【毕业学位论文】（Word原稿）大豆种质资源的耐盐性鉴定和多样性分析生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 大豆种质资源的耐盐性鉴定和多样性分析 I 摘 要 盐渍土壤是陆地上分布广泛的一种土壤类型，约占陆地总面积的 25%。据联合国粮农组织（ 计，全世界共有盐渍化土地面积约 38000 万公顷。同时，土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的主要非生物逆境之一。实践证明，培育耐盐的作物品种是 从根本上解决盐渍化问题的有效手段。作物种质资源是培育作物耐盐品种的基础，因此多方面收集耐盐种质资源，利用生物技术深入开展种质资源的耐盐性研究，分析耐盐种质资源的遗传多样性，充分利用耐盐种质资源，培育优良的耐盐品种是改良和利用盐渍化土地，增加粮食产量和维持农业可持续发展的中心策略。 本研究以 941 份大豆种质为实验材料，旨在通过系统的实验室芽期、苗期的耐盐性鉴定，筛选耐盐种质；并以 培育耐盐品种提供依据。本研究取得如下研究结果： 1. 对 941 份 大豆材料进行芽期耐盐鉴定，筛选出 1 级耐盐品种 21 份， 2 级耐盐品种 98 份，并鉴定出中耐品种 256 份，盐敏感品种 418 份，高敏品种 148 份。对 732 份大豆材料进行苗期耐盐鉴定，筛选出 1 级耐盐大豆品种 10 份， 2 级耐盐大豆品种 39 份，并鉴定出中耐大豆品种 143 份，盐敏感品种 277 份，高敏品种 260 份。大豆芽期、苗期耐盐鉴定的结果均表明，耐盐性在 4 级的品种所占比例较大，说明大豆品种中中等耐盐品种较多。 2. 利用 50 对 物分析 110 份优异大豆耐盐材料，共检测到 368 个等位变异， 点的等位变异范围为 2 16，平均 的等位变异数是 锁群上的 点和 连锁群上的 点的等位变异数最多，均为 16 个，而且这两个位点的遗传多样性指数较高，分别为 物的 数分布范围为 均为 物的 数的分布范围为 均为 3. 将国内大豆耐盐资源和美国大豆耐盐资源分别进行等位变异检测、 样性指数检测和 指数检测。国内大豆耐盐资源共检测到 354个等位变异，平均为 数的分布范围为 均为 数分布范围为 均为 国的大豆耐盐资源共检测到 301 个等位变异，数分布范围为 均为 数分布范围为 均为 4. 110 份大豆耐盐资源的 数在 间。把 110 份大豆耐盐资源进行 类，然后将其分为 15 个组群，其中 国的大豆耐盐品种都聚在了第 1 组群内。江苏的 11个大豆耐盐品种中有 9 个品种聚在了第 4 四组群内。第 11 组群内的 4 个大豆耐盐品种全部来自湖南。但从整体上来看 110 份大豆耐盐资源并非按国家或省份进行聚类的，中国和美国以及国内各省市之间的大豆资源交叉聚类现象较明显。 5. 63 份国内大豆耐盐资源的 数分布范围为 63 份大豆耐盐资源进行 以 数为 将其分为 8 个组群。从整体上来看 63 份国 内大豆耐盐资源并非按省份进行聚类，但一个组群或亚群内的大部分材料的来源地在地理位置上相同或比较接近。 关键词： 大豆，耐盐鉴定， 传多样性 of is of of s of to To of of to is to to 41 of , of is to of by of at of of by SR of 1. By of at of 21 ) 8 ) 256 ) 418 ) By of at of 10 ) 9 ) In 143 ) 277 ) 60 ) of at of in of in . 2. A 10 in 3 7 0 an of a 68 0 0 16, 3. on of of 4. on 110 5 SM 80% to st of in in in 10 10 in . on 63 In 3 7 in in or of 录 第一章 文献综述 . 1 渍化土壤的危害与利用 . 1 壤盐渍化现状及其危害 . 1 渍化土壤开发利用的途径 . 1 豆在农业生产中的地位及其在盐渍化土壤开发中的应用 . 2 内外大豆耐盐研究现状 . 3 豆耐盐机理的研究 . 3 豆耐盐鉴定方法的研究 . 6 豆遗传多样性研究进展 . 7 传多样性的概念及研究意义 . 7 传多样性的研究方法 . 7 豆表型遗传多样性研究 . 8 子标记技术在大豆遗传多样性研究中的应用 . 11 记在大豆中的应用 . 11 传多样性的统计分析方法 . 12 传关系分析 . 12 传变异分析 . 13 体遗传分化系数 . 13 研究的内容、目的及其技术路线 . 13 本研究的内容 . 13 本研究的目的 . 14 本研究的技术路线 . 14 第二章 大豆种质资源耐盐性鉴定评价 . 15 料与方法 . 15 料 . 15 法 . 15 果与分析 . 16 V 期大豆耐盐鉴定结果与分析 . 16 期耐盐性鉴定结果与分析 . 18 结与讨论 . 19 豆的芽期耐盐性与品种的耐盐性 . 19 豆苗期耐盐性与品种的耐盐性 . 19 豆苗期耐盐性和芽期耐盐性之间的关系 . 20 第三章 优异大豆耐盐性资源遗传多样性分析 . 21 料与方法 . 21 料 . 21 法 . 21 果与分析 . 23 点的等位变异及多态性分析 . 23 试材料特异等位变异分析 . 25 内大豆耐盐资源和美国大豆耐盐资源遗传多样性比较分析 . 26 类分析 . 28 结和讨论 . 31 传多样性指数讨论 . 31 类分析 . 32 国大豆耐盐资源的 类分析 . 32 第四章 全文结论和讨论 . 34 文结论 . 34 豆耐盐种质资源遗传多样性分布特点及耐盐种质资源利用的建议 . 35 参考文献 . 36 附 录 . 42 致 谢 . 76 作者简历 . 77 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 增片段长度多态性 氧核糖核苷酸 二胺四乙酸 离子排除基因 离子积累基因 丙烯酰胺凝胶电泳 合酶链式反应 机扩增多态 制性片段长度多态性 二烷基磺酸钠 of 单相似系数 核苷酸多态性 单重复序列 羟甲基氨基甲烷 加权分组平均法 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 渍化土壤的危害与利用 壤盐渍化现状及其危害 土壤盐渍化是一个世界性的资源问题和生态问题 ，成为限制世界和我国农业生产的主要因素之一。据联合国粮农组织 （ 2000 年统计，世界盐渍化土壤面积为 平方公里（不包括不合理灌溉造成的次生盐渍化面积），占世界土壤总面积的 3%。其中欧洲盐渍化土壤面积 洲盐渍化土壤面积 平方公里，北亚和乌拉尔东部地区盐渍化土壤面积 非中东地区盐渍化土壤面积 平方公里，撒哈拉以南非洲地区盐渍化土壤面积 平方公里，亚太地区盐渍化土壤面积 平方公里。中国盐渍化土壤面积 平方公里，占中国土壤总面积的 8%。 我国盐渍土资源总面积 亩，其中包括草甸盐土、滨海盐土、酸性硫酸盐土、漠境盐土和寒原盐土 5 种类型，分布于华北、西北、东北及滨海地区；碱土总面积 外盐化和碱化土壤全国共计 亩；亩（全国土壤普查办 公室， 1998）。 盐渍土造成的主要危害体现在使农作物减产或绝收，影响植被生长并间接造成生态环境恶化 。由于淡水资源缺乏或者利用灌溉方式改造盐渍化土壤代价昂贵，许多盐渍化土壤没有了经济价值和利用价值。 对内蒙 古 河套平原统计，许多灌区每年因盐渍土死于苗期的农作物占播种面积的 10 20%，甚至达 30%以上；黄淮海平原轻度、中度盐渍土造成农作物减产 10 50%，重度则颗粒无收，而山东省 公顷盐渍化土地中的 公顷耕地，每年因盐渍化造成的经济损失就达 15 20 亿元。严重的盐渍化，使土地的利用率降低，荒 地增多，加深了人多地少的矛盾。 因此，开发利用盐渍化土壤，增加土壤的产出率和利用率已经成为迫在眉睫的研究任务。 渍化土壤开发利用的途径 盐渍化土壤严重影响着农作物的产量、品质和效益。为了缓解盐渍化耕地和土壤次生盐渍化对农业生产的影响，以及盐碱荒地和沿海滩涂开发利用，进一步扩大种植面积，提高作物的单产和总产，增加经济效益和社会效益，各国政府和科研机构都加大了财力、人力投入。在二十世纪八十年代初期， （ 1980） 提出盐渍化土壤开发利用的二种途径：一是环境适应作物，即用传统水土工程改 良盐碱地；二是培育适应逆境的品种。实践证明，第一条途径人力、物力、财力消耗巨大，成本昂贵，并耗费大量淡水资源，目前淡水资源匮乏，因而受到极大限制。因此，选育耐盐品种是缓解土壤盐渍化、次生盐渍化对农业生产影响的最经济有效的方法（翁跃进，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 2002）。随着分子生物学的发展和研究手段的进步，加快了人们对耐盐机理的进一步认识。目前利用分子生物学技术，挖掘和克隆耐盐基因，进行遗传转化，改良和提高作物的抗逆性，成为重要的育种手段。 2001 年，多伦多大学的 2001） 将拟南芥的钠离子泵蛋白基因 转到番茄中。当在含盐量仅是海水一半的水中生长时，正常番茄就干枯了，而转基因番茄生长完好且结果了，成为利用基因工程手段培育耐盐新品种的成功事例。 豆在农业生产中的地位及其在盐渍化土壤开发中的应用 大豆一直作为我国的重要粮食作物之一，是植物蛋白和食用油的重要来源，大豆蛋白含有人体不能合成的 8 种必需氨基酸。大豆油脂中不饱和脂肪酸占 80% ,亚麻酸占 ,并且不含胆固醇。我国人多地少 ,蛋白质资源短缺 ,发展大豆产业符合我国国情 ,也有利于人民身体健康和膳食结构 的改善。因此大豆在食品工业和农业生产中占重要地位（邵弘等 , 2000）。豆粕作为蛋白质饲料，在畜牧业生产中也扮演着重要角色。 1949 年中国的大豆单产每公顷只有 611 公斤， 1980 年大豆单产达到每公顷 ,1989 年达到每公顷 ,1996 年后大豆每公顷产量基本维持在 左右的水平上。中国大豆的单产水平还比较低 ,2000 年世界大豆每公顷产量平均为 ,美国为 ,巴西为 , ,中国为 ,中国的大豆单产分别为世界平均水平的 78%、美国的 67%、巴西的 71%、阿根廷的 73%。二十世纪 50 年代 , 我国的大豆产量占世界总产量的 80% 90% ,目前已排在美国、巴西、阿根廷之后。现在我国在大豆种植品种和大豆产品深加工利用方面均已落后于发达国家。中国的大豆生产量到 1993 年提高到 1530 万吨 ,在 1994 年创最高记录 ,达 1560 万吨 ,随后一直徘徊在 1400 万 1500 万吨之间，直到 2004 年大豆总产量达到 1740 万吨， 2005 年国产大豆产量在 1780 万吨左右，略高于 2004 年，而 2005 年国内大豆消费量在 4000 万吨左右，比 2004年增长 ，其中食用 消费约 800 万吨，榨油消费约 3200 万吨，总之， 2005 年度大豆需求缺口在 2200 万吨左右，绝大部分需要通过进口来解决 (孟丽， 2006)。中国的大豆生产量长期徘徊 ,增长很慢 ,大豆生产能力不能满足畜牧业发展对豆粕需求的增长 ,只有增加大豆和豆粕的进口才能满足国内对豆粕的需求。 栽培大豆（ 属于中等耐盐作物，其土壤盐度阈值 是 5.0 ds溉水电导率超过 株就会死亡 (et 1984)。 大豆品种间耐盐性存在差异（ et 992； et 1997） 。据 （ 1964）的实验，当土壤盐度由 高到 10.2 ds片出现缺绿，茎干重和籽实产量降低，盐敏感品种较耐盐品种受盐胁迫影响更大。不耐盐的大豆品种，茎叶中的氯化物积累量分别达到 1500030000，植株即死亡。 大豆由于根瘤固氮作用 , 是生态农业、有机农业的重要作物。进行大豆耐盐性研究，对增加粮油需求，提高盐碱地区作物产量，改善土壤结构和有机质含量，缓解土壤盐渍化危害具有重要意义。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 内外大豆耐盐研究现状 豆耐盐机理的研究 作物耐盐性是一种复杂的性状，涉及多种生理和代谢途径。近年来有关大豆耐盐机理和耐盐遗传方面，国内外均有一些报道。 因控制的排氯机制 盐胁迫对植物造成危害主要是离子毒害、渗透胁迫和营养不平衡。 害和 在不同作物中表现不同，大豆盐害究竟是 应还是 丙军等（ 2002）通过对大豆苗期盐害离子效应的比较 ，认为 和 且报道在 渗胁迫下单 单 各大豆品种发芽率均有明显抑制作用，其顺序是 理 单 理单 理。 有些耐盐大豆具有 除机制， （ 1969） 认为 除机制是单基因控制的，并提议把此基因用 示，该基因对盐敏感大豆叶内 累的等位基因 （ et 1969） 提议用 示）是显性。邵桂花等（ 1994）利用耐盐品种与盐敏感品种配 制了一系列正反杂交组合，进行大豆耐盐性遗传分析表明，大豆耐盐主要受一对基因控制，耐盐属显性，盐敏感为隐性；又根据大豆植株排斥 显性，吸 隐性，因而认为大豆离子毒害主要是究了对盐胁迫下大豆品种“ “ 离子分布表明，“ 片排出 由根控制的；通过对“ 制的研究表明，“ 根内 流入量比盐敏感的非排盐品种“ 的多。但在盐渍处理刚开始时，“ 运相当数量的 地上部，然后才有效地控制 地上部的转运。 X 射线微量分析表明， “ 根尖部的皮层里累积，说明根里累积 受皮层液泡中 多价螯合作用调节的（ et 1979）。 1994） 试验认为在 养液中鉴定大豆耐盐性，以茎部 含 培养液电导率达 7.5 ds，能有效的把具有排 “ “ 、“ 叶内 其他 15 个品种区分开；但当含 养液达 10.9 ds，除“ ，茎部 。由此认为在 0.9 ds度可能是具有排 a+的吸收和转运 有些大豆品种耐盐性的差异取决于大豆根中 排除能力和限制 叶片运输的能力（ et 1995）。进入栽培大豆木质部液流中的 向叶片运输过程中可被木质部薄壁细胞重新吸收，跨膜横向运输至韧皮部，再运送到根系，但对 用，所以茎基部 量显著高于叶片（ et 1994）。他们还提出了 通过质膜 H+ 逆向运输方式进入木质部薄壁细胞的假说（ et 1996）。 （ 2001）的试验表明，与盐敏感品种“ 比，耐盐品种“ 40 80 理下，无论蒸腾效率如何变化，都能有效地控制 叶片中的积累，因而推测“ 收和向叶片的转运并不是靠蒸腾作用被动调节。但当 度达 120 时，“ 片中 积累随蒸腾作用下降而中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 减少。可能是在较高浓度下，“ 主动调节作用已不能有效控制 吸收和向叶片转运，部分 蒸腾作用被动运输到叶片。此试验中，盐敏感品种“ 40 0 理下，随蒸腾作用下降， 吸收和向叶片的转运降低，叶片中 积累减少。认为盐敏感品种 根部向地上部的转运是靠蒸腾作用控制的。提高空气中的相对湿度能够增加盐敏感品种的忍耐性，但对耐盐品种效果不明显。比较“ “ 中量发现，“ 部积累很少的 说明“ 根比“ 较高的 除能力。 透调节作用 渗透调节是植物适应盐胁迫的最基本特征之一，植物为了消除盐胁迫所造成的伤害，通常在细胞内主动积累一些小分子有机化合物和蛋白类保护剂来维持渗透平衡和体内水分，一般称之为渗透调节剂（或保护剂） (这些小分子有机化合物有以下几类：（ 1）多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇等；（ 2）糖类物质，如蔗糖、海藻糖等 ；（ 3）氨基酸及其衍生物，如脯氨酸、甘氨酸甜菜碱（简称甜菜碱）等 ， 1992） 等研究表明，栽培大豆“ 种适盐细胞以积累 脯氨酸、可溶性糖等有机溶质对渗透调节也有贡献。 1997）发现大豆耐盐品种“ 和“ 盐胁迫下体内可溶性蛋白、脯氨酸等游离氨基酸及 K、 累，而盐敏感品种“ 内糖、蛋白质 、K、 物质减少。在含 选择培养基中获得的大豆小真叶愈伤组织，其脯氨酸 含量随 于愈伤组织进行渗透调节，吸水维持膨压。 脯氨酸作为耐盐性指标尚存在争议， 1995） 发现大豆“ 盐胁迫下，尽管生长量显著下降达 55%，干物质产量、有机酸和脯氨酸则无明显变化。 1987） 报道，大豆抗盐性强的品种“ 盐胁迫下，叶片脯氨酸含量增加和溶质势下降幅度均明显低于抗盐性弱的品种“ 并认为脯氨酸积累不能作为抗盐性或缓解盐胁迫的指标，而可能是一种伤害性反应。 （ 1994）发现，大豆品种“ “ 盐胁迫下根中磷脂含量和脂肪酸组分均无明显变化，而游离固醇和甘油三酯均上升，不同的是“ 中糖脂含量上升，而“ 保持不变，但 值由 升到 汝镇等 （ 1994） 的研究表明，低浓度盐胁迫使大豆籽粒蛋白质含量显著下降，脂肪含量显著提高，脂肪酸组成中的亚油酸和亚麻酸含量显著增加，油酸含量显著降低，并认为亚麻酸含量高利于作物提高抗逆性。但在高盐浓度下蛋白质含量显著提高，脂肪含量显著降低。万 超文等 (2002)的研究也得出相同结果，并发现相同盐浓度对不同耐盐类型品种作用效应不同，耐盐品种的蛋白质、亚油酸、亚麻酸含量及脂肪酸不饱和指数 （ 高于盐敏感品种。认为大豆籽粒蛋白质含量的提高，增强了细胞膜的亲水性，对盐胁迫的适应起到调节和保护作用，脂肪酸不饱和指数 （ 的提高增强了耐盐品种的耐盐性。 胁迫下膜脂、蛋白质和脂肪酸组分变化 植物的膜系统主要由膜脂和膜蛋白组成，膜脂包括磷脂、糖脂和固醇。植物耐盐性与膜透性的保持呈正相关。在盐胁迫条件下，敏感品种的细胞膜受到较重破坏其 透性发生显著变化，而耐