【毕业学位论文】（Word原稿）慢病毒转染RF B细胞治疗类风湿性关节炎

分 类 号 学号 2005615400092 学校代码 10487 密级 硕士学位论文 慢病毒转染 细胞治疗类风湿性关节炎 大鼠疼痛的疗效评价 学位申请人： 蒋焕伟 学 科 专 业 ： 麻醉学 指 导 教 师 ： 罗爱林 教授 答 辩 日 期 ： 2009 年 4 月 A of of of of in F B by : 30030, P. R. 2009独创性声明 本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在 _年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 目 录 中文摘要 错误 !未定义书签。 2 正 文 前 言 2 1 材料与方法 5 2 结果 10 3 讨 论 错误 !未定义书签。 参考文献 17 综 述 21 附录 发表文章 39 致 谢 40 华中科技大学硕士学位论 文 1 慢病毒转染 的 细胞治疗类风湿关节炎大鼠疼痛的疗效评价 华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室 硕士研究生 ： 蒋焕伟 指 导 老 师 ： 罗爱林 教授 中文摘要 目的 慢病毒转染的 细胞静脉注入类风湿性关节炎大鼠，评价 其 治疗效果 。 方法 雌性 6只 ，随机分为 2组 :对照组 和治疗组 ， 每组 8只 。 治疗组大鼠静脉注射 携带 细胞，对照组静脉注射未 转染 的 细胞。 于 注射前两周 开始每 两 周一次观察 测定踝关节辐射热痛阈、 机械刺激 50%缩爪阈值 、 血清类风湿因子 （ 、肿瘤坏死因子 (的 水平。于 第 56天 处死大鼠，光镜下观察踝关节组织病理学结构 ，取脾脏分选出单个核细胞后检测 结果 与对照组比较，治 疗组大鼠踝关节辐射热痛阈降低（ P、血清 平 下降 （ P。 与对照组比较，治疗组 大鼠踝关节组织切片显示关节滑膜增生、骨和软骨破坏、大量炎症细胞渗出等典型关节炎改变 明显减轻 。 治疗组 脾脏检测到 对照组 未发现 ，两组均未检测到 结论 慢病毒转染的 细胞静脉注入类风湿性关节炎大鼠后能降低疼痛阈值，减轻关节病理改变，减少类风湿因子的产生，诱导脾脏 关键词 关节炎 ； 类风湿；模型 ； 细胞 ； 慢病毒 华中科技大学硕士学位论 文 2 of of in F B by To F B by to to n=8 I I In F B by in F B by of 50% of of (, On to of to h1 h2 In of of in of of in h1 of in in h2 in F B by of 华中科技大学硕士学位论 文 3 of of h1 in 华中科技大学硕士学位论 文 4 前 言 类风湿性关节炎（ 发病率高达世界人口的 1，其关节慢性疼痛及功能障碍严重地影响了众多患者的生活质量 1。目前认为， 由于关节滑膜炎性反应损伤关节软骨和关节囊，进而导致疼痛和功能障碍的一 类自身免疫性疾病，自身免疫性T 辅助细胞和 B 细胞均在其发病过程中发挥重要作用，然而确切的机制尚不清楚 2正因如此，类风湿性关节炎的传统治疗方法以及近来发展的使用抑制或杀伤 T 淋巴细胞或 B 淋巴细胞的治疗方法 2虽可取得不同程度的疗效，却均存在选择性低、特异性不强、副作用大等问题，限制了它们在临床上的应用。 显然，探索新的更安全有效、副作用低的治疗方法，满足 疗的迫切需要，必须对 病机制进行更深入的研究 。 本研究旨在通过构建强力霉素诱导 达的慢病毒，转染 细胞，诱导巴细胞 的凋亡，通过 巴细胞的减少，抑制 胞和 B 细胞的相互作用，从而对类风湿性关节炎慢性疼痛进行有效靶向治疗。 华中科技大学硕士学位论 文 5 1 材料与方法 物选择 及分组 6只， 6 8 周，体重 170 190 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。 随机 分成两组 ，治疗组和对照组 （ n 8） 。在 制作模型前一天（ 实验前（ 0W）、注射慢病毒 转染的 细胞 后 2W，分别检测血清行机械性痛觉超敏测定和 辐射热痛 测定。 剂 及仪器 大鼠免疫球蛋白 口分装试剂盒）以及 位检测 试剂盒均购自武汉 博士德生物有限公司， 口分装试剂盒） 和 进口分装试剂盒）购自晶美公司， 足底触觉测量仪 (37400型 )为意大利 辐射热测痛仪 (为 中国科学院生物医学工程公司 产品 ， 流式细胞仪 为 美国 品 。 疗关节疼痛 慢病毒 转染的 细胞 注射方法为 ： 实验组 大鼠 尾静脉 注射 染的细胞（细胞数约 1 107） ，每 2周注射一次，连续 3次，在注射慢病毒 转染的 细胞 后 第 6天 开始 喂食 浓度为 1mg/导 对照组注射未经病毒转染的 细胞，其余步骤相同。 鼠免疫球蛋白 (1). 洗涤液：浓缩洗涤液于 37孵育 20分钟。浓缩洗涤液与蒸馏水 1： 20倍稀释使用。 (2). 底物工作液配置：显色前 5分钟将 片加底物稀释液 5 (3). 标 准品配置：使用前每瓶标准品中加入蒸馏水 200 (4). 实验前 30分钟取出试剂盒，以平衡至室温。 (5). 取出所需板条，剩余密封放回 4冷藏。 华中科技大学硕士学位论 文 6 (6). 建立标准曲线：设标准孔 8孔，每孔各加入样品稀释液 100 l，第一孔加入标准品 100 l，混匀后用加样器吸出 100 l，移加入第二孔，如此反复对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出 100 之体积均为 100 l、第八孔为空白对照。 (7). 加样 ： 待测样品孔中每孔加入待测样品 10 l，加入样品稀释液至 100 l。 (8). 将反应板充分混匀后置 37 60分钟。 (9). 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 5次，向滤纸上印干。 (10). 每孔加入酶标抗体工作液 100 l。 (11). 将反应板充分混匀后置 37 60分钟。 (12). 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 5次，向滤纸上印干。 (13). 每孔加入底物工作液 100 l，置 37暗处反应 10分钟。 (14). 每孔加入 50 (15). 使用 酶标仪， 检测样本 490 械性痛觉超敏测定 将实验大鼠置于 态足底触觉测量仪的树脂玻璃笼（ 10 1015，网笼置于铁丝网板上以便实验操作和观察。实验前适应环境 15试者手持 下向上垂直刺激后足底皮肤表面（避开不敏感的肉垫），呈对数增强的力度（ 8.0 5.0 g），持续 10s，每次测定间隔 10性反应定义为大鼠对刺激快速缩爪，试验从 一个阳性反应发生时，下一 个刺激低于本次力度；若一个阴性反应发生时，下一个刺激高于本次力度，第一次反应发生后再连续观察 5次，记录实验结果，并转换为 50%的缩爪阈值 7 机械缩爪阈值测定：于 细胞 注射后 2周、 4周和 6周使用足底触觉测量仪采用 9 测定机械缩爪阈值，以 50缩爪阈值（ 50 50% 示：大鼠置于观测笼内，待其安静后，用足底触觉测量仪从观测笼下方垂直于术侧后爪外侧皮肤给予一系列机械刺激（ 每个刺激持续 6 8s，每两个刺激间隔至少2察大鼠的反应。出现缩足反应为阳性，反之为阴性，每两次刺激间隔 2分钟。 华中科技大学硕士学位论 文 7 从 2 呈阳性反应则选择下移一个刺激级别 (g)，若呈阴性反应则选择上移一个刺激级别 (g)，依次类推。当出现相邻两次反应不一致 （ 阳性反应变为阴性反应或阴性反应变为阳性反应）时，继续依序刺激 4次，连同这两次一共 6次刺激结果用于计算机械刺激的 50%缩爪阈值如下： 50 0)+次刺激中阳性反应与阴性反应次数的比值。是各相邻级别刺激力度对数值之差的平均数，此处 需选择的刺激力度超过 15.1 g，则50缩爪阈值直接记为 15.1 g。 射热痛 测定 使用 大鼠置于玻璃板上，使用热辐射仪照射其后趾相应的部位，记录从照射到缩爪反应的时间，即缩爪潜伏期。在实验前均先测定足底基础痛阈值，测量同一部位时，每次间隔 5 使其痛觉恢复正常，每只大鼠左右 足底各测试 3次，缩爪时间 平均值 即为其痛阈值 。 察关节病理组织学 于注射后第 56天将大鼠断颈处死，切下病变踝关节，浸泡于 10中性甲醛液固定，硝酸脱钙液脱钙，浸蜡、包埋、 4伊红苏木素（ 色，显微镜下观察。 操作步骤 如下 ： (1). 从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其它板条请密封放回 4。 (2). 除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品 (100 l/孔 )加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔， 37孵箱孵育 90分钟。 (3). 洗 板 4次。 (4). 除空白孔外，加入生物素化抗体工作液 (100 l/孔 )。用封板胶纸封住反应孔，37孵箱孵育 60分钟。 (5). 洗板 3次。 (6). 除空白孔外，加入酶结合物工作液 (100 l/孔 )。 封板胶纸封住反应孔， 37 华中科技大学硕士学位论 文 8 孵箱孵育 30分钟。 (7). 洗板 3次。 (8). 加入显色剂 100 l/孔，避光 37孵箱孵育 10 (9). 加入终止液 100 l/孔 ,混匀后即刻测量 5分钟内 )。 根据检测标准品样本 算出相应的浓度，绘制出标准曲线，然 后根据标准曲线，计算出样本 胞凋亡检测 淋巴细胞分离液分选出脾脏单个核 细胞，取各组细胞分别和 多 克隆抗体 04 孵育 1h， 入 羊 抗 驴 二抗 4 孵育 次，用 00l，经 式细胞仪检测细胞凋亡。 亡过程中细胞核 原理是；生物素（ 记的 作用下 ,可以连接到凋亡细胞中断裂的 可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（ 异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（ 存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 而没有 3少能够被染 色。 操作步骤 如下： (1). 培养细胞的预处理： 在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸，干燥后在去离子水中漂洗，干燥后 4保存； 淋巴细胞分离液分选出脾脏单个核 细胞， 各组离心收集约 1106个细胞， 悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上； 华中科技大学硕士学位论 文 9 将吸附细胞的载玻片在 4%多聚甲醛中固定 25 次 5 将吸附细胞的载玻片在 次 5 (2). 上述处理好的细胞涂片，用滤纸小心吸去载玻片上的多余液体，滴加 100 温平衡 5 10 (3) 时配置 冰上保存待用； (4). 用滤纸小心吸去样本区域周围的多余液体，滴加 100 (5). 在反应区域盖上盖玻片以确保反应液分布均匀，于 37 、潮湿环境中反应60 (6). 去除盖 玻片，在反应样本区域加入 100 l 2温放置15 (7). 次 5 (8). 5 (9). 次 5 (10). 滴加 100 温反应 3 5 (11). 次 5 (12). 于载玻片的样本区域滴加 100 l 到呈现 深 棕色背景； (13). 用去离子水漂洗 2 3次； (14). 用滤纸小心吸去载玻片上的多余液体，滴加几滴甘油于样本区域，然后盖上盖玻片进行封片，即可在光学显微镜下进行观察并拍照。 计学处理 采用 量资料以均数标准差（ s）表示，组内 采用重复测量数据方差分析 ，组间比较采用单因素方差分析， 率的显著性检验采 华中科技大学硕士学位论 文 10 用 2检验 ， P 2 结果 清 对照组血清 g/g/疗组为（ g/g/疗后 差异有统计学意义 (P 治疗后 异无统计学意义 (P见图 1。 02468 2 4 6)ug/ 大鼠血清 清 对照组血清 g/g/疗组为 (g/g/疗后 差异有统计学意 华中科技大学硕士学位论 文 11 义 (P 治疗后 异无统计学意义 (P 见图 2。 051015202530 2 4 6)ug/ 大鼠血清 清 对 照组血清 483 86)pg/492 87)pg/疗组为(258 67)pg/277 66)pg/疗后 差异有统计学意义 (P治疗后 异无统计学意义 (P 见图 3。 华中科技大学硕士学位论 文 12 0100200300400500600700 2 4 6)pg/ 大鼠血清 0缩爪阈值 在 40缩爪阈值分别是（ g，治疗组分别是（ g，治疗后 50缩爪阈值显著升高， 差异有统计学意义 (P 治疗后辐射 热痛域 值比较制作模型前有所升高，差异有统计学意义 (P 见图 4。 华中科技大学硕士学位论 文 13 051015202530 2 4 6)50%g) 大鼠 50缩爪阈值 射热痛域值测定 在 4痛域 值分别是 (s，治疗组分别是(s，治疗后辐射 热痛域 值有升高，差异有 统计学意义 (P；治疗后辐射 热痛域 值比较制作模型前有所升高，差异有统计学意义 (P 见图 5。 华中科技大学硕士学位论 文 14 051015202530 2 4 6) 大鼠辐射热痛域值 鼠踝关节组织切片 于 第 56天 处死大鼠，光镜下观察踝关节组织病理学结构 。 光镜下见 对照组 大鼠 踝关节组织滑膜组织增生，呈乳头状突向关节腔；滑膜细胞增生、排列紊乱，大量炎症细胞浸润，有血管翳形成。严重者骨破坏向边缘侵蚀并伴有软骨破坏。关节腔内炎性细胞渗出（见图 6）。 治疗组 大鼠上述 病变减轻 。 华中科技大学硕士学位论 文 15 对照组 治疗组 图 6大鼠踝关节组织切片（ 200） 式细 胞仪检测脾脏 于 第 56天 处死大鼠， 分选出脾脏单个核细胞后，检测 对照组 、 治疗 组和的凋亡率分别是 (和 (%（图 7）， 与对照组相比，治疗组凋亡率增加， 两组比较差异有统计学意义（ P ， 结果说明 细胞治疗 能够促进 对照组 治疗组 图 7 流式细胞仪检测各组 于 第 56天 处死大鼠， 分选出脾脏单个核细胞后，检测淋巴细胞凋亡， 对照 组和治疗 组的凋亡指数分别为 (%和 (%（图 8），两组比较差异有统计学意义（ P 结果进一步说明 细胞治疗 能够促进 华中科技大学硕士学位论 文 16 对照组 治疗组 图 8 200） 3 讨论 在过去的几十年里，人们一直认为在类风湿性关节炎发病机制中起着十分重要作用的巨噬细胞和 13近来随着 来越多的证据表明 15。 16。 细胞本身 17。 18。 最新研究表明，自身免疫性 19和 细胞在类风湿性关节炎发病机制中发挥关键的作用。 类风湿关节炎发病机制和 20。在器官特异性自身免疫性疾病中，异常增多的 重病情 21 细胞有密切关系 ：其一，类风湿因子特异性 以激活大量自身免疫性 24，导致异常细胞免疫损伤关节；其二， 细胞功能，而正常人体不存在活 化类风湿因子特异性 细胞 25所以类风湿性关节炎患者体内大量异常 细胞。综上所述，自身免疫性 细胞具有相互活化的紧密关系，均在类风湿性关节炎发病机制 华中科技大学硕士学位论 文 17 中起着重要作用，可望作为治疗类风湿性关节炎的良好靶点。 如何使异常增多的 持 29，从而对相关疾病进行治疗 ,是解决问题的关键。 本实验制作大鼠类风湿性关节炎慢性疼痛模型，分选 细胞，构建强力霉素诱导 染 细胞后 ，静脉注入类风湿性关节炎大鼠。结果发现：静脉注射转染的 细胞后，最大关节炎评分降低，大鼠踝关节辐射热痛阈升高，血清 节炎症改变明显减轻，脾脏 些实验证实强力霉素诱导 F 制 细胞活化，减少类风湿因子产生。本研究使用 细胞作为靶向细胞，克服了目前不能分辩自身免疫性 用自身免疫性 F 妙地定向诱导自身免疫性 到治疗类风 湿性关节炎的作用。这一研究表明自身免疫性 F 治疗自身免疫性疾病提供了一新的靶点。 参考文献 1 S. of 2003, 423: 356 2 , , , et of of 2001, 31: 1603 S. in J 2004, 114: 4714 R, W, W, et of in J 1994, 53: 555 J, . B in 2000, 2: 1266 , J, C, et 2003, 48: 2146 华中科技大学硕士学位论 文 18 7 C. 2003, 3: 3238 C, Q, H. of 2006, 38: 2199 , G. a of of in 1977, 4(2): 16110 C, E, , et of by on 2007, 318(5853): 114111 S, , ,et A is by 2006, 351(2): 571 12 , , , et of on 2008, 67(1): 6313 S, J. in 1990, 33(6): 768 73. 14 S, . 2003, 2(6): 473 88. 15 C, , , et in N 2004, 350(25): 2572 81. 16 , R. in 2003, 15(3): 24617 V, A. as 华中科技大学硕士学位论 文 19 2003, 6: 21218 , M, D, et in 2005, 37(8): 82019 D, , , et of in . J 1995, 15(1): 120 , E, , et a P4 in of 2008, 325(2):42521 J, , , et 2007, 122(1): 28 22 , , ,R. of in a 2005; 7(6): 23 , , , et by as of in 1998, 114(1): 11924 S, , , et of a in a 2005, 105(9): 364125 , B. in in 2001, 3(1): 1326 M, M, M, et In h1 to J 2004, 173(3): 164027 M, , R, et T in a in J 华中科技大学硕士学位论 文 20 2000, 165(6): 313628 , , C, et 999, 191(1): 699 V, . in of 2002, 138(5): 461综 述 类风湿性关节炎的研究进展 华中科技大学硕士学位论 文 21 类风湿性关节炎 ( 以关节滑膜慢性炎症为主的自身免疫性疾病，其特征性症状为对称性、周围性多个关节慢性炎性病变，临床表现为受累关节疼痛肿胀、功能下降，病变呈持续、反复发作过程，致残率高达 40以上 ,缩短人们的期望寿命，增加家庭及社会负担 1。它的基本病理改变为关节滑膜慢性炎症形成侵袭性血管翳，破坏软骨、骨和周围组织，是国内最常见的风湿病之一。其发病机制尚未完全明确，目前认为类风湿关节炎可能是由于携带类风湿关节炎易感基因者被某种病原体感染后导致机体免疫系统紊乱，通常认为与 T 细胞免疫反应和 B 细胞产生自身抗体有关，由多种细胞产生的细 胞因子在类风湿关节炎滑膜病变中也起到非常重要的作用。根据统计表明， 全世界均有发病，平均发病率为 1 , 2