银杏叶多糖的提取与含量测定(论文)

银杏叶多糖的提取与含量测定银杏叶多糖的提取与含量测定 摘要摘要 以干燥的银杏叶为原料 采用水提醇沉法提取其中的活性物质 银杏叶多糖 并测定其含量 通过单因素实验研究了乙醇沉淀浓度 乙醇用量和沉淀次数对银杏叶提取纯化率的影响 从而确定了提取 银杏叶多糖的优化条件为 料液比 1 30 浸提温度 80 浸提时 间 3h 浸提次数 2 次 在浸提液真空浓缩至原来体积 30 用 1 5 倍体积无水乙醇沉淀 2 次 干燥 洗涤 银杏叶多糖得率为 4 925 关键词关键词 银杏叶多糖 单因素试验 提取纯化 含量测定 Abstract Choosing dried ginkgo leaves as raw material We used the method of water extraction and alcohol precipitation to extract the active substance The polysaccharides of ginkgo leaf and determined the content of it Using single factor experimental method we studied the impacts of alcohol precipitation concentration alcohol dosage and precipitation times on the purity of extraction and concluded that the optimal condition to extract polysaccharides is material liquid ratio 1 30 extraction temperature 80 extraction time 3 hours extraction times twice When extraction solution vacuum concentrated to 30 of the original volume use 1 5 times the volume of the absolute alcohol to precipitate twice and then wash dry the yield of polysaccharides reached 4 925 Keywords polysaccharide single factor experiment extraction 1 引言引言 近几十年来 人们发现糖类在生物体中不仅是作为能量资源或结构材料 更重要的是它参与了生命科学中细胞的各种活动 具有多种多样的生物学功能 到目前为止 已有近300种的多糖类化合物从天然产物中被分离提取出来 其中 从植物中尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要 这些活性多糖的生理活 性 化学结构以及工艺提取条件成为多糖研究的前沿阵地 取得了很大的进步 1 3 银杏树为我国特产 有活化石之称 有着丰富的药用价值 其叶 果和 外种皮等皆具有药用开发价值 4 目前对银杏多糖的研究主要集中于银杏 叶和银杏外种皮中提取的银杏多糖的药用价值 5 已经有很多实验证实银杏 叶多糖有生理活性促进作用 安徽省淮南师范学院陈群 刘天骄的研究结果表 明 银杏叶多糖 GBLP 对小鼠S180实体瘤 腹水瘤的生长有抑制作用和对荷 瘤小鼠免疫调节作用 表明GBLP具有较强的免疫调节活性和抗肿瘤作用 6 费瑞 徐冬梅 温得中等研究得出银杏叶多糖对人脐静脉内皮细胞与HL 60细胞 粘附有影响作用 7 侯华新 黎丹戎等研究发现银杏叶多糖可增加化疗药 物对鼻咽癌细胞 宫颈癌细胞的治疗敏感性 是一种有希望的放射增敏剂 8 陈有福 李永强 韩 毳 等研究证明中药银杏叶提取物在精神科有广泛应用 9 同样有许多研究者在银杏叶多糖提取 分离 纯化以及含量测定上有显著 成绩 10 18 银杏叶多糖提取方法的优化为进一步在理论上证实银杏叶多糖 的多种活性功能提供支持 同时也为中药现代化的研究开辟道路 对于进行银 杏叶多糖的产业用途也有一定的借鉴意义 本文采用水提醇沉提取银杏叶多糖 并用单因素试验法对提取工艺进行了优化 为银杏叶多糖的进一步深入开发利 用打下基础 2 2 实验器材的准备实验器材的准备 a a 实验所需试剂 无水乙醇 95 乙醇 90 乙醇 85 乙醇 80 乙醇 苯酚 硫酸 80 葡萄糖标准溶液 双蒸水 b b 实验用具 烧杯 蒸发皿 试管 玻璃棒 量筒 移液管 容量瓶 c c 实验设备 紫外分光光度计 恒温干燥箱 粉碎机 水浴锅 离心机 冰箱 水浴锅 3 3 实验过程实验过程 3 13 1 实验的基本步骤实验的基本步骤 提取 纯化方法银杏叶多糖提取 纯化步骤 a a 银杏叶处理 实验前用 70 恒温干燥箱将银杏叶再烘 1 次 b b 恒温提取 按 1 30 固液比加水 在恒温水浴中恒温提取 c c 离心 提取后用离心机以 5 000 r min 离心 20 min 收集上清液 残渣同前 再提取 1 次 合并两次上清液 d d 浓缩 用真空干燥箱对纯化后的离心液进行浓缩 e e 醇沉淀 加入一定量的一定浓度的乙醇 放入冰箱静置一定时间 f f 离心 对醇沉的白色絮状多糖沉淀进行离心 g g 洗涤 得到的多糖用无水乙醇清洗后放入小烧杯中 在水浴锅中蒸干后 放 入 80 烘箱中干燥 3 23 2 标准曲线的建立标准曲线的建立 多糖含量测定采用苯酚 硫酸法 以葡萄糖为标准样品 精确称取 0 1g 葡萄糖 用蒸馏水定容至 100ml 容量瓶中 摇匀备用 吸取 上述 1mg ml 的葡萄糖溶液 0 00 1 00 2 00 3 00 4 00 5 00 6 00 分别用蒸 馏水稀释至 50ml 容量瓶中 得到不同浓度的葡萄糖标准溶液 从各个瓶中准确 移取 2 00ml 置于 25ml 具塞比色管中 加入 5 苯酚溶液 1 00ml 摇匀 迅速 加入浓硫酸 5 00ml 静置 5min 后 置于沸水浴加热 15min 冷却至室温 用分 光光度计在 490nm 处测定吸光度 制作标准曲线 3 33 3 单因素实验单因素实验 3 3 13 3 1 醇浓度的影响醇浓度的影响 称取已粉碎的银杏新叶5g5份 分别加入锥形瓶中 各加入150ml蒸馏水 并分别编号1 5号 于80 水浴中浸提3h 取出离心 取上清液 残渣同前再浸 提一次 取出离心 合并两次上清液 上清液在60 下浓缩成30 的体积 分 别加3倍体积的无水乙醇 95 乙醇 90 乙醇 85 乙醇 80 乙醇 置冰箱 中沉淀24h 再次离心 取沉淀 用85 95 和无水乙醇反复洗涤 干燥 按 标准曲线绘制项下方法测定其吸光度并计算多糖含量 3 3 23 3 2 醇沉淀次数的影响醇沉淀次数的影响 称取已粉碎的银杏新叶5g3份 分别加入锥形瓶中 各加入150ml蒸馏水 并分别编号1 3号 于80 水浴中浸提3h 取出离心 取上清液 残渣同前再浸 提一次 取出离心 合并两次上清液 上清液在60 下浓缩成30 的体积 1号 中加入3倍体积无水乙醇 2号中加入1 5倍体积无水乙醇 沉淀12h后 离心 取沉淀 上清液再加入1 5倍体积无水乙醇 沉淀12h 3号中加入1倍体积无水 乙醇 沉淀8h后 离心 取沉淀 上清液再加入1倍体积无水乙醇 沉淀8h后 离心 取沉淀 上清液再加入1倍体积无水乙醇 沉淀8h 再次离心 取沉淀并 合并 用85 95 和无水乙醇反复洗涤 干燥 按标准曲线绘制项下方法测 定其吸光度并计算多糖含量 3 3 33 3 3 新叶与落叶的比较新叶与落叶的比较 称取已粉碎的银杏新叶5g2份 银杏落叶5g2份 分别加入锥形瓶中 各加 入150ml蒸馏水 并分别编号1 4号 于80 水浴中浸提3h 取出离心 取上清 液 残渣同前再浸提一次 取出离心 合并两次上清液 上清液在60 下浓缩 成30 的体积 加1 5倍体积的无水乙醇 醇沉12h 离心 取沉淀 上清液再加 入1 5倍体积无水乙醇 沉淀12h 再次离心 合并两次沉淀 用85 95 和无 水乙醇反复洗涤 干燥 按标准曲线绘制项下方法测定其吸光度并计算多糖含 量 4 4 结果与讨论结果与讨论 4 14 1 葡萄糖标准曲线图葡萄糖标准曲线图 表 1 葡萄糖标准曲线表 0 05 0 0 05 0 1 0 15 0 2 0 25 0 3 葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线 0 0 001 0 002 0 003 0 004 0 005 0 006 0 0 013 0 089 0 122 0 194 0 206 0 213 y 0 0404x 0 0419 R 2 0 9435 c mg ml c mg ml A620nmA620nm 图 1 葡萄糖标准曲线图 由葡萄糖标准曲线可以看出 在 490nm 处的吸光度值随着葡萄糖浓度的增 加而线性增加 线性方程为 y 0 040 x 0 0419 由此 我们可以根据葡萄糖标 准曲线图而推断出银杏叶多糖的含量 4 24 2 影响银杏叶多糖提取的单因素实验影响银杏叶多糖提取的单因素实验 4 2 14 2 1 不同乙醇沉淀浓度对银杏多糖的率的影响不同乙醇沉淀浓度对银杏多糖的率的影响 组数 A 12345 银杏新叶 g 55555 C mg ml 00 0010 0020 0030 0040 0050 006 A620nm00 0130 0890 1220 1940 2060 213 乙醇浓度无水乙醇95 乙醇90 乙醇85 乙醇80 乙醇 乙醇沉淀次数1 1 次 1 1 次 1 1 次 1 1 次 1 1 次 银杏多糖得率 4 9214 0564 0193 9423 600 图 2 醇沉淀浓度对银杏多糖的影响 不同乙醇沉淀浓度对银杏多糖的率的影响见图 2 由图 2 可看出 银杏多 糖的得率随着乙醇浓度的降低而减少 当乙醇沉淀浓度从无水乙醇到 95 乙醇 时 多糖得率从 4 921 减少到 4 056 多糖得率减少了 0 865 这可能是因 为乙醇浓度的突然降低 小部分多糖溶于水未达到饱和状态而没有析出 因此 导致多糖得率显著降低 当乙醇沉淀浓度从 95 乙醇到 80 乙醇时 多糖得率从 4 056 到 3 600 多糖得率减少了 0 456 这可能是因为此时多糖的析出因乙 醇浓度的逐步降低达到了一个稳定而平衡的状态 因此多糖得率下降不显著 最终可以得出 最佳的乙醇沉淀浓度为无水乙醇 4 2 24 2 2 不同乙醇沉淀次数对多糖得率的影响不同乙醇沉淀次数对多糖得率的影响 组数 B 123 银杏新叶 g 555 乙醇浓度无水乙醇无水乙醇无水乙醇 乙醇用量 ml 3 倍体积1 5 倍体积1 倍体积 乙醇沉淀次数1 1 次 2 2 次 3 3 次 银杏多糖得率 4 4364 9294 800 图 3 乙醇沉淀次数对多糖得率的影响 由图 3 可知 不同乙醇沉淀次数对多糖得率有显著的影响 用 3 倍体积的 无水乙醇 1 次沉淀和 2 次沉淀相比 沉淀 2 次的银杏多糖得率比沉淀 1 次要高 出 0 493 这是因为沉淀 1 次时 溶液中银杏多糖的物质量浓度为 1 4V 而沉 淀 2 次时 溶液中银杏多糖的物质量浓度为 1 2V 2V 假设溶液中银杏多糖的 物质的量为 1 由此可知 沉淀 1 次析出的银杏多糖比沉淀 2 次少 由此推断 沉淀 3 次析出的银杏多糖应该比沉淀 2 次高 但是 沉淀 3 次时的银杏多糖得 率却比沉淀 2 次减少了 0 129 这可能是因为沉淀次数太多而导致了银杏多糖 在离心 取出等过程中损失增大 从而使得银杏多糖得率减少 综上分析 可 得出最佳沉淀次数为 2 次 4 2 34 2 3 银杏落叶与新叶多糖含量比较银杏落叶与新叶多糖含量比较 组数 C 重量 g 乙醇浓度沉淀次数得率 银杏新叶 15无水乙醇2 2 次 4 961 银杏新叶 25无水乙醇2 2 次 4 889 银杏落叶 15无水乙醇2 2 次 4 450 银杏落叶 25无水乙醇2 2 次 4 402 图 4 银杏落叶与新叶中多糖含量的比较 由图 4 可知 银杏新叶 1 2 组的银杏多糖得率分别为 4 961 4 889 取其平均值可求得银杏新叶中多糖含量为 4 925 银杏落叶 1 2 组的银杏多 糖得率为 4 450 4 402 取其平均值可求得银杏落叶中多糖含量为 4 426 因此 银杏新叶中的银杏多糖含量比银杏落叶中的银杏多糖含量高 这是因为 一方面银杏叶在凋落后 细胞没有完全死亡 消耗了叶中的多糖 另一方面 银杏叶在凋落之前 多糖可能发生了部分转移 导致银杏落叶中银杏多糖含量 减少 5 5 结论结论 银杏是冰川时期存活在地球上的孑遗植物 素有 活化石 之称 中国是银 杏的发源地 其资源占世界总量的 70 左右 很多研究表明 银杏叶中的活性 物质 多糖 具有抗肿瘤 抗病毒 增强免疫力 延缓衰老 降血脂 降血糖 解毒 抗辐射等功效 而且目前 银杏叶制剂已从单纯的药用逐步应用到食品 饮料 保健品等行业 含银杏叶提取物的护发 生发 护肤等化妆品的开发也 取得一定的进展 本实验采用单因素试验对影响银杏叶多糖提取条件进行了探讨 筛选出了 最佳提取条件为醇沉淀浓度为无水乙醇 沉淀次数为两次 与前人提取 银杏叶 多糖的工艺相比 水煮醇提法提取率更高 实验简单且所需时间短 具有很高 的生产利用价值 为衡阳地区对银杏叶多糖的开发与利用提供了良好的依据 与此同时 实验测得银杏落叶的多糖含量为 4 426 新叶多糖含量为 4 925 由此可知 衡阳地区的银杏落叶多糖含量比新叶低 但相差不大 因 此 利用提取落叶中的银杏多糖来大量生产银杏多糖药物 保健品等产品 既 实现了 绿色生产 和 低成本 高收益 的宗旨 达到 绿色产品 和 废 物利用与资源回收 的标准 又保护了世界孑遗物种 银杏不受破坏 6 6 参考文献参考文献 1 黄桂宽 曹麒燕 银杏叶多糖的化学研究 J 中草药 1997 08 2 李开泉 陈 武 熊筱娟 等 银杏叶的化学研究 J 江西中医学院学 报 2002 14 1 61 3 池静端 徐礼焱木 马 辰 等 银杏叶的化学成分研究 J 中国中药 杂志 1997 22 2 106 4 梁淑轩 孙汉文 银杏叶资源开发利用研究进展 J 河北大学学报 自 然科学版 2003 23 2 204 5 姚碧文 陈伟 银杏叶药理研究进展 J 浙江中西医结合杂志 2005 15 3 192 6 陈群 陈永红 银杏叶多糖的分离 分析及其对小鼠腹腔吞噬细胞的影响 J 淮南师范学院学报 2002 02 7 费瑞 徐冬梅 温得中 等 银杏叶多糖对人脐静脉内皮细胞与 HL 60 细 胞粘附的影响 J 东北师大学报 自然科学版 2005 04 8 侯华新 黎丹戎 黄桂宽 等 银杏叶多糖在肿瘤放射 化学治疗中的增敏 作用研究 J 广西医科大学学报 2005 01 9 陈有福 李永强 韩