大的双萜类化合物家族，其中一些具有生物活性，可以对多种发育过程，如种子发芽，茎干伸长，叶的伸展，花和果实的发育等进行调控（ 995）。 作用特别体现在茎 秆的伸长中，因为所有的 陷型的突变体都表现为矮秆（ et 997）。最近，编码 物合成过程所用的基因（除 化酶）和 解代谢最初步骤已经被分离和鉴定出来。 高等植物体内的生物合成，主要有三个阶段： 1）质体内，牻牛儿焦磷酸到内根 2）发生在网膜系统的微粒体细胞色素 加氧酶催化内根 转变； 3）细胞质中 形成（ . et 002）。 A、 与 水稻突变体 水稻中的半矮秆基因 现代水稻育种中最重要的基因。 因的品种对外源的 理敏感，株高可以恢复到野生型的高度。 码 化酶（ ，催化 步反应。在小麦中普遍应用的半矮秆基因 码与 号转导有关的蛋白。 图 等植物赤霉素生物合成的早期 13 ,1997； ,2002） 。黑圆表示由 催化的 氧化步骤 he 3of in A 20水稻中至少有两种 化酶： 码 锁。 叶片、茎秆、未开放的花中表达强 烈， 是在未开放的花中表达。这也就揭示了为什么 稻株高减小，而产量不受影响的原因（ . et 2002）。 稻含有一个有缺陷的 化酶，两个独立的 位基因都是 部发生了改变；籼稻半矮秆品种 码区（ 缺失了 280时丢失的还有 03稻半矮秆品种 6和野生型 798 位置 C 转换成了 T，导致 基酸序列中的亮氨酸（ 变成了 。而亮氨酸（ 在所有的 化酶（ 中是保守的，在 是保守的，这就使粳稻 能缺失，表现出半矮秆性状（ . et 2002）。 - 8 - 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 B、 与水稻突变体 携 粒、叶色暗绿、直立紧凑型小穗，有时第二节间不伸长。 蛋白亚 基的基因， 就是糊粉层中 . et 2003)。 一个 突变体的表型表明， 且，还有另外一条不依赖 et 2000）。 C、 与水稻突变体 携 因的是功能缺失 型突变，可是它的花和种子的发育没有受到影响。 码 (H. et 2001)。在水稻中也至少有两种 且是特异性表达的： 地上部各器官中广泛表达； 在生殖器官中特异表达。由 制合成的有生物活性的 用于新芽的伸长，而与生殖发育无关（ . et 2003） 。在 成路径中， 要催化 外还催化 . et 2000） 。 D、 与水稻突变体 有关研究 带 因的 变体株高是其野生型的 60 70%，实际上上个世纪 50 年代经被认为是日本产量最高的栽培品种，亩产可达 8.5 t/能是由品种 过自然突变产生的。 因编码内根 成的最初的阶段起作用 (et 1996)。催化内根 根 杉烯醇内根 根 . et 1998）。 等（ 2004）从水稻基因组中分离了 5 个因，它们编码的蛋白与拟南芥和南瓜的 有很高的同源性，研究表明基因 120序列中前后同向排列，表达分析显示 各种器官中转录活跃，而 是低水平的表达， 许是个假基因。 应于是 弱等位基因。 能参与植物抗毒素的合成。 E、 与水稻突变体 有关研究 突变体 ） 表型为特矮，叶色暗绿，叶片宽。 表达不受外源 理的抑制，而且其营养器官中 含量是野生型的100 多倍，表明 因编码一个 号中的正调控因子。 码一个推定的 白，和拟南芥的 相似（ . et 2003） 。 白是一类含有 序 ( 在泛素介导的蛋白质水解过程中具有底物识别特性的蛋白质家族 。 这类蛋白质在细胞时相转换、信号传导、发育等多种生理过程中都具有重要功能 （ 吴静 等， 2002）。 （ 2004）的研究使我们能更好的了解水稻中 谢过程。他们从各种 - 9 - 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 据库中筛选和分离了 29 个编码 种代谢酶的候选基因：内根 、内根 内根 内根 、 的研究结果表明：催化 物合成早期步骤的酶（也就是 和 要是由单基因编码的，而催化更后的步骤的酶（也就是 由基因家族编码