【毕业学位论文】（Word原稿）1B-1R易位系小麦中ω-黑麦碱基因的研究-植物分子生物学与基因工程博士论文

密级：内部三年 论 文编号： 博士学位论文 1B/1 in a B/1R in a B/1R I 摘 要 小麦 1B/1R 易位系是由小麦 1B 染色体的短臂被黑麦 1R 染色体的短臂取代后形成的。这种易位系由于普遍具有抗病、高产、稳产和适应性广等特点在世界各地得到了广泛的应用。 1B/10 年主要推广和育成品种（品系）的 45%。由于 1 成 了 1B/1R 易位系面包和面条加工品质普遍较差。本研究拟在了解 录及其表达的基础上，通过高效 涉沉默 便实现对 1B/1R 易位系小麦加工品质的改良。 兰考 906 是一个典型的抗病、高产、适应性广但面包加工品质差的小麦 1B/1R 易位系，本文首先以该品种为材料用同源克隆法对 究发现 11501076107510521004同长度的成员数目 差别很大，其中以 1076成员数目最多，为 9 个，其它几个长度的成员数目分别为 1、 1、 2 和 2 个，在以上五种不同长度的成员中，只有 1076的 2 个成员、 1052 1 个成员和 1004 1 个成员具有转录活性。通过原核表达确定了其中三个具有转录活性的 根据 建了具有发卡型结构的 涉表达载体，并通过基因枪转化，得到了 95 株再生植株，其中 3 株 测呈阳性，但没有得到 利用同源克隆时设计 的 因特异性引物结合使用， 开发了一个用于检测小麦 1B/1R 易位系及其纯合性与杂合性的新型共显性 记，并用该标记对 103 份小麦品种（系）、 30 个 离群体及其亲本进行了检测，检测效果十分理想。为了简化检测步骤，本研究还建立了一种适于 增的小麦基因组 速提取法，该方法中的 取液不含 巯基乙醇，后续操作不用酚和氯仿，操作步骤简单，而且提取的 量较好。 关键词 ：小麦， 1B/1R 易位系，黑麦碱，基因克隆，分子标记 B/1R is B in by R in of of it B/1R 5% in of in to be of be by is to NA to in to of of B/1R 06 is a B/1R is In it to a on of 1150107610751052bp 0049 0761 1501 0752 052bp 004In 076052bp 004bp of on on NA 5 in as no in in a of BS a CR of B/1R 03 30 F2 In to a NA in NA do be in is NA is 1B/1R 录 第一章 绪 论 . 1 B/1R 易位系小麦的起源及在我国的应用情况 . 1 B/1R 易位系的起源 . 1 B/1R 易位系 在我国小麦育种中应用的历史及现状 . 2 B/1R 易位系在小麦生产中存在的问题 . 2 B/1R 易位系加工品质差的可能原因 . 3 决 1B/1R 易位系小麦品质差的可能途径 . 4 麦 1B/1R 易位系的检测 . 4 涉及其在植物基因功能研究和作物改良中的应用 . 5 涉现象的发现 . 5 涉现象的作用机理 . 6 涉在植物基因功能研究及性状改良中的应用 . 8 麦遗传转化技术研究 . 10 因枪法 . 10 杆菌法 . 12 粉管通道法 . 12 基因技术在小麦品质遗传改良方面的应用 . 13 第二章 录及其原核表达 . 14 料与方法 . 14 麦材料 . 14 麦基因组 提取 . 14 子发育期总 的提取 . 15 成 . 16 增 . 17 物的克隆 . 17 隆片段的测序 . 19 交 . 21 交 . 23 . 24 果与分析 . 27 物的特异性 . 27 物的测序结果 . 28 一长度基因组克隆的序列比较 . 29 因组序列与 列之间 的比较 . 31 同长度基因组克隆的序列比较 . 33 交分析 . 35 . 36 论 . 37 第三章 涉表达载体的构建与转化 . 39 料与方法 . 39 株 . 39 础质粒 . 39 体小麦品种 . 40 菌培养用基本培养基 . 40 麦转化用相关培养基 . 40 物设计与 增 . 41 杆菌表达载体由大肠杆菌向农杆菌的转移 . 41 因枪子弹的制备 . 42 麦外植体的准备 . 42 因枪轰击 . 42 化体筛选与植株再生 . 42 交 . 42 子醇溶蛋白凝胶电泳 . 43 果与分析 . 43 物设计的特异性 . 43 合基因枪和花粉管转化的表达载体的构建 . 43 合农杆菌转化的表达载体的构建 . 47 生植株的获得及其分子与功能检测 . 49 论 . 50 第四章 小麦 1B/1R 易位系新型分子标记的开发与应用 . 52 料与方法 . 52 料 . 52 麦基因组 提取 . 52 速提取法提取 质量检测 . 53 增 . 53 果与分析 . 54 测 1B/1R 易位系新型共显性 记的建立 . 54 速法提取 完整性及其浓度 . 55 速法提取 增 . 55 型共显性 记的应用 . 56 论 . 58 第五章 全文结论 . 60 参考文献 . 61 V 附录 同源克隆中得到的 列 . 70 致谢 . 错误 !未定义书签。 个人简历 . 错误 !未定义书签。 中国农业科学院博士学位论文 第二章 录及其原核表达 1 第一章 绪 论 黑麦 ( . )是小麦属的近缘物种 ,它在抗病性、丰产性及广泛的适应性方面都 具有可用于改良栽培小麦的优良农艺性状 , 黑麦的染色质导入普通小麦 ( . ) 最常见的是 1它携带有一些重要得抗病虫害基因 ,如抗条锈病 ( 、叶锈病 (、秆锈病 (、白粉病 ( 和抗虫 (基因（ ， 2001）， 1B/1的培育最初是为了向小麦导入黑麦的抗病性 (973;984)，而另一种有关 1 11978），除抗性基因以外， 11984； 1991； 993; 994; 1994; ， 1995; 1996; 1996； 1998） , 1B/ 1大促进了世界范围的小麦生产。 1虫、高产、稳产适应性广的特性以外，还有一些其它的特性，与山羊草属的粘果山羊草 (易变山羊草 (偏凸山羊草 (和二角山羊草 (细胞质的细胞质相结合，曾培育出粘、易、偏和二角型 1麦雄性不育系， 11991）和改进小孢子来源 的单倍体胚再生的能力（ 1993）， 1为一个组织培养和遗传转化的优良品种可能并非偶然。 B/1R 易位系小麦的起源及在我国的应用情况 B/1R 易位系的起源 至少有两个也可能是三个独立起源的 1B/1个 1B/11983)，代换系再与小麦杂交就产生了 1 由 俄罗斯的 各种渠道传到了世界各地。 起源于德国的这两个 11997)，它们的分子标记及其对杆锈和叶锈小种的反应是完全相同的，据报道由 由 1998），可也有报道说由 育的易位系被分发到了整个德国的小麦育种项目当中(1997)，不管其起源到底如何，这两个易位系带给小麦的表型几乎是一样的 (1983; 1997)，两者都带有抗杆锈、叶锈、条锈和一个白粉病基因，只是白粉病抗性基因在某些小麦背景下会被抑制 (1996)。 第三个 1两 个八倍体小黑麦杂交选育而成 (1983)，该易位系对 欧洲的 1易位系在小麦品种改良项目中应用不是太广，根据分子标记检测的结果，该易位系与德国的易位系来源不同 (1997)。 涉及 11位系 第二章 录及其原核表达 2 1995; 1993)由美国培育，其 1其抗谱和分子标记并不相同 (1994;1999)，因为黑麦是异花授粉作物，群体内遗传组成具有异质性，这种易位系在美国的小麦生产中也得到了比较广泛的应用，但没有传到其它国家。 1 11973），但到目前为止，这类易位系还没有在生产上得到应用。 B/1R 易位系在我国小麦育种中应用的历史及现状 1B/ 1R 易位系引入我国是在 20 世纪 70 年代初，其中品种 阿夫乐尔）、前麦）、高加索引自前苏联， 0 （洛夫林 10 号 )、 3 （洛夫林 13 号 )引自罗马尼亚， 朱特 )引自德国， 阿龙爪 )引自墨西哥 , 这些易位系对当时的条锈病和白粉病流行小种表现免疫或高抗 , 其另一些突出特点是大穗多花 , 耐高温 , 落黄好，这些材料于上世纪 70年代 从国外引进以后被广泛用做育种亲本 ,培育了大量新的 11位系， 80年代初，用牛朱特做亲本培育的新 1B/1其 矮秆、多抗、高产 等特点，作为亲本又培 育出了一大批新品种，据 19831997年统计，利用 矮孟牛 在全国培育 了 14个小麦新品种，其中国家级推广品种 6个、年推广面积 500万亩以上的品种 7个、 1000万亩以上的品种 5个 ，另外 还选育出 78个优良新品系 。新 11位系的培育成功，进一步推动了其在我国的传播，据刘丽等 2003年对中国秋播麦区 251份供试品种和高代品系所做的检测， 112份为 1 其中在小麦主产区黄淮冬麦区和北方冬麦区比例更高，分别为 陈玉清等 1999年对四川省过去 40个小麦主 栽品种进行的分析发现，有 9个品种为 1而在四川省 2001年参加区试的 20个小麦新品系中， 11个为 11例高达 55%（马啸等， 2001），说明 1B/1 随着 1年来，位于 1条锈病抗性基因相继丧失抗性，为解决这一问题，我国的小麦育种家利用 1培育出一些具有新抗病基因的 1B/1如 1987 1990年 , 任正隆等（ 2003） 从欧洲小麦品种 155的杂交后代中选育了一个新的 1 11882， 研究证明它含有抗条锈病新基因 且抗白粉病，用该易位系与其它小麦材料杂交，又选出了新的 1159及其姊妹系 2002年经四川省审定 , 分别命名为川农 12和川农 17；沈天民等以六倍体小黑麦 位系兰考 906，经鉴定也含有新的抗白粉病基因（王祖华， 2004）；山东农业大学李 兴锋等（ 2004）在八倍体小黑麦劲松 49与八倍体小滨麦的杂交后代中也得到了一个对白粉病免疫的 1于其不含滨麦草的遗传物质，所以推测其白粉病抗性基因可能是来源于黑麦的 1 B/1R 易位系在小麦生产中存在的问题 虽然 1B/1R 易位系能够提高小麦的产量并增强其环境适应性，但也经常表现出与面包烘烤品质有关的严重缺陷，主要体现在面筋强度低、不耐和面、面团发粘和制成的面包体积较小（ 990； 1993； 2001;， 1995； ， 1995; ， 1995）。在我国由于非面包主食的缘故，很久以来，没有重视小麦烘烤品质的改良。建国后人口压力的增中国农业科学院博士学位论文 第二章 录及其原核表达 3 大，使我们更加注重小麦产量的提高，以至后来使中国这个世界第一小麦生产大国， 出现卖粮难和增产不增收的怪现象，但与此很不相称的是我国又是最大的小麦进口国之一，每年需进口优质专用小麦约 1000 万吨左右，占我国小麦总产量的 10%左右。这主要是因为我国大部分小麦品种的品质较差，不能满足优质面包、面条和饺子加工的需求。为了促进我国优质小麦品种的选育和推广，扭转我 国优质小麦和专用粉完全依赖进口的局面，农业部分别于 1992 年和 1995 年举办了两次“中国面包小麦品种品质鉴评会”，第一届评选出了 18 个优质面包小麦品种，第二届入选的面包小麦品种比上一届要多出一倍以上，但在入选的几十个小麦品种中，发现 1B/1R 易位系寥寥无几，这与 1B/1R 易位系在我国小麦品种中所占的比例是极不相称的，马啸等（ 2002）曾对影响烘考品质的一个重要参数 淀值在一个小麦 1B/1R 易位和它的非 1B/1R 易位的近等基因系间做过比较， 1B/1R 易位系的 淀值极显著降低，刘建军等（ 2004）对 国内 138 份小麦品种所做的分析表明， 1B/1R 易位系的面条加工品质也显著变劣，最近几年，随着人们对面包小麦育种的重视，新的面包小麦品种不断出现，但绝大多数的面包小麦品种产量低稳定性差，而产量高稳产性好的 1B/1R 易位系品种面包加工品质又往往比较差，如何解决小麦 1B/1R 易位系高产与优质之间的矛盾成了摆在小麦科研人员面前的一项重要课题。 B/1R 易位系加工品质差的可能原因 1B/1R 易位系小麦之所以加工品质差可能是种子贮藏蛋白变化的结果，小麦染色体短臂 1 别编码小麦低分子量麦谷蛋白（ 醇溶蛋白 ,1 1代以后， 1携带的这两种贮藏蛋白基因就会丢失，但由于 谷蛋白对面筋强度的贡献较大（ 1987； 1988），该基因的丢失可能会导致面团的面筋强度减弱，纯合 1位系的面团强度比杂合 1位系的面团强度下降更明显（ 1993）就说明了这一点 , 因为在纯合条件下 因全部丢失，而在杂合条件下还有一半的基因存在；在 1也含有两类编码贮藏蛋白的基 因，分别编码 0黑麦碱（ 981） ，两类基因紧密连锁，被称为 点（ ，1984），由于这两类贮藏蛋白均为单体蛋白，因此无法补偿 失对面筋强度降低的影响，同时，又由于 990; 1991; 994） , 取代1码的不溶于水的醇溶蛋白以后造成面团发粘 （ 1990），丢失的醇溶蛋白虽然不会增加面筋的强度，但对其他品质参数 有一定作用，尤其是吸水性和面包体积（ 1996），根据这些研究，很可能低分子量麦谷蛋白的丢失和水溶性蛋白的增加共同发挥作用，降低了小麦的加工品质。但也有研究表明，失去 1品质的不良影响并不大（ 1990 ）， 1水溶性蛋白的含量却明显增加，导致两类蛋白之间的比例失衡，使面团的粘性增加，向面团添加高分子量麦谷蛋白成分，可以降低面团的粘性（ 1990）； （ 2003）利用遗传背景相同的材料所做的研究表 明， 1品质的影响很小，而 1位系对品质的不良影响比缺失 1造成的影响要大的多的多，说明黑麦碱的产生是导致这些 1位系小麦品质下降的主要原因。不管是哪一种情况， 位系小麦 加工品质下降的重要因素之一。 分子量在 50中国农业科学院博士学位论文 第二章 录及其原核表达 4 间，与小麦的 990） ,关于 （ 1992） 根据 交带的强度，估测在 40间， （ 1996）估测的拷贝数约为 15 个，相临两个 间隔区，不同 间隔区之间以头尾方式相连， 2005 年， 用拉长的 维进行原位杂交，也得出 5 个拷贝。不同拷贝的 （ 1991）曾报道过两个 们编码的蛋白质都包括 19 个氨基酸的信号肽，成熟蛋白均由 338 个氨基酸组成，分子量分别为 们之间有 9 个氨基酸的不同， 在 公布了另外一个 信号肽和成熟蛋白的长度与 （ 1991）报道的相同，只是成熟蛋白的序列有所不同。以上三个 否在种子中表达并不清楚。 994)在 子量分别为 40、 44 和 45明表达的 （ 1989）在酸性 胶上指出了两个 种子 中表达的 关表达的 决 1B/1R 易位系小麦品质差的可能途径 为克服 1品质带来的不利影响，人们曾尝试过多种办法来解决这一问题。 (1986)通过诱导 1相应小麦染色体短臂之间的重组来去除 1的黑麦碱位点， 1993)利用 射线照射过的 1位系的花粉与 1端体授粉的办法来筛选已去除黑麦碱位点的后代，这两种方法虽然都能去除黑麦碱位点，但同时也除去了位于黑麦 碱位点外端的抗性基因（ ， 1990），最近， 000)通过多次诱导染色体重组去除了编码黑麦碱的部分染色体，而染色体外端的抗病基因仍然被完整保留下来，利用这些新的 1关的品质问题，但产量和适应性等会不会受影响目前还未见报道。最近，晏