【毕业学位论文】（Word原稿）水稻第6染色体短臂产量性状QTL的分解与遗传验证生物化学与分子生物学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 水稻第 6 染色体短臂产量性状 分解与遗传验证 on rm on rm I 摘 要 本实验室 前期 利用珍汕 97B/密阳 46 重组自交系群体 ， 经初步定位，发现第 6 染色体短臂上的 研究群体的产量形成具有重要作用。 经 548 个 记检测，两亲本在 座位上呈多态。 本研究 选取第 6 染色体短臂 目标区间多态性标记 8 个和其它区间标记 18 个，检测 461个 系各 1 个单株 ， 筛选出一个在 间（约 杂合，在其他区间呈纯合的单株。进而以 208 个多态性 记检测该单株，结果发现该单株 除了在第 6 染色体短臂 间呈杂合，还在第 1 染色体长臂 间、第2 染色体长臂 间、第 4 染色体短臂 间、第 5 染色体短臂 间呈杂合。 但同一组合的前期研究未在这些背景区间检测到产量性状 这说明背景杂合区间对目标区间产量 位的影响较小。利用该单株衍生了一套由 221 个株系组成的 群体，建立 记连锁图 分解产量性状 并进而由此群体衍生了 4 个次级 生群体 ，进行进一步的验证和分解 。主要结果如下： 1 应用原始 生的 群体 ，发现完整目标区域中（即 在 3 个以上控制产量性状的区间。 将由 221 个株系组成的 体，种植于海南和浙江两地，考察每株穗数、每穗实粒数、每穗总粒数、千粒重、结实率和单株产量，应用 测 解水稻第 6 染色体短臂上控制产量性状的 结果表明， 在所分析的 6 个性状中，除穗数外 均 在第 6染色体短臂上的目标区间均检测到 别座落于目标区域中 3 个以上的不同区间中，单个群体性状表型变异的贡献率为 控制产量构成因子的 本以加性作用为主； 同一区间控制不同性状的 同区间控制同一个性状的 遗传作用模式、效应方向和效应大小上存在一定差异。 2 应用覆盖 目标区域中 间的三套近等基因系材料，分解出 3 个控制产量性状的 别位于 区间中 。 从上述 体中筛选获得 三套 次级 对 间 ，构建了三套 近等基因系 。经等位基因效应分析和交迭重组染色体片段代换系分析，分解出 3 个控制每穗实粒数的 2个控制单株产量的 些 别位于物理 距离 为 区间中，全部表现为加性作用为主，增效等位基因除 自父本密阳 46 外，均来自母本珍汕 97B。提出了构建新型 遗传材料 、 提高水稻 细定位效率的策略。 3 应用覆盖 间的次级 生群体，验证了目标区域底部产量性状 从原始 体筛选出在 间杂合，其他区间纯合的一个 交获得484 个 株，经标记检测后挑选在目标区间发生重组的 134 个株系和不发生重组的 20 个株系， 种植其 体。经分析，在 6 个产量性状上都在目标区间底部或近底部区域检测到显著的效应。这些 部表现为加性作用为主 ， 单个 群体性状表型变异的贡献率为 最大 坐落于 间 。 关键词 产量性状； 余杂合体（ 第 6 染色体短臂；水稻（ ） n in of by IL 7B/ 6. In of of in 61 IL 6 a to a in we 08 HL is in 7 in of . on of , on of , on of , on of . to TL in of of to TL of 2:3 21 a 2:3 by 21 2:3 in on of . as 1. in to or a 21 a HL 7 21 F3 .5 to of of of 1000 on of . of by TL as or in TL TL a in a 2. to of in of in of 21 F3 on in IL in at at at an of to TL in 3. a in of A a in 21 F3 A 84 by 34 0 no in 54 F3 TL by as by a TL in on of , in on of . of ; .） V 目 录 摘 要 . I . 文缩略表 . 一章 文献 综述 . 1 分子标记的种类及其在水稻上的应用 . 1 分子标 记得类型及特点 . 2 子标记在水稻遗传研究中的应用 . 4 位的原理与常用方法 . 5 构建图谱 . 6 图方法 . 8 位的精度 . 10 位的阈值 . 10 细定位 . 10 候选基因克隆 . 11 以性状和分子标记为基础的目标区域 等基因系 . 12 水稻 位的研究 . 12 水稻 位研究现状 . 13 水稻产量相关性状 位研究进展 . 13 本研究的目的和意义 . 14 第二章 第 6 染色体短臂产量性状 分解 . 15 材料和方法 . 15 生群体的构建和性状考察 . 15 取 . 17 分子标记的筛选和基因型鉴定 . 17 数据分析 . 19 结果与分析 . 19 表型变异 . 19 遗传连锁图的构建 . 21 目标区间的（ 定位结果 . 22 背景分离区间的 位结果 . 24 讨论 . 25 第三章 对 间内水稻产量性状 遗传验证 . 27 材料与方法 . 27 实验材料 . 27 取 . 28 标记检测 . 29 性状考查和数据分析 . 29 结果与分析 . 29 表型表现 . 29 以等位基因效应为基础的 解 . 30 以染色体片段代换系效应差异为基础的 解 . 31 讨论 . 34 第四章 对 间内水稻产量性状 遗传验证 . 36 材料和方法 . 36 实验材料与性状考察 . 36 取 . 36 标记检测 . 36 数据分析 . 36 结果与分析 . 36 表型变异 . 36 遗传连锁图的构建 . 38 对 间产量性状 定位 . 38 讨论 . 39 第五章 结论及进一步的研究展望 . 41 结论 . 41 三个相关实验分别得到的结论 . 41 全文结论 . 42 展望 . 42 参考文献 . 43 致 谢 . 56 作者简历 . 57 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 增片段长度多态性 BC 交系 合区间作图法 色体片断代换系 DH 倍双倍体 株产量 IM 间作图法 子标记辅助选择 于标记的分析方法 of 穗实粒数 等基因系 NP of 株穗数 合酶链式反应 量性状座位 机扩增多态性 制性片段长度多态性 余杂合体 组自交系 异 序列扩增区域 SF 实率 单序列重复 列标签位点 于性状的分析方法 000粒重 of 穗总粒数 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 1 第 6 染色体短臂产量性状 分解与验证 水稻 （ .） 是人类赖以生 存的主要粮食作物 ， 全世界约有 1/2 的人口以其为主要的食物来源。随着世界人口的不断增长 ， 粮食生产持续受到严峻的挑战 ， 因此 ， 高产育种今后仍然是育种工作的主要目标 ， 传统育种工作围绕这一目标已取得了丰 硕 的成果 ， 使农作物的产量潜力得到了高水平的发挥 ， 但 社会的发展对品种的产量提出了更高的要求。由于产量性状是由微效多基因控制的数量性状 ， 表现为连续变异 ， 受环境的影响较大 ， 不能依照质量性状的处理方法将单个基因的效应区分开来 ， 因此目前要想单独依靠传统育种方法和技术在现有基础上有大的突破 ， 难度越来越大。近年来 ， 数量遗传学和现代生 物技术的发展为作物育种赋予了新的活力 ， 借助 子标记和 图 ， 复杂的数量性状可剖分为若干孟德尔因子所决定的组分 ， 进而确定其在染色体上的位置及其与其他基因的关系 （ ， 1988） ， 分子标记辅助选择 （ 和转基因等技术手段的应用 ， 使作物育种的再次高速发展成为可能。 水稻不仅是重要的粮食作物 ， 而且还是单子叶植物分子生物学研究的模式植物。水稻是二倍体 （ 2n=24） 植物 ， 基因组是禾谷类作物中最小的 ， 单倍体基因组含有约有 38995%完 成测序 （ 2005） ； 并且 水稻中已经建立了高密度的分子标记连锁图 （ 和高效的转基因系统 （ ， 1991； 1994） 。水稻基因组与其他禾本科作物如小麦、玉米等有很高的共线性和基因间的同源性 ，在比较基因组研究中有 较大的利用价值 （ ， 1998， ， 2003） ；因此 ， 水稻己被认为是单子叶植物遗传、发育和基因组研究的模式植物。 第一章 文献综述 分子标记的种类及其在水稻上的应用 遗传学的发展在很大程度上是建立在遗传标记的发现和发展基础上的。遗传标记 （ 是指可以明确反映遗传多态性的生物特征 ， 是基因型的特殊的易于识别的表现形式。在经典遗传学中 ， 遗传多态性是指等位基因的变异 ， 在现代遗传学中 ， 遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。在现代分子育种研究中 ， 遗传标记的应用已 成为基因定位和辅助选择的主要手段。 遗传标记在经过了以基因表达产物为基础的形态标记、细胞生物学标记和生化标记之后 ， 随着分子生物学技术的发展又产生了一类重要的直接以基因为基础的遗传标记 ， 即分子标记。由于形态、生理和生化性状等遗传标记数量有限及可能存在的多效作用 ， 目前用于基因定位的标记主要为分子标记。与形态标记、细胞标记和生化标记相比 ， 分子标记具有以下优点 :（ 1） 直接以式表现 ， 在植物的各个组织、各发育时期均可检测到 ， 不受季节、环境限制 ， 不存在表达与否的问题； （ 2） 数量极多 ， 遍及整个基因组； （ 3） 多态性高 ； （ 4） 不影响目标性状的表达 ，中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 2 与不良性 状无必然的连锁； （ 5） 许多 分子标记表现为共显性 ， 能够鉴别出纯合和杂合的基因型 （ 贾继增 ， 1996） 。 由于这些特点 ， 分子标记广泛用于遗传图谱和物理图谱 构建 、生物进化 和 遗传多样性研究 、基因定位与克隆、分子标记辅助育种 等许多方面 的 研究。 分子标记的类型及特点 20 世纪 60 年代初 ， 1961） 提出在分离群体中利用足够数量的标记构建数量性状遗传图谱的可能性和方法。由于实验手段的限制 ， 经典数量遗传学一直把数量性状的多基因作为一个遗传整体用统计学的方法加以分析 ， 不能确定单个基因效应及其在染色体的位置。自从 作为遗传标记研究人类基因组 ， 随后用于植物基因组研究开始 ， 分子标记技术迅猛发展 ， 先后产生了 、 、 又称 和 等各种类型的 标记。根据分析手段和方法 ， 可将分子标记分为三类 （ ， 1999） ： （ 1） 基于杂交的分子标记 ， 如 （ 2） 基于 分子标记 ， 如 、 等。 （ 3） 基于 列和芯片的分子标记 ， 如 。但 图使用的分子标记主要为 限制性片段长度多态性 （ 是最早应用于图谱构建和基因定位的 子标记。 交的分子标记的方法 ， 它是指用限制性内切酶酶切不同个体基因组 酶切片段长度的差异。这一技术用放射性同位素 生化反应物 标记 段作为同源序列探针 ， 与经限制酶消化并转移到支持膜上的基因组总 交 ， 通过放射性自显影 （ 或非同位素技术 ）来显示酶切片段的大小 ， 检测不同遗传位点的等位变异 （ 多态性 ） 。 术首先在人类基因组作图中发展起来 （ ， 1980， 1987） ， 以后被广泛用于植物基因组作图（ ， 1986； ， 1988； ， 1991； ， 1992； ，1993） 。 术应用于水稻基因组研究 ， 已构建了相当饱和的水稻分子连锁图谱 ， 如美国 16 个 记 （ ， 1994） ；我国熊立仲等构建了含 612 个标记位点的水稻连锁图 谱 ， 其中 记有 312 个 （ 熊立仲等 ， 1998） ；沈利爽等 （ 1998） 利用 体构建了含 444 个标记位点的连锁图谱 ， 其中 276 个分子标记为 些图谱的构建为基因定位 ， 基因克隆及外源染色体 （ 片段 ） 的准确鉴定打下了坚实的基础。水稻上应用的 记主要包括水稻随机基因组 针、以及来自水稻、小麦、大麦、玉米等作物的 针等。由于 记是共显性标记 ， 检测可靠性高 ， 重复性好 ， 故 术对 求量大 ， 技术复杂 ，需要同位素 标记探针 ， 实验周期长 ， 信息量少 ， 限制了这一技术的应用 （ 伊佟明等 ， 1997） 。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 3 随机扩增多态性 技术 就是用一个 （ 有时用两个 ） 随机引物 （ 一般 8碱基 ） 非定点地扩增基因组 然后用凝胶电泳分开扩增片段。由于 物不受种属特异性和基因结构限制 ， 一套引物可用于任何物种 ， 非常适合群体遗传学、种质资源鉴定分类、生物多样性分析及目标基因标记筛选等研究。其操作简便易行 ， 不涉及同位素 ， 对 备的纯度要求不高 ， 且具有分析快、所需 品量小等优点 ， 因而已被广泛应用于基因定位、品种鉴别 （ 1994） 、群体或种的遗传变异 （ ， 1992； ， 1995） 及遗传图谱的构建 （ ， 1992） 等研究。 但是 由于 记是显性标记 ， 不能有效地鉴别杂合子 ，且易受反应条件的影响 ， 稳定性较差 ， 主要应用于连锁标记的初步筛选 （ ， 1995） 。 简单重复序列 （ 又称微卫星 （ ， 是一类以几个 （ 一般 1 ） 核苷酸为单位串联重复而成的 其长度一般在 200 1984； ， 1996） 。这种简单序列的重复次数存在丰富的多态性 ， 不同遗传材料重复次数的可变性 ， 导致了 度的高度变异性 ， 这一变异性正是 记产生的基础。尽管微卫星 布于整个基因组的不同位置 ， 但其两端序列多是保守的单拷贝序列 ， 术就是根据微卫星序列两侧的保守序列设计引物 ， 扩增 段 ， 从而检测出重复次数不同而导致长度变化的多态性。 记用于作图不但简化了遗传分析过程 ， 且利于不同作图群体间的标记转换（ ， 1997） ， 已经成为目前构建完整遗传连锁图谱时的首选标记。 记一般按照孟德尔方式分离 ， 呈共显性遗传 ， 重复性好 ， 稳定性好。 因其 具有 记的所有优点 ， 且多态性丰富 ， 是进行品种指纹分析、构建遗传图谱、研究目的基因连锁关系、开展基因定位和分子标记辅助选择的理想标记 （ ， 2002） 。 扩增片段长度多态性 （ 是一项结合了 术优点的 纹技术 ， 通过对基因组 切片段的选择性扩增来检测 切片段长度的多态性 ， 是目前为止作图效率最高的一种标记。典型的 析每次的反应产物经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测到的谱带数在 50之间 ， 所以一次分析可以同时检测到多个座位 ， 且多态性极高 （ ， 1998） 。它具有 稳定性和 术的高效性 （ ， 1995） ；此外还具有分辩率高 ， 结果可靠的优点 ， 理论上讲 ， 不管所研究的基因组有多复杂 ， 用 法都可以检测出任何 间的多态性 （ 王斌等 ， 1996） 。 术的主要不足是 ， 需要使用同位素或非同位素标记引物 ， 实验条件要求较高 ， 相对比较费时耗财。 前广泛应用于基因组研究、遗传图谱及指纹图谱构建、目的基因标记定位、基因组文库筛选、品种识别等领域 （ ， 1998； ， 1999； ， 1999； ， 2000） ， 它同 记 ， 起到补充 记的作用。 序标签位点 （ 是从一个随机选择的 隆进行 5端和 3端单一次测序获得的短的分序列 ， 代表一个完整基因的一小部分。 基因组中只出现一次 ， 任何单拷贝的多态性标记都可作为基因组的界标转变为 记 ， 例如 1994 年 将水稻 记转变成 63 个 记。用 行物理作图 ， 可通过 杂交途径来完成 ， 其分析结果稳定可靠。它 的突出优 点是共显性遗传 ， 很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记转移 （ ， 2003） 。不同的 染色体上的排列构成了染色体的 谱 ， 对基因组研究 、 新基因的克隆以及基中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 4 因图谱向物理图谱的转化研究具有重要意义。 特异序列扩增区域 （ 是基于 术发展起来的一种标记方法。首先对 然后根据此序列设计一对新的引物 ， 扩增特异的多态性片段 ， 用较高浓度的琼脂糖凝胶电泳检测。它可以克服 记稳定性和重复性差的缺点 ， 大大提高了标记的可用性 ， 具有快速、简便、准确等优点。随着研究工 作的发展 ， 会有越来越多重要作物农艺性状的 记被开发出来 ， 它们将在分子标记辅助育种方面发挥巨大作用。 子标记在水稻遗传研究中的应用 水稻分子遗传连锁图谱的构建 分子标记的出现 ， 大大促进了遗传图谱的构建。水稻中第一张遗传图谱是由美国康乃尔大学以籼稻 /爪哇稻 体构建的 ， 所用探针为 总 谱由 135 个探针构成 ， 覆盖 1389探针间平均距离接近 1988） 。第二张图谱仍然由康乃尔大学构建 ， 采用的是 （ 非洲型陆稻 /长 雄蕊野生稻 ） / 籼型陆稻的回交群体。探针标记达到 722 个 ， 覆盖基因组 1491标记间距离为 1994） 。 1994 年 ， 日本水稻基因组计划完成了含有 1383 个分子标记的高密度分子连锁图谱 （ ， 1994） ， （ 1998） 将图谱的分子标记加密到 2275 个 ， 总遗传距离达到 平均每 有 1 个分子标记 ， 同时构建了水稻 和物理图谱；到 2001年定位到该图谱上的分子标记己达 3000 多。 水稻基因的定位