【毕业学位论文】（Word原稿）猪POU1F1基因多态性和mRNA表达相关性的研究动物遗传育种与繁殖硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 猪 因多态性和 达 相关性的研究 on of of 士研究 生 ： 方 华 指导教 师 ： 郑友民 研究员 申请学位类 别 ： 农学硕士 专 业 ： 动物遗传育种与繁殖 研究方 向 ： 分子遗传 培养单 位 ： 研究生院 畜牧研究所 提交日期： 2006 年 6 月 on of of s. 006 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 ，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论 文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 本 研 究 由 国家 “973”计划 (编号： 国家 自然科学 基金 项目 (编号： 39970542) 资 助 by 73” 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 猪 因多态性和 达相关性的研究 论文作者 方华 指导教师 郑友民 培养单位 中国农科院畜牧所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 评 阅 人 张 勤 教授 博导 中国农业大学 动物遗传育 种与繁殖 杜立新 研究员 博导 中国农业科学院 畜牧研究所 动物遗传育 种与繁殖 答辩 主席 杨 宁 教授 博导 中国农业大学 动物遗传育种与繁殖 答 辩 委 员 王志刚 高级畜牧师 博导 全国畜 牧兽医总站 动物遗传育 种与繁殖 杜立新 研究员 博导 中国农业科学院 畜牧研究所 动物遗传育 种与繁殖 马月辉 研究员 博导 中国农业科学院 畜牧研究所 动物遗传育 种与繁殖 关伟军 研究员 博导 中国农业科学院 畜牧研究所 动物遗传育 种与繁殖 答辩时间、地点 记 录 李宏滨 I 摘 要 垂体特异性转录因子 1（ 调控垂体 基转录的重要反式因子，对动物正常的生长发育具有重要的生理意义。 突变可能造成人类的综合性垂 体激素缺乏症，引起早期组织器官发育不全，产生侏儒体态等临床病症。而 猪的生长性状同样具有重要影响， 被视为与生长相关的候选基因之一。 本 实验 以大白猪（英系）、中畜黑猪、荷包猪、香猪为 实验 材料，对其 态性进行 测分析，同时提取 实验 动物垂体的总 过实时定量荧光 达水平进行定量分析，寻 求 多态位点和基因表达量间可能存在的相关。 本 实验 共确定了在第一内含子 （ 1515） 、第四外显子 （ 273） 和 第四内含子到第六外显子 上的 4 个多态 位点 ，并结合生产数据分析了 上述位点的 生长性状关系。研究发现不同猪种 四外显子 （ 273） 的 基因型分布存在较大差异，大白猪和中畜黑猪群体中以 因型为主，有少量 因型个体；而香猪群体中以 因型为主，无纯合 因型；荷包猪群体中三种基因型均有分布。 该位点 因型 和大白猪背膘厚( 第一内含子 1515存在 T C 的突变，该突变和屠宰前日增重相关系数为R= 断奶后 20 天增重快（ P=发现 因型在 高的家系，背脂厚度有显著效果(P=而在 低的家系，大理石纹明显（ P= 2004） 等通过 测了 因从内含子 2 到外显子 6 内各个片段的多态性，在第三内含子，第四内含子和第五内含子上各发现一个新的多态性位点，但是，这些多态性和生长及胴体性状无显著相关。 因在猪中的研究进展 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 平上的研究 猪的 因已经被定位在猪的 13 号染色体上的 域。已知 长 876码 292 个氨基酸，包含 6 个外显子。其中， 128 至 198 位的氨基酸，而 14 至 273 位氨基酸。猪的 因序列与已知的一些哺乳动物的 列同源性高达 95%，序列上的区别多出现在 N 端区域中， 域则高度保守。 已经克隆并测序了 因组区域。 由于 因对 因均有关键性的表达调节作用，研究者们对其作为生长调节的候选基因抱有希望，并对 因的多态性和猪生长及胴体性状关系进行了一系列的研究。 （ 1993）开始关于 因多态性和猪生长及胴体性状关系的研究。通过 能区的猪的 段，发现在蛋白质水平上猪的 鼠的同源性达到 95%，他在中国 梅山猪 因中发现了一个 多态基因座，而 5 个美国猪种中没有发现同样的多态基因座，与之相反， 1994）发现的 多态性在美国猪种中呈现多态性，而在中国猪种中呈现单态。 为了研究 因与猪生长和胴体性状之间的关系， （ 1994）选用了 5 个 3 代杂交资源家系，包括梅山大约克，梅山汉普夏，梅山长白，荷包猪汉普夏，荷包猪长白。记录它们的生长和胴体性状指标包括初生重、 21 日龄和 42 日龄体重、平均日增重、几个背膘厚测量值，眼肌面积、肉色等等。用限制性内 切酶 切，通过统计寻找因多态性和生长性状的关系。结果显示， C 基因型的猪相对于 因型的猪，有较高的初生重和较大的背膘厚。由此认为， 猪早期生长性状存在相关，是标记早期生长性状的候选基因。 一个控制生长的 域已经确定在 13 号染色体上，而 因被定位在这个 源家系中，利用 序将 4 种微卫星 记和 因连锁定位。此连锁信息将用于在 13 号染色体上区间定位初生重和早期生长 2004 年，庞瑾等用 术对 7 个中国猪种， 4 个外国猪种共 11 个 实验 动物群体 508 头个体进行了猪 因的遗传变异研究。结果在 7 个中国地方猪种因第 4 外显子上发现一个突变位点，序列测定结果表明，其单核苷酸变异是由碱基 的替换造成，但并没有导致编码氨基酸的改变，均编码组氨酸； 在 4 个国外引进猪种因的包括部分内含子 4，全部外显子 5、内含子 5、外显子 6 及部分 3侧翼的 1747验证了一个 态位 点。 俞沛初（ 2004）采用 序方法，对香猪，上海白猪，大约克夏猪的 香猪 列的第 4 内含子和第 5 内含子发现了 G 到 在上海白猪和大约克夏猪中未发现此类突变。 平上的研究 2004 年，俞沛初等采用 方法对香猪及对照猪种（上海白猪，大约克夏猪） 增，并以 内参照进行基因表 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 7 达水平的半定量分析。结果显示香猪 因及 因的 表达水平均显著低于上海白猪和大约克夏猪，在 因的表达水平差异也接近显著。由以上结果他推论香猪 因的表达水平降低，减弱了 白对 因转录和表达的激活作用，导致香猪生长缓慢和矮小性。 作用 基因 H 生长激素 (由脑垂体前叶嗜酸细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，对各种动物进行的皮下埋植、注射外源 研究结果表明 : 动物具有显著加快肌肉、骨骼生长 , 降低脂肪沉积 , 促进 生长发育 , 提高饲料利用率的作用 (宋成义 ,1990)。 猪生长激素（ 研究起源较早，多集中在蛋白水平，也就是激素分泌和功能上的研究。 等电点为 6，与其他种属的 相同的表位，这与它们序列的相似性有关。 191 个氨基酸组成 , 分子量为 22有两个二硫键 , 一个连接 53 与164 处胱氨酸残基 , 另一个连接 181 与 189 处胱氨酸残基 , 这两个二硫键使得分子形成两个环。人们现已知道 晶体结构 (图 从图中可以看到 , 每个 两个 合位点 1 和2, 它们在空间上是彼此分开的。结合位点 1 在分子的右边 , 组成了 A、 B 的表面和 结合位点 2 在左边 , 组成了 A 和 C 表面。 图 长激素基因空间结构示意图 1-3 H 般认为 （ 再以内分泌方式作用于靶器官，从而达到调控血清和相关组织中葡萄糖、胰岛素和 度的作用。 C. M. 1964）研究发现， 于 浓度都会产生影响，但是在猪血浆中检测到的是 度的延迟性升高，这种延迟的变化是由于 于胰岛素样生长因子连接蛋白（ 连接发生作用，而对于 连接效率作用不明显。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 8 一种计量依赖性的方式刺激骨的纵向生长。除了促进生长，它对骨的形 成和发育也有重要的调节功能。 998)等证实 以直接或者间接的作用于成骨细胞的分化、增殖和成熟以及 I 型胶原的生成同时通过 细胞因子，抑制破骨细胞的形成，影响其成熟，并诱导它的凋亡。鲍丽颖（ 2002）认为，对于切除了垂体和卵巢的大鼠，注射 但可以增加体重，提高血清骨钙素水平， 平，而且可以增加胫骨纵向生长率和胫骨长度。 脂肪的合成有显著影响。 猪背膘厚和胴体脂肪含量降低。研究发现，注射生长激素的猪，皮下脂肪组织中葡萄糖 6果酸脱氢酶 、异柠檬酸脱氢酶的活性均低于未注射生长激素的猪，差异极显著（ 明标准品可用。 900荧光定量 (1)准备做 用的 实验 用品及 ，放置于冰上。 (2)采用 15 l 的上样体系 板 0M) 0M) 通用 体积 l 配制 一干净的离心管中一起混匀后再分装到不同的 中 (3)开 的顺序打开定量 每次做 6 个标准样品 ,每个样品做 2 次重复。 (4)进入 5700 序下 ,设置 应界面及反应条件，保存所有设置。 中国农业科学院硕士学位论文 第 2 章 第二章 材料与方法 38 (5)设置并运行 序： 50 2消除非特异扩增及遗留污染 95 10活化 40 个循环： 95 变性 1556 退火 302 延伸 15 95 1S 取融解曲线 (6)反应结束后 ,保存反应结果 ,关闭 和连接 ,分析数 据。 据统计及分析 态性和生长性状的相关分析 本 实验 对多态性和生长性状相关性的分析 采用 关 （积差相关），将 因型定义为数值 1， 因型定义为数值 0， 因型定义为数值 品种内 分析个体的基因型和各个生长性状的相关。 量数据的结果处理和分析 根据 应的动力曲线图、线性图谱和半对数图谱选择适当的 和域值 ,以得到理想的标准曲线图。各样品的 与标准曲线进行比较得出其起始模板拷贝数 ,将此结果保存并输入到 中进行分析。 在 达的定量分析中，首先用持家基因 反转录产物进行 内参 定量 (然后再在所研究的 目的 基因定量 (扣除样品 内参定量 (Q=1)，所得数值即为我们对样品进行研究比较时使用的结果。以上研究中所得的数值都为相对定量时所使用的数值，只是用来对不同样品的同一基因进行比较的，不具备绝对数量意义，而且不同基因间不能用来相互比较。每次 实验 的相关性都保证在 上，确保较好的 实验 效果。 计分析和 实验 设计所用软件 数据分析软件： 引物及探针设计软件： 900光定量 据分析软件： 司的 7900凝胶成像系统分析软件： 生物信息网站： 。 图 因组 取 效果图 （右 1： 00600 2: 已知 450段） 3NA 据 图 见，基因组 带清晰明亮，无拖尾现象，条带聚成团块状 ，加样孔内无残留亮带 。和 比，条带的位置高，说明片段长度大。由此可知，基因组 取完整，降解量小，浓度高 ，无可见的蛋白质污染 。 通过紫外分光光度计测 定，提取溶液 度在 g/l，浓度较高，需要 38 倍稀释后才可用于 增反应。 四外显子多态位点 的 态性检测 增效果 图 四外显子多态位点的 增产物 2%琼脂糖检测 3CR of 1据 图 见， 增条带单一，长度在 100200间。由此可知，扩增产物为目的片段，特异性良好，可用于后续的 泳检测。 四外显子多态位点扩增产物 析 四外显子多态位点扩增产物进行 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后效果如 图 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 结果和分析 40 图 2%聚丙烯酰胺凝胶电泳银染结果 32%of 图中可见，通过 12%的聚丙烯酰胺的凝胶电泳，片段 产生了 3 种带型，其中，产生了 4 条带的带型定为杂合的 因型，另外两种只产生 2 条带的带型分别定为纯合的 因型和 因型。 性克隆测序结果 挑选 因型和 因型个体各一，扩增产物转入感受态细胞，克隆筛选后回收质粒进行酶切检测，产物电泳如 图 1 扩增产物阳性克隆质粒 酶切鉴定图谱 1 为以阳性克隆质粒 模板的 159增产物 2 为蓝斑对照阴性克隆质粒 为 切白斑阳性克隆的质粒 为以猪基因组 模板的 159增产物 31 性克隆经 酶切后，出现了 159插入片段。因此，可以证明转化成功 测序结果： 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 结果和分析 41 测序序列为纯合 因型，其中阴影部分分别为 5端上游引物序列和 3端下游引物序列。斜体部分为比对后发现突变的位点。 测序序列为纯合 因型，其中阴影部 分分别为 5端上游引物序列和 3端下游引物序列。斜体部分为比对后发现突变的位点。 对猪 因第 4 外显子的两个纯合基因型的序列对比发现： 因型在第 52 位碱基序列处产生了一个 C T 的突变，而 因型在该碱基序列处和 已知序列相同（ 因频率和基因型频率的统计 分别对大白猪、中畜黑猪、香猪、荷包猪该位点的基因型和等位基因频率进行统计，结果如 表 表 因 点 基因型和等位基因频率 1 白猪 畜黑猪 . 香猪 包猪 A 个体数量 AA 8 34 4 因型频率 AA 0 体数量 AB 10 9 6 因型频率 AB 体数量 BB 0 10 2 因型频率 BB 0 0 体总数 2 42 19 12 A 等位基因频率 B 等位基因频率 根据 表 知， 点各基因型在不同猪种中的分布有很大差异，在大白猪和中畜黑猪中， A 等位基因分布占优势，在香猪中， B 等位基因分布占优势，在荷包猪中， A、B 的分布基本均衡。从基因型分布来看，大白猪和中畜黑猪的 合基因型分布占优势，无合基因型存在；香猪的 因型和 因型分布基本平衡，无 合基因型存在；在荷包猪中，杂合的 因型在种群中占优势地 位。 四外显子多态位点的杂合度和多态信息含量 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 结果和分析 42 4 个 实验 猪种的 因 点 测的纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量的计算结果见 表 表 因 点 纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量 he 1 传参数 大白猪畜黑猪. 香猪 包猪 o （注： 高度多态 ,高度多态 ,高度多态 ,用步移式的 法进行多态位点寻找工作量大，因而首先参考发布的序列 成义， 2005)，设计引物，扩增一条较长的片段，从样品中随机挑选若干个个体扩 增后进行克隆测序，从中找到适合的位点设计引物进行全部样品的测，并进行数据分析。 6 的 增效果 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 结果和分析 53 图 脂糖凝胶检测 增产物 3-9 of 7 图 脂糖凝胶电泳检测 1956增产物效果图，右一 为 上到下的片段长度依次为 20001500120080050020015 泳道分别为5 个不同样品的扩增，通过和 较可以推算其长度在 15002000 之间，无非特异性扩增条带，条带明亮清晰，可用于回收及后续的克隆转化工作。 选取中畜黑猪、香猪的样品各一，用引物 行 增，纯化后克隆测序。 性克隆检测效果 图 6 扩增产物阳性克 隆质粒 酶切图 3956bp 脂糖凝胶电泳对猪 因 增片段 1956阳性克隆的鉴定，左一和右一 均 为 段长度依次为 2000 15001200 800 500 200出现在图中 ） 其 余五个标示泳道 14 为阳性克隆质粒的 切产物， 5 为阳性克隆质粒。阳性克隆经 切后，出现了 1956插入片段，另一片段与无插入片段的质粒长 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 结果和分析 54 度相同，而阳性克隆质粒未酶切的片段大于酶切后的两个片段，由此可以证明转化成功。 序结果的 析 测序所得结果与标准序列 成义， 2005）比对，所得 果如附表2。 根据 果，寻找该片段的 点见 表 表 6 中存在的 点 NP in 6 74 576 1515 852 854 1793 入 入 1007 1009 1948 157 1159 2098 321 1323 2262 T 插入 1322 1324 2263 T 插入 T 插入 1472 1474 2413 501 1503 2442 1578 1580 2519 694 1696 2635 A 插入 A 插入 1699 1701 2640 C 缺失 C 缺失 1702 1704 2643 C 缺失 C 缺失 1753 1755 2694 775 1777 2716 据 表 选在本 实验 群体中可能有多态 性存在的位点，（ 1515， 2098， 2442）针对该位点设计长产物度 300内的引物，并尝试进行 增，最终确定 物（针对 1515 位点 T C）用于 8 的 态性检测 8 的 增效果 对基因组 行引物 增，其产物检测如 图 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 结果和分析 55 图 8 扩增产物检测 3CR of 8 据 图 见， 增条带单一，长度在 200右。由此可知，扩增产物为目的片段，特异性良好，可用于后续的 泳检测。 8 扩增产物的 析 图 8 扩增产物的 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳银染结果 3of 8 8 扩增产物进行 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后效果如 图 图中可见，通过 12%的聚丙烯酰胺的凝胶电泳，片段 产生了 3 种带型，其中，产生了 3 条带的带型定为杂合的因型，另外两种只产生 2 条带的带型分别定为纯合的 因型和 因型。 8 扩增片段的 物测序 挑选 因型和 因型个体各一， 增纯化后直接送交 测序公司进行 物测序。测序结果： 因型： B 基因型： 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 结果和分析 56 测序结果可知，突变位点和 对出的位点一致，即对于 1515 位（本片段 134 位）发生了 T C 的碱基突变。 因频率和基因型频率的统计 分别对大白猪、中畜黑猪、香猪、荷包猪该位点的基因型和等位基因频率进行 统计，结果如 表 表 因第一内含子多态位点 基因型和等位基因频率 in 白猪 畜黑猪 . 香猪 包猪 A 个体数量 AA 1 29 12 4 因型频率 AA 体数量 AB 9 6 5 因型频率 AB 体数量 BB 4 1 3 因型频率 BB 体总数 2 42 19 12 A 等位基因频率 B 等位基因频率 根据 表 知， 第一内含子多态位点在大白猪、中畜黑猪和香猪中的等位基因频率和基因型频率基本相似，均为 A 等位基因占优势， 合基因型在群体中占绝对优势地位 。而在荷包猪中， A 等位基因和 B 等位基因的分布基本平衡，三种基因型在该种群内频率相似。 因第一内含子 态位点的杂合度、有效等位基因数和多态信息含量 4 个 实验 猪种的 因 点 测的纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量的计算结果见 表 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 结果和分析 57 表 一内含子 态位点的纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量 he 8 传参数 大白猪 畜黑猪 . 香猪 包猪 o （注： 高度多态 ,虽然置信度不高，但是相关系数依然达到了中等相关，因此推论，该位点多态性对大白猪的生长性状影响不显著，但是在断奶重与断奶前日增重两个性状上，基因型对其的影响趋势可能与对荷包猪的影响趋势一致。即检测中出现频率较少的 B 等位基因更有利于断奶前日增重和断奶重平均水平的提高。 通过 达水平的检测，发现在黑猪群体中，该突变位点产生的各基因型和 达水平 存在显著负相关，即 B 等位基因的加入将导致 达量的提高，这和该基因在 平与生长性状取得的相关关系一致，由此 推论， 切多态位点的 B 等位基因可能更有利于 因的表达， 并可能 进一步对猪早期生长性状产生影响。 中国农业科学院硕士学位论文 第四章 讨论 71 尽管在一个杂交家系中找到了初生重等 14 个生长和肉质性状方面的参数与 是在另一个 实验 用的杂交家系中未发现这种相关的存在；而 实验的结果提示 ， B 等位基因更有利于 生长后期的表达，而 B 等位基因在生长性状上表现出有利于断奶前体重的增长，但这种增长速度的提高是否和同时期 达量的提高有关尚需进一步论证。另一方面，最初 研究中发现， 该位点多态性仅在国外猪种中出现，庞瑾在 实验 中验证了这一现象。但 米海峰认为梅山猪和二花脸猪同样存在此位点的多态性，本实验 在荷包猪群体中也发现有 因型和突变的 因型存在。 这些相互矛盾的结果可能是由于采用 实验 品种的不同造成。 综上所述， 切多态性和生长性状的相关关系可能受到品种的 制约，相关的可信性还需要进一步扩大供试群体进行验证。 四内含子至第六外显子间 1747 扩增片段 的 切多态性 米海峰在对猪 因的部分多态性与繁殖性能相关的研究中发现， 第四内含子至第六外显子间 1747 扩增片段 的 1747的扩增片断中存在一个 酶切多态片段，该片段 的多态性和其中一个 实验 猪种的经产母猪的总产仔数存在联系，突变基因型 产仔数比野生型 仔数高，差异显著。 本 实验 通过对各 实验 样品 第四内含子至第六外显子间 1747 扩增片段 扩增产物切 检测，证实了该酶切片段多态性的存在，并进行了该片段 多态性和各生长性状的相关性分析。由于 实验 样品均为育肥猪，无母猪产子记录，因此无法验证 切多态位点和繁殖性状的相关关系。从该多态片段 和生长性状相关分析来看，该片段 在黑猪群体中发现与背膘厚（ R=在相关 ,但是在大白猪群体和荷包猪群体中未发现显著相关。该多态片段和各相关基因定量分析的结果在大白猪群体内发现基因型与 表达存在相关，且相关达极显著水平（ P 由于条件所限，无法分析 达量是否与各时期生长性状存在相关，因此无法准确解释在大白猪群体内可发现 基因型和 达量水平有显著正相关，但在生长性状上无法发现显著相关关系的现象。仅能推论出三种可能： 1. 相关基因生长后期的表达量和生长前期 可能 无确定的相关关系， 素的主要功能为促进母畜泌乳，增强动物的免疫力，而对家 畜自身的生长影响较小，因此表达量的提高在生长性能上无显著影响。 2. 在大白猪群体内，受到该位点的影响 表达水平有显著差异，并 可能 进而影响了 表达水平，但是 对于二者生理功能和蛋白质浓度并未产生明显的影响，因此在生长性状上没有相关的体现。从中亦可推测该变化可能引起 能的细微变化，因为 达量的变化仅引起 达量的变化，对其他两个相关基因的表达并未产生显著影响。 3. 在中畜黑猪群体内，受该位点影响 实验 样本的背膘厚有显著差异，但在 达量上并未发现显著关系，由此推论该位点在黑猪群体内对背膘厚的影响可能不是通过 国农业科学院硕士学位论文 第四章 讨论 72 表达量水平的变化形成的。 在不同群体中分别发现了该位点与生长性状、 达水平的相关，而且相关性均达到显著，因此推论该位点的多 态性 可能会具有一定的生理意义 ， 但是其生理功能或效用的变化尚 需要扩大样本数量进一步进行验证。 第一内含子 态位点与生长性状和表达量间的关系 猪上的研究过去一直基于 布的 列进行。该序列包括第四外显子到第六外显子间的序列，而第一外显子到第三外显子间一直没有确切的序列公布。2005 年 3 月，宋成义等在 首次公布了猪 因部分第一、第二外显子和全部第一内含子的序列，编号 至目前为止，还没有该区域多态性的报道。 本 实验 从该序列中截取了约 1956的片段进行扩增，通过克隆测序发现该序列中存在若干 点，但是，多态位点数量显著低于 第四内含子至第六外显子间 1747 扩增片段 片段。本实验 首次分析了第一内含子中部的一个 点在四个猪种中分布的情况，并讨论了由于此位点突变产生的各基因型和生长性状、 达的相关关系。 通过该位点基因型与生长性状的相关性分析发现，该位点的突变和大型猪的后期平均日增重存在显著相关，这和以往通常认为 生长前期具有更多影响的结论有所不同。 而该位点的多态性与 因表 达量不存在相关关系，但在中畜黑猪群体中发现与 R=P=,由此推论在中畜黑猪群体内，第一内含子分的各基因型中 B 等位基因的出现更有利于 期的转录表达。 一外显子和第二外显子主要编码 N 端转录激活区） ,N 端转录激活区由 75个氨基酸组成，为富含羟基氨基酸的高度保守区，其中羟基氨基酸含量达到 30以上，它的结构很像 合酶 1 中的大亚基，含有数个脯氨酸，无螺旋结构，在功能上为转录激活靶基因启动子的主要部位。由于其生物学功 能上的重要性，因此第一、二外显子间的基因序列保守性更强， 现的频率显著低于第四外显子到第六外显子间的序列，引起生物学功能变化的点一旦出现，可能使突变动物体的生存能力下降或生长性状发生显著改变。在漫长的自然选择和人工选择过程中，该区域序列的保守性得到了进一步的巩固。 内含子是高等生物独有的特征，内含子序列从 体中删除可以形成成熟的 一过程称为 剪接（ 经剪接产生的成熟 作为蛋白质合成的模板。接有特定的位置和特定的碱基序列，剪接位置的 信号序列出现突变时会破坏有效和正确的剪接，导致表达错误，引起生理突变。这种引起剪接位点变化的点突变大约占全部突变的15%，现已记载的由于点突变影响剪接而引起人遗传缺陷的病例有几十种，在猪 因中也发现第三外显子和第四外显子上存在可变剪切位点的突变。可能引起可变剪切，形成3 4缺失第三外显子或第四外显子的 关于内含子剪接信号外的突变对猪基因表达和性状的影响也有相关报道。刘桂兰、蒋思文等采用 术 ,分析了 因第 8 内含子部分 片段在猪资源家系群体中的 切片段多态性分布。 因片段具有两个 酶切位点 ,两位点在资源家系中均具有多态性因 B 位点酶切未突变个体均比酶切突变的个体背膘薄 P 肥肉率低 中国农业科学院硕士学位论文 第四章 讨论 73 P 瘦肉率高 P 位点 A 具有相同的影响趋势。 滕勇、经荣斌等以 为内切酶，检测猪 因中片段为 2.1 第三内含子中的多态位点，分析各多态位点在长白猪、杜洛克猪、小梅山猪、香猪、姜曲海猪 5 个品种群中的分布，并经 X 2 检验比 较这 5 个猪种间的基因型差异 。 X 2 适合性检验结果表明： 酶切突变位点的 3 种基因型在 5 个品种中分布差异均极显著 (P中国地方品种小梅山猪、姜曲海猪等位基因 C 的比例很高，中国地方品种香猪等位基因 C 的比例则比较高，国外品种长白猪、杜洛克猪等位基因 C 的比例很低，但是，未进行该内含子突变位点和生长性能的相关性分析。 本 实验 中找到的位点虽然处于第一内含子中部，没有产生可变剪接位点，很难引起 通过