酶类药物的分析ppt课件

1 酶类药物的分析 第一节概述第二节酶类药物的鉴别与检查第三节酶活力测定方法第四节酶活力测定方法设计第五节典型酶类药物的检测 2 3 第一节概述 在生物体内 降低反应活化能 加快可逆反应的进行速度 一 酶的特性二 酶的分类三 酶的化学组成四 酶的催化反应机制五 酶催化反应动力学 4 一 酶的特性 1 酶是高效催化剂 2 酶对底物的结构具有严格的选择性 1 相对专一性 脂肪水解酶 蛋白水解酶 2 绝对专一性 脲酶 3 立体异构专一性 L 氨基酸氧化酶3 酶催化反应的反应条件温和 4 酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节 5 5 6 二 酶的分类 氧化还原酶转移酶水解酶裂合酶异构酶合成酶 或称连接酶 7 三 酶的化学组成 分为简单酶和结合酶两大类 结合酶类中除含有蛋白外 还含有某种热稳定的非蛋白质的小分子物质 二者结合起来 称为 全酶 才呈现生物催化活性 结合酶 酶蛋白 辅助因子 8 四 酶的催化反应机制 1 酶 底物复合物的形成在酶促反应中 反应底物首先与酶分子上活性部位结合 形成酶 底物复合物 降低反应的活性能 使酶促反应顺利进行 2 酶 底物复合物加速反应速率的原因 1 定向作用与底物浓缩 2 酶使底物分子变形 3 酸碱催化 4 共价催化 9 五 酶催化反应动力学 酶的活力单位酶活性单位 U 是酶活性高低的一种量度 用U g或U ml表示 酶活力单位定义 在规定的条件下 每分钟能转化1 mol底物所需要的酶量 称一个酶的活力单位 酶的比活力每毫克酶蛋白所含酶活力 U mg 10 Michaelis Menten快速平衡学说 底物浓度的增加 反应速度上升呈双曲线 在低底物浓度时 反应速度呈直线上升 表现为一级反应 在高浓度时 反应速度达到一个极限值 呈现零级反应 11 米氏方程 酶反应动力学方程式 V 反应初速度Vm 最大反应速度Ks 米氏常数 Ks K 1 K1 Ks为ES的解离常数 表示酶与底物的亲和力 Ks为反应速度V是最大反应速度Vm一半时所需底物浓度 即V 1 2Vm时 Ks S 12 Briggs Haldane稳态学说 ES的形成速度与ES的解离速度相等 达到动态平衡 即 稳态 反应方程式 Km取代了Ks 当V 1 2Vm时 Km S Km也表示为底物与酶的亲和力 13 2015版药典收载的酶原料 胰酶 胃蛋白酶胰蛋白酶 糜蛋白酶 玻璃酸酶尿激酶抑肽酶 门冬酰胺酶 中国药典 收载的酶类药品品种 15 第二节酶类药物的鉴别与检查 鉴别方法 蛋白质鉴别方法 如在碱性条件下的双缩脲反应 SDS PAGE电泳 降纤酶HPLC 门冬酰胺酶专用于酶的鉴别方法 酶活性试验 与特异性底物反应 胰蛋白酶 沉淀试验 胃蛋白酶动物试验 透明质酸酶水解粘多糖 16 酶类药物的检查 酶类药物是生化产品和微生物发酵产品 在生产过程中可能带入微量的脂肪类物质 其他的酶类和大分子杂质 影响酶质量 需有含量限度 17 酶类药物的检查 一 脂肪含量限度检查检查方法 乙醚浸提 干燥 精密称定 脂肪不得过规定的含量 二 其他酶类含量限度检查胰蛋白酶 糜蛋白酶均是从牛 猪的胰脏中提取的蛋白分解酶 提取胰蛋白酶时又易带入微量的糜蛋白酶 三 大分子活性物质含量限度检查 18 胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量 每2500U胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶 糜蛋白酶专属水解芳香氨基酸 L 酪氨酸 L 苯丙氨酸 的羧基形成的肽键 酰胺键和酯键 用N 乙酰 L 酪氨酸乙酯 N Acetyl L TyrosineEthylester ATEE 作底物 通过分光光度法测定此酶对底物的水解速率来检查该酶的含量限度 19 第三节酶活力测定方法 固定时间法连续监测法固定浓度法 20 一 固定时间法 终点法 在适宜的条件下 使酶和底物共同保温一定时间 测定产物生成的量或底物消耗的量 计算出酶的含量 或活力 E 表示酶浓度 P 为反应产物浓度 t表示酶作用时间 K为常数 21 实例 1 胰弹性蛋白酶活力单位定义 在pH8 8 37 条件下作用20min 水解1 0mg刚果红弹性蛋白的酶量定义为一个活力单位 2 天冬氨酸酶活力单位定义 在测定条件下 每小时每克细胞转化生成1 mol天冬氨酸所需的酶量 22 注意事项 缺点 无法了解整个反应过程是否都是零级反应 注意事项 1 底物饱和2 时间 23 二 连续监测法 反应速度法 在酶反应过程中 连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量 酶底物大多是人工合成的 色素元 其本身无色 经酶作用后释放出有色的反应产物 根据反应过程中吸收度增高速率 算出酶活力单位 测定时间 例如 磷酸对硝基苯酚酯对硝基苯酚法 下文为中国药典2015版胰蛋白酶活力测定方法 请仔细阅读 并阐述此酶活力测定的原理 其酶活力测定方法属于哪一种 胰蛋白酶作用位点有哪些 写出测定所用底物的英文缩写 供试品的制备 精密称取本品适量 用盐酸 0 001mol L 制成每1ml中含50 60胰蛋白酶单位的溶液 底物溶液的制备 取N 苯甲酰 L 精氨酸乙酯盐酸盐85 7mg 加水溶解使成100ml 作为底物原液 底物溶液应在制成后2小时内使用 测定法 取底物溶液3 0ml 加盐酸溶液 0 001ml L 0 2ml 混匀 作为空白 取供试品溶液0 2ml加底物溶液 预热至25 0 5 3 0ml 立即计时并摇匀 使比色池内温度保持在25 0 5 照紫外 可见分光光度法在253nm的波长处 每隔30秒种读取吸收度 共5分钟 每30秒钟吸收度的变化率应恒定在0 015 0 018之间 呈线性关系的时间不得少于3分钟 若不符合上述要求 应调整供试品的溶液浓度 另行测定 以吸收度为纵坐标 时间为横坐标做图 取在3分钟内成直线部分的吸收度 按下式计算 式中P为每1mg供试样品中胰蛋白酶的单位数 A1为直线上终止的吸收度 A2为直线上开始的吸收度 T为A1至A2读数的时间 分 W为测定液中供试品的量 0 003为上述条件下 吸收度每分钟改变0 003相当于一个胰蛋白酶单位 25 三 固定浓度法 fixed concentrationessay 根据酶催化反应 使反应产物达到额定的浓度时其反应时间与酶浓度成反比的原理进行设计的 P K E t以所需时间的倒数 1 t 对酶浓度作图即可制备标准曲线 优点 1 记录时间 2 准确 26 第四节酶活性测定方法的设计 一 影响因素二 底物与产物的测定方法三 测定条件的选择 27 一 影响因素 1 底物2 pH3 温度4 酶浓度5 空白和对照 28 底物 酶可以同时作用多个底物 以Km最小者作为此酶的生理底物 从底物性质看 选用的底物最好在物理化学性质上与产物不同 利于测定 从底物浓度看 为不使酶反应受到它的控制 反应系统应使用足够高的底物浓度 29 胰凝乳蛋白酶几种底物的Km 30 底物浓度对酶反应速度的影响 31 pH 酶活力测定选用缓冲体系 不同缓冲液所受影响不同 磷酸盐所受影响较小 而Tris则受影响较大 酶溶液用量与底物溶液比例不超过10 为宜 32 温度 温度变化1 反应速度可能相差10 以上 控制在 0 1 反应温度一般为25 此时酶不易灭活 Km较小 可以使用较低的底物浓度 有些酶在37 不稳定 33 酶浓度 酶样要充分稀释 取3个不同酶量测得的产物量和酶浓度之间为正比关系 这样的酶浓度范围就是适当的 34 空白和对照 空白 指杂质反应或自发反应引起的变化量 代表未知因素的影响 分为完全空白 如测定时要终止反应 则空白可先加终止反应试剂再加酶 酶空白底物空白 35 二 底物与产物的测定方法 酶反应的检测方法 1 化学方法 用化学法测定其中某一底物或产物的变化值 2 分光光度法 常用的有比色法和紫外分光光度法 3 荧光测定法 简单 灵敏 快速 4 电化学分析法 1 离子选择性电极分析法 2 微电流法5 其他方法如测定气体的测压法 测定产物旋光度变化值的旋光测定法 酶活力测定反应的检测方法按照酶法分析方法测定酶活性时 需要跟踪酶促反应中某一反应底物或产物的浓度随时间发生的变化量 速度法 或测量酶促反应中反应产物或底物浓度的总变化量 终点法 可针对某些易于测定的酶促反应底物或产物选择具体的检测方法 包括容量分析法 气体检测法 光学检测法 黏度测定法 酶联免疫法等 分光光度法若酶促反应中 反应底物或产物之一由于化学结构的改变 其吸光度的强度发生变化 可以通过测定该酶促反应系统的光吸收度的变化量 推算出酶的活力 多数酶类药物的含量检测 效价测定 均采用分光光度法 如胃蛋白酶 糜蛋白酶 门冬酰胺酶 溶菌酶等 37 三 测定条件的选择 1 单因素选择2 正交设计 多因素选择 38 1 单因素选择 比色法测溶菌酶活性 以染料艳红K 2BP标记的M Lysodeikticus为底物 分解后产生游离染色碎片 产物 离心除去未分解底物 上清液比色吸收度为溶菌酶活力的函数 39 测定条件选择 SpH 1 酶反应底物浓度曲线以染料标记的M Lysodeikticus为底物 酶量为20 g时 1 底物浓度已接近使酶饱和 2 酶反应PH曲线磷酸缓冲液和柠檬酸 磷酸缓冲液 不同组分的缓冲液 其最适PH稍有不同 选用pH6 5磷酸缓冲液 40 测定条件选择 离子强度 反应时间及 E 3 离子强度对酶反应的影响离子强度在0 3mol L以上为宜 选用0 5mol L 4 酶反应过程曲线 反应时间 和酶浓度曲线酶量为20 g时 反应在30分钟以内 吸收度与反应时间有良好的线性关系 测定系统选用15分钟 酶量在50 g之内 吸收度与酶浓度具有线性关系 41 测定条件 1 染色菌体缓冲液1ml37 水浴保温约5分钟加酶试样0 5ml准确反应15分钟加入酸 乳化剂混合液2ml 终止反应 反应液经离心 上清液于540nm比色 所得吸收度从酶浓度标准曲线即可查出试样中溶菌酶含量 42 二 正交设计 多因素选择 正交试验设计 Orthogonalexperimentaldesign 是一种高效的利用正交表来安排多因素多水平设计试验的方法 通过巧妙的安排和分组 用较少的试验次数 就能分析各因素的作用大小 找出最佳的试验条件 利用各因素所对应指标的极差R及平均极差D作出判断 43 正交试验优选中性蛋白酶活力测定条件 中性蛋白酶是一种蛋白水解酶 活力测定以酪蛋白为底物 水解产物与福林试剂在碱性情况下反应生成有色物质 于680nm处测定吸收值 中性蛋白酶作用受缓冲液的pH值 底物浓度 反应时间及酶浓度等因素的影响 供试品 0 01 的中性蛋白酶溶液 底物 酪蛋白 44 实验方案 实验取四个因素 PH值 底物浓度 反应时间 酶浓度 每个因素选三水平 属于多因素多水平 为此选用L9 34 正交表进行实验 45 46 正交试验表 47 正交实验安排表 48 正交实验安排表 49 各因素试验值计算结果 平均极差越大 对应的因素影响越大 缓冲液PH值7 2 底物浓度0 5 酶浓度用100U ml为最佳反应条件 反应时间为10 20 30min 对OD值无显著影响 50 各因素试验值的方差分析 结论 PH值 A 底物浓度 B 酶浓度 D 为非常显著因子 反应时间 C 为非显著因子 51 第五节酶类药物的检测 肽键水解酶脂键水解酶糖苷键水解酶其它 超氧化物歧化酶 52 一 肽键水解酶 1 胰蛋白酶2 弹性蛋白酶3 尿激酶 53 54 1 胰蛋白酶 Trypsin 胰蛋白酶 Trypsin 由动物胰脏中提取的一种蛋白水解酶 牛胰蛋白酶 223个氨基酸 分子量24000 等电点10 1 猪胰蛋白酶 214个氨基酸 分子量23400 等电点10 8 胰蛋白酶最适pH为7 6 8 0 电泳纯的胰蛋白酶的比活为8000单位 mg 55 胰蛋白酶 56 胰蛋白酶 57 原理 胰蛋白酶专一作用于赖氨酸 精氨酸等碱性氨基酸的羧基组成的肽键 酰胺键及酯键 水解速度为酯键 酰胺键 肽键 BAEE Benzoyl L Arginine Ethyl Ester BAA Benzoyl L Arginine Anide 苯甲酰 L 精氨酸乙酯 BAEE 在胰蛋白酶的作用下 酯键被水解生成苯甲酰 L 精氨酸 在253nm波长处的吸收度随酶促反应递增 因此连续记录不同时间的产物生产量 根据活力单位定义计算酶活力 58 测定法 取呈直线的吸收度 按下式计算 P为每mg供试品含胰蛋白酶的单位 U A1为直线上终止的吸收度 A2为直线上开始的吸收度 T为A1至A2读数的时间 min W为测定液中供试品的量 mg 吸收度每分钟改变0 003 即相当于1个胰蛋白酶单位 下文为中国药典2015版胰蛋白酶活力测定方法 请仔细阅读 并阐述此酶活力测定的原理 其酶活力测定方法属于哪一种 胰蛋白酶作用位点有哪些 写出测定所用底物的英文缩写 供试品的制备 精密称取本品适量 用盐酸 0 001mol L 制成每1ml中含50 60胰蛋白酶单位的溶液 底物溶液的制备 取N 苯甲酰 L 精氨酸乙酯盐酸盐85 7mg 加水溶解使成100ml 作为底物原液 底物溶液应在制成后2小时内使用 测定法 取底物溶液3 0ml 加盐酸溶液 0 001ml L 0 2ml 混匀 作为空白 取供试品溶液0 2ml加底物溶液 预热至25 0 5 3 0ml 立即计时并摇匀 使比色池内温度保持在25 0 5 照紫外 可见分光光度法在253nm的波长处 每隔30秒种读取吸收度 共5分钟 每30秒钟吸收度的变化率应恒定在0 015 0 018之间 呈线性关系的时间不得少于3分钟 若不符合上述要求 应调整供试品的溶液浓度 另行测定 以吸收度为纵坐标 时间为横坐标做图 取在3分钟内成直线部分的吸收度 按下式计算 式中P为每1mg供试样品中胰蛋白酶的单位数 A1为直线上终止的吸收度 A2为直线上开始的吸收度 T为A1至A2读数的时间 分 W为测定液中供试品的量 0 003为上述条件下 吸收度每分钟改变0 003相当于一个胰蛋白酶单位 60 2 胰弹性蛋白酶 Elastase 肽键水解酶 存在于哺乳动物胰脏 胰弹性蛋白酶是由240个氨基酸组成的单一肽链 有四对二硫键 分子量为25900 等电点为9 5 胰弹性蛋白酶除水解弹性蛋白外 还可以水解血红蛋白 酪蛋白等蛋白 刚果红 弹性蛋白 61 胰弹性蛋白酶测定原理 刚果红 弹性蛋白法 以刚果红 弹性蛋白为底物 由于刚果红 弹性蛋白结合的共价键能被弹性酶水解 根据刚果红在495nm处有最大吸收 由标准曲线即可查得弹性酶单位数 单位 20分钟水解1mg刚果红 弹性蛋白所需的酶量为一个弹性酶活力单位 62 方法 63 3 尿激酶 Urokinase 由人尿制得的一种碱性蛋白水解酶 主要作用是激活人体内纤维蛋白溶酶原使其成为有活性的纤维蛋白溶酶 从而解聚血纤维蛋白 溶解血栓 天然尿激酶的分子量为54000 其作用于纤维蛋白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维蛋白溶解酶 64 效价测定原理 气泡上升法 尿激酶激活人体内纤维蛋白溶酶原使其转化成纤维蛋白溶酶 纤维蛋白原在凝血酶的作用下 转变成纤维蛋白凝块 此凝块在纤维蛋白溶酶作用下 水解为可溶性小分子多肽 在纤维蛋白溶酶原过量的情况下 尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系 65 操作 气泡上升法 试管中加纤维蛋白原溶液0 3ml 37 水浴 标准品 或供试品 1 0ml加混合溶液0 4ml立即摇匀计时 反应系统应在30 45秒内凝结 当凝块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应终点 以尿激酶的浓度为横坐标 以反应时间的对数为纵坐标 66 二 脂键水解酶 胰脂肪酶 PancreaticLipase 胰脂肪酶是一种水解酶 在一定条件下把甘油三脂类脂肪水解 最后生成甘油及脂肪酸 底物 橄榄油用已知浓度的标准碱溶液滴定 可定量地测定脂肪酸的量 从而得知脂肪酶活力 67 测定 68 计算 每分钟水解橄榄油产生1 mol脂肪酸的酶量 为1个活力单位 每克含有的胰脂肪酶单位A 供试品消耗NaOH 0 1mol L 的体积B 空白消耗NaOH 0 1mol L 的体积W 供试品取样量 g N 供试品稀释倍数 69 三 糖苷键水解酶 溶菌酶 蛋清中提取的能分解粘多糖的碱性水解酶 溶菌酶 Lysozyme 具有抗菌 抗病毒等作用 溶菌酶分子量为14000 15000 由129个氨基酸残基组成 等电点为10 0 11 1 溶菌酶属糖苷键水解酶 能以某些细菌细胞中的多糖为底物 70 溶菌酶作用位点 71 青霉素 转肽酶底物末端的二肽D Ala D Ala结构 72 效价测定 比浊法 以溶酶小球菌为底物 主要成分为粘多糖 粘多糖由NAG和NAM重复而成 只能水解NAMC1和NAGC4之间的 1 4糖苷键 溶酶小球菌胞壁中的粘多糖经过溶菌酶的水解后 导致溶菌 溶液的吸收度下降 在一定的条件下 每分钟吸收度下降0 001为一个酶活力单位 73 比浊法测定 计算 酶活力单位 u mg W为测试液中供试品的重量 g 74 比色法 测定溶菌酶活性 用染料艳红K 2BP标记的M Lysodeikticus为底物 酶催化细胞壁分解时游离出染色碎片 产物 反应后离心除去未分解底物 上清液比色 吸收度为溶菌酶活力的函数 75 溶菌酶效价测定 比色法 76 四 超氧化物歧化酶 Superoxidedismutase 由动物红细胞制得的金属酶 能催化超氧阴离子转化成过氧化氢和氧 来源于牛 猪 人红血球的超氧化物歧化酶 SOD 含铜和锌 分子量32000左右 SOD对热较稳定 在pH5 3 9 5范围内对酶活性影响不大 牛红细胞SODPI为4 95 77 效价测定 SOD测定方法 间接法 使用氧自由基指示清除剂 SOD与指示清除剂竞争O2 从而抑制指示清除剂与O2 的结合 根据指示清除剂与O2 反应速度的变化可间接测定SOD的活性 间接法包括 黄嘌呤氧化酶 细胞色素C法和邻苯三酚法 78 黄嘌呤氧化酶 细胞色素C法 原理 在有氧条件下 黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸 与此同时产生O2 氧化型细胞色素C被O2 还原为还原型细胞色素C 后者在550nm有最大吸收 因此测定氧化性细胞色素C在加入SOD前后的光吸收变化可间接计算酶活性 79 方法 80 注意点 在特定条件下 25 pH7 8 每分钟抑制细胞色素C还原速率达50 所需要的酶量为一个活力单位 注意事项 重金属离子易使黄嘌呤氧化酶失活 因此反应体系中必须添加EDTA 反应体系中含过氧化氢酶可引起还原型细胞色素C发生过氧化作用 从而干扰检测的正确 81 邻苯三酚法 原理 在碱性条件下 邻苯三酚会发生自氧化生成红酚 同时生成O2 当有SOD存在时由于它能催化O2 与H 结合生成O2和H2O2 从而阻止了中间产物的积累 定义 在一定条件下 每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50 的酶量为一个酶活力单位 82 操作 定义 在一定条件下 每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50 的酶量为一个酶活力单位 83 门冬酰胺酶 L Asparaginase 本品系自大肠杆菌 E coliASI 357 中提取制备的具有酰氨基水解作用的酶 每毫克蛋白含门冬酰胺酶效价不得低于250U 抗肿瘤酶类药物 肿瘤细胞缺乏L 门冬酰胺合成酶 治疗小儿急性淋巴细胞性白血病和淋巴肉瘤 84 测定 在上述规定条件下 每分钟催化L 门冬酰胺水解释放1 g分子氨所需的酶量定义为1个酶活力单位比活力测定方法 采用Lowry法测定蛋白质含量 比活力 酶活力 U 蛋白含量 mg 85 天冬氨酸酶活力的测定 一个酶活力单位定义为在测定条件下 每小时每克细胞转化生成1 mol天冬氨酸所需的酶量 86 实例 尿激酶 urokinase 本品系从新鲜人尿中提取的一种激活纤维蛋白溶酶原的酶 由高分子量54000和低分子量33000组成的混合物 高分子量含量不得少于90 每1mg蛋白中尿激酶活力不得少于12万U 蛋白分解药物 87 尿激酶 一 性状本品为白色非结晶状粉末 二 鉴别取比活力测定项下的供试品溶液 用巴比妥 氯化钠缓冲液 pH7 8 稀释成每1ml中含20U的溶液 吸取1ml 加纤维蛋白原溶液0 3ml 再依次加入纤维蛋白溶酶原溶液0 2ml 凝血酶溶液0 2ml 迅速摇匀 立即置37 0 5 恒温水浴中保温 记时 反应系统应在30 45s内凝结 且凝块在15min内重新溶解 以0 9 氯化钠溶液作空白 同法操作 凝块在2h内不溶 88 三 检查 1 溶液的澄清度与颜色 应澄清无色 2 分子组分比取本品 加水制成每1ml中含2mg的溶液后 加入等体积的缓冲液 置水浴中3min 放冷 作为供试品溶液 取供试品溶液10 l 加至样品孔 照电泳法测定 按下式计算高分子尿激酶相对含量 89 三 检查 3 干燥失重取本品 以五氧化二磷为干燥剂 在60 减压干燥至恒重 减失重量不得过5 0 4 异常毒性取本品 加氯化钠注射液制成每1ml中含5000U的溶液 依法检查 按静脉注射法给药 应符合规定 5 热原取本品 加氯化钠注射液制成每1ml中含20000U的溶液 依法检测 按家兔体重