医学老鼠实验-(8).doc

淀粉样蛋白对小胶质细胞合成一氧化氮的影响作者：韩笑峰 吕 丽 葛汝丽 唐荣华 作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科 【摘要】 目的 探讨淀粉样蛋白(amyloid betapeptide, A)诱导小胶质细胞活化后轻链核因子(nuclear factorkappa B, NFB)的表达及一氧化氮(NO)水平的变化。方法 A干预纯化培养的小胶质细胞，观察其形态学变化，采用镉还原法测定NO水平，免疫细胞化学方法研究NFB的表达。结果 500 nmol/L及1000 nmol/L A干预组细胞形态呈“阿米巴样”，细胞核内NFB的表达增加（P0.05），培养基中NO浓度升高（P0.05）。结论 A激活小胶质细胞NFB途径大量合成NO，可能参与阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)的致病过程。 【关键词】 淀粉样蛋白 小胶质细胞 轻链核因子 一氧化氮 阿尔茨海默病 Effect of amyloid betapeptide on activated microglial cell excreting nitric oxide HAN Xiaofeng L Li GE Ruli et al Department of Neurology, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603 【Abstract】 Objective To study the morphological changes of microglial cell activated by amyloid betapeptide, the expression of nuclear factorkappa B increased in nucleus and the levels of nitric oxide in cultural medium. Methods Purified microglial cells were intervened by amyloid betapeptide and the morphological changes were observed . The cadmiumreduction method was used to determine the levels of nitric oxide in culture medium, immunocytochemical method to investigate changes of nuclear factorkappa B. Results There were no statistical significant differences between the experimental group of 100 nmol/L amyloid betapeptide and the control group (P0.05). In the experimental groups of 500 nmol/L and 1000 nmol/L amyloid betapeptide, microglial cells were bigger, the expression of nuclear factorkappa B increased in nucleus and the levels of nitric oxide were higher in culture medium than control group (P0.05).Conclusion The amyloid betapeptide could participate in the processes of Alzheimers disease by inducing microglial cells to excrete nitric oxide. 【Key words】 amyloid betapeptide，microglial cell，nuclear factorkappa B，nitric oxide，Alzheimers disease 阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)重要的病理特征之一是纤维状淀粉样蛋白(amyloid betapeptide, A)在神经细胞外及脑血管壁沉积形成老年斑(senile plaques, SP)。大量研究表明，A的沉积在AD发病中起着关键作用，但其神经损伤的具体机制尚不完全清楚，研究提示，一氧化氮(nitric oxide, NO)可能与A的神经毒性有关。本研究用A干预小胶质细胞，观测轻链核因子(nuclear factorkappa B, NFB)的表达以及NO水平的变化，探讨A诱导小胶质细胞合成NO的机制。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 动物：出生3 d内的Wistar大鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。 1.1.2 试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清（购自Hyclone公司），A140、A142（购自SIGMA公司），胰蛋白酶、TritonX100（购自Amresco公司），小鼠抗大鼠CD11b单克隆抗体（购自Serotec公司），兔抗NFB p65 多克隆抗体（购自SANTA CRUZ公司），抗小鼠及抗兔SP试剂盒和DAB显色试剂盒（均购自北京中山生物技术有限公司）。 1.2 方法 1.2.1 小胶质细胞分离、培养：在无菌条件下取出新生Wistar大鼠的大脑，剥离脑膜，取大脑皮层，剪成0.5 mm3碎块，加入1 ml 0.125%胰蛋白酶室温消化，用100目不锈钢筛网过滤，离心，弃上清，加入DMEM/F12培养基重新悬浮细胞，接种于多聚赖氨酸包被的50 ml培养瓶中，置于37、含5%CO2、20%O2饱和湿度的培养箱中培养。原代混合胶质细胞培养79 d后，在37恒温摇床上以250 r/min振速摇动处理2.5 h，将细胞悬液接种到已放置盖玻片的培养皿中，37培养1 h，弃未贴壁细胞，加新鲜培养基，培养57 d即可使用。用免疫细胞化学方法标记其特异性抗原CD11 b进行细胞纯度鉴定，小胶质细胞比例占90%以上即符合要求。 1.2.2 A的“老化（aged）”：用无菌三蒸水将稀释成 0.5105 nmol/L，37孵育 1周，使其变为聚集状态的。 1.2.3 小胶质细胞的干预：培养皿中分别加入不同浓度的“老化”140或142，对照组则不加，继续培养24 h。收集培养基，-80保存，备测定NO浓度。细胞爬片用甲醛固定15 min，-20保存备用。 1.2.4 免疫细胞化学染色：免疫细胞化学染色采用SP法。第一抗体小鼠抗大鼠CD11b单克隆抗体的稀释度为11 000，兔抗NFB p65 多克隆抗体的稀释度为1200，以PBS替代一抗作阴性对照。联苯二胺（DAB）显色。NFB p65免疫细胞化学结果判断：在高倍视野下行细胞计数，细胞核有棕褐色颗粒着色为阳性，无棕褐色颗粒着色为阴性。并根据Handel等2的分级标准半定量：-(5% )，+(5%25% )，+(26% 49% )，+ ( 50 % )。 1.2.5 NO测定：采用Cortas NK等3的镉还原法测定NO浓度。用不同浓度的KNO3做阳性标准管，无标本管做空白对照。用721分光光度计测定OD值。计算标准曲线并换算NO浓度。 1.2.6 统计学处理：数据资料应用SAS 6.12版软件进行统计学分析。等级计分结果比较采用Ridit分析。计量数据以均数标准差（xs）表示，统计分析采用多个均数之间两两比较的SNK检验。 2 结果 2.1 小胶质细胞鉴定及A干预后其形态学变化 经CD11b免疫细胞化学染色，胞膜及胞浆染色的细胞即为小胶质细胞，其纯度达92%(图1A，1B)。正常培养的小胶质细胞的形态特征为：胞体小，呈椭圆形或三角形，具有伸向各个方向的细小突起 (图1A)。A干预后小胶质细胞胞体变大，形态不规则。部分细胞有片状突起或伪足，呈“阿米巴样”(图1B)。 ( )所标记为小胶质细胞 图1A 正常培养的小胶质细胞CD11b免疫 细胞化学反应及其形态(400)图1B A干预后小胶质细胞CD11b免疫 细胞化学反应及其形态(400) 2.2 A干预后NFB的表达变化 NFB免疫细胞化学染色后，对照组细胞胞浆染色，而A干预组细胞除胞浆外，胞核及核周区域亦出现染色(图2A，2B)。等级计分Ridit分析，A142 和A140 500 nmol/L干预组与对照组比较差异有显著意义 (P0.05)，1 000 nmol/L组与对照组比较差异有极显著意义 (P0.01)，而100 nmol/L组与对照组比较差异无显著性(P0.05)(表1)。相应浓度的A142干预组与A140干预组比较差异无显著性 (P0.05)。 图2A 对照组小胶质细胞NFB p65免疫 组化反应(400) 图2B 1 000 nmol/L A42干预后小胶质细胞 NFB p65免疫组化反应(400) 表1 NFB p65免疫细胞化学结果及Ridit分析 2.3 A干预后培养基中NO含量变化 100 nmol/L A140、500 nmol/L A140、100 nmol/L A142干预组培养基中的NO含量与对照组比较无显著差异(P0.05)；500 nmol/L A142、1 000 nmol/L A140干预组培养基中的NO含量与对照组比较显著增高(P0.05)；1 000 nmol/L A142干预组培养基中的NO含量增高与对照组比较有极显著意义 (P0.01) (表2)。相应浓度的A142干预组与A140干预组比较无显著差异(P0.05)。表2 A干预后培养基中的NO含量比较 3 讨论 研究证明，NO参与了AD的病理过程并发挥重要的作用4，但A诱导合成NO的具体机制尚未完全阐明，Guo等5报道其与NFB的信号转导和基因转录密切相关。 本实验结果显示， A干预小胶质细胞后，核内NFB的表达增加，提示NFB被激活。NFB是普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子，调控细胞因子、趋化因子、免疫受体、转录因子、氧化应激相关酶以及急性期蛋白等多种靶基因，参与炎症和免疫反应、细胞周期控制与分化、细胞凋亡、感染及应激反应，其在AD的发病机制中具有重要的作用6。静息状态下，NFB与NFB抑制蛋白（IB）单体结合，以非活性状态存在于胞浆中。在外界因素的作用下，IB 快速降解，有p50和p65两个亚单位组成活化状态的NFB迅速转移入胞核，与靶基因的B序列结合启动基因转录。 目前认为，小胶质细胞表面有多种A结合的受体：清道夫受体(class A scavenger receptor, SR)、晚期糖化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts, RAGE)及甲酰基蛋白受体（formyl peptide receptorlike 1，FPRL1）等，A与受体结合后启动第二信使激活NFB途径79，而NFB如何被激活尚不清楚。 可诱导的一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)基因是NFB调控的一个重要靶基因，被A激活的NFB转移入核，结合于iNOS的启动子区的NFB反应元件，诱导iNOS大量的表达，NO产生增多10。此与本实验结果一致，低浓度(5001 000 nmol/L)A可激活小胶质细胞致NO产生增多。 NO在中枢神经系统的神经传导、记忆和空触可塑性中发挥重要的生理功能，而过量的NO可通过多种途径损伤膜性结构、蛋白质及DNA，导致神经元坏死或凋亡11；亦可介导和放大氧化应激、炎症级联反应，进而选择性损害与学习记忆有关的神经元，促进SP的形成12，使AD病理变化进行性发展。可以推论，A的神经毒性机制之一是通过激活NFB诱导iNOS过表达而产生超生理剂量的NO来发挥的。因此，小胶质细胞的ANFBiNOSNO途径，可能在AD过程中起着重要的作用，对此途径进行深入研究，可进一步揭示AD发病机制以及为AD的临床治疗提供理论依据。晋升网（）致力于成为医务工作者晋升职称心灵导师；是目前国内收录医学期刊、医学杂志最多最权威的医学学术平台；提供免费医学期刊在线阅读；网罗和甄选海量优秀医学论文检索，独立研发医学在线资源分享库和医学在线模拟考试库；整合刊类、标题、关键词检索及全文检索，并独家研发刊社管理和刊社加盟系统、在线投稿、在线查稿、在线阅读、远程审稿、在线下载等系统；聚刊社力量，建服务平台，让晋升网通过“专业”走入每一个医务人员的身边是我们不懈的追求目标；【参考文献】 Giovannelli L, Casamenti F, Scali C,et al. Differential effects of amyloid peptides (140) and (2535) injections into the rat nucleus basalisJ. Neurosci, 1995, 66(4): 781792.2 Handel ML, McMorrow LB, Gravallese EM. Nuclear factorB in rheumatoid synovium. Localization of p50 and p65J. Arthritis Rheum，1995, 38(12): 17621770.3 Cortas NK, Wakid NW. Determination of inorganic nitrate in serum and urine by a kinetic cadmiumreduction methodJ. Clin Chem, 1990, 36(8 Pt 1): 1440443.4 Combs CK, Karlo JC, Kao SC, and Landreth GE. Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNFdependent expression of inducible nitric oxide synthase and neuronal apoptosisJ. J Neurosci, 2001, 21(4):