生物大分子纳米孔分析技术研究进展

讲述与进展 DOI 10 3724 SP J 1096 2010 00280 生物大分子纳米孔分析技术研究进展 丁克俭 1 2 张海燕 2 胡红刚 2 赵红敏 2 关伟军 1 马月辉 1 1 中国农业科学院畜牧研究所 北京 100193 2 北京交通大学生命科学与生物工程研究院 北京 100044 摘 要 脱氧核糖核酸穿越纳米孔动力学研究以及利用纳米孔开展新型 DNA测序技术研究是后人类基因组 计划的热点之一 本文对生物纳米孔 固态纳米孔以及纳米孔生物大分子识别技术的研究现状进行了归纳和 总结 并对该领域的发展趋势进行展望 关键词 纳米孔 溶血素蛋白 生物大分子识别 综述 2009 05 24收稿 2009 09 30接受 本文系国家自然科学基金项目 No 10704007 国家科技支撑项目 N os 2006BAD13B08 2008BADB2B01 和国家科技基础条件平台 建设项目 No 2005DKA21101 资助 E mai l yuehu i ma 263 net w jguan86 iascaas net cn 1 引 言 生物体内存在大量的膜通道 用于调控蛋白质 核酸等生物大分子的运输 并作为新陈代谢的途 径 1 包括细菌多孔 线粒体通道 一些毒素通道 核孔复合体以及蛋白引导的内质网通道 2 3 生物体 中许多进程都会涉及到生物聚合链穿越嵌入生物膜上通道 这些通道和生物大分子在空间结构尺度上与 纳米技术相吻合 因此纳米技术的发展为蛋白质 DNA等生物大分子识别的研究提供了更多的可能性 20世纪 90年代 哈佛大学 Branton实验室和剑桥大学的 Bayley实验室先后发表了单链 DNA在电 场作用下通过纳米孔通道研究发现 提出了纳米孔 DNA测序的设想 4 6 DNA序列分析是现代生命 科学研究的核心技术之一 也是人类基因组工程的枢轴 传统用于 DNA测序的方法有双脱氧核苷酸链 终止法 Sanger法 和焦磷酸测序法 Pyrosequencing法 是目前使用最普遍的 DNA 序列分析技术 Sanger法的优势在于可以分析未知 DNA的序列 且单向反应的读序能力较长 但是需要昂贵的仪器和 试剂 仅测定 DNA单一片断 焦磷酸测序技术可以检测核苷 但是会出错 因为这项技术很难区分单一 碱基和一串类似的相邻碱基之间的差异 7 可见 传统用于 DNA测序的方法技术要求高 成本贵 而且 容易出错 因此 开发出快捷廉价而且准确的 DNA测序方法 实现 1000美元 人的宏伟基因组测序计 划 无疑能显著促进生命科学的发展 为 DNA测序用于人类疾病临床治疗打开了新的大门 利用生物大分子穿越纳米孔的特点对实现这种新型 DNA测序方法具有重要意义 在过去十几年 里 科学家利用不同的技术研究聚合链 包括核酸 穿越纳米孔 主要研究方向涉及以下几个方面 8 生物纳米孔的自组装和固态纳米孔的制备研究 通过单链 DNA或 RNA分子穿过纳米孔研究其结构 碱 基对组成以及动力学属性 9 13 通过不同发卡结构 DNA的快速辨别和把 DNA分子短暂地驻留在纳米 空间内研究 DNA发卡结构的稳定性 14 基于单链 DNA分子片断能和 溶血素孔 hemolysin 或低 聚核苷酸共价键结合的 DNA杂交性 H ybridization研制生物传感器 15 16 一价或二价阳离子束缚位置修 饰 溶血素孔 进而通过这些束缚的阳离子减少了通过孔的电流研究绑定动力学 17 18 在孔道内部装 配非共价键的绑定分子适配器进而调整通道电流堵塞 6 本文概述生物纳米孔结构 固态纳米孔研制 以及纳米孔生物大分子探测原理 为纳米孔在生物大分子研究方面的应用提供思路 2 生物纳米孔 众所周知 生物膜上具有各种各样的通道 基本上都是由纳米尺度的孔道组成 如离子通道 水通 第 38卷 2010年 2月 分析化学 FENXIHUAXUE 评述与进展 Chinese Journal ofAnalyticalChe m istry 第 2期 280 285 道等 目前 利用生物纳米孔技术研究 DNA排列次序等特性所采用的主要是葡萄球菌 溶血素孔 该纳米孔是众多生物纳米孔中结构组成相对简单 并且研究比较详细的一种溶血素 是从葡萄球菌中分 离出来的一种多肽毒素 能够自组装进植烷醇卵磷脂类脂双分子层膜中 19 20 1986年 Menestrina通过 单低聚合物的电导率估计 溶血素孔的有效孔径大约为 1 14 0 04 nm 21 进一步研究表明 溶 血素孔是被溶剂填充的具有蘑菇形的同质低聚物构成的七聚物孔 其结构如图 1所示 总长约为 10 nm 直径约为 1 4 4 6 nm 20 其主干部分的高度和直径分别为 5 2和 2 6 nm 七聚物的原聚体的氨基顺 时针和相邻原聚体结合 其富含甘氨酸域的残基以接近 180 角缠绕在七重轴周围 在 Cap区域 原聚 体连接通过侧链 侧链相互作用 主链 主链相互作用 使得在 Stem区域 Beta链形成 Beta网格 图 1 溶血素蛋白的侧视 A 和正视图 B 每条色带代表七聚物的原聚体 20 F ig 1 V iew perpendicular to the sevenfold axis and approxi mately parallel to the putative mem brane plane A V ie w from the top of the structure and parallel to the sevenfold axis R ibbon rep resentations of the hemolysin HL heptamerw ith each protomer in a different color B 20 典型的穿孔实验中 单个 溶血素孔在磷脂双分子层上通过自组装方式形成的 其组装后的微观模型 如图 2所示 22 红色 蓝色 绿色和白色分别表示负电荷 正电荷 极性和非极性链 绿色小球表示 DPPC 图 2 溶血素蛋白通道在自然环境下组装到 磷脂双分子层上的微观模型 22 Fig 2 M icroscopicmodel of HL channel in its native environment a lipid bilayer me mbrane 22 磷脂双分子层的磷原子 整个模型由 288 678个原子构成 研究表明 在 1mol L KCl条件下 约为 11个 K 和 11个 Cl 可以停留在 溶血素孔内 在 p H 7 5条件下 溶血素蛋 白孔一直处于稳定开启状态 23 尤其在 pH 8 5和温度在 2 22 时 发现通过孔的电流在 1 d内都保持稳定 3 固态纳米孔 尽管 溶血素孔能构满足生物大分子穿越动力学研 究 但是由于生物蛋白寿命和活性的限制 纳米孔 DNA 测 序技术的进一步研究受到一定限制 理想的生物物理或生 物化学研究应采用孔径稳定 物化性能良好的固态纳米孔 Si3N4晶体薄膜是最具潜力用来加工生物物理研究用纳米 孔材料之一 目前 固态纳米研制孔技术 取得较好结果的 技术有同步辐射源技术 24 25 UV和离子束平板印刷 26 27 显微镜电子束技术 28 和聚焦离子束技术 FIB技术 29 30 等 其中 最常见的研制固态纳米孔的聚焦粒 子束技术是 1990年代发展起来的刻蚀手段 是第一种专门用于为光刻掩模版修补和集成电路修饰的精 细加工技术 能在薄绝缘固态膜上制作纳米孔的带有反馈控制的低能离子束溅射系统基本原理图如图 3a所示 当大量能量为数 keV的离子碰撞材料表面 将会导致表面蚀刻 通常认为每一个激发离子将会从表面 移走一个原子 31 33 利用离子束形成纳米孔基本操作过程图 3b所示 样品是通过化学蚀刻的方法在 281 第 2期丁克俭等 生物大分子纳米孔分析技术研究进展 图 3 离子束溅射形成纳米孔策略 29 Fig 3 Strategy to make nanopores using argon ion bea m sputtering 29 a 反馈控制系统的低能离子束溅射系统 Sputtering removes material from a free standing Si3N4 membrane w ith a cavity b 固态 Si3N4纳米孔形成的基本过程 Feedback controlled ion beam sculpting apparatus housed in a high vacuum chamber Si3N4膜表面中心形成一个倒置的碗状空腔 29 空 腔底部的 Si3N4层在离子束溅射下逐渐被剥离 最 后形成所需纳米孔 系统的单离子探测装置监控穿 过纳米孔的离子束粒子数并决定孔径的大小以及离 子束何时停止蚀刻 同时系统还应包括样品温度控 制系统 离子束占空控制系统 样品架控制系统以及 离子束流控制系统 哈佛大学的 Golovchenko小组 利用 3 keVAr 离子获得孔径可控的 Si3N4纳米 孔 29 Stor m 根据与 FIB刻蚀纳米孔基本相同的原 理 利用投射电子显微镜 11EM 上的电子束在 Si O2薄膜上刻蚀出孔径为 3 nm 左右的小孔 但由 于 Si O2薄膜电阻率远低于 Si3N4晶体薄膜 目前无 法通过微电流法来探测生物大分子 28 4 纳米孔生物大分子探测 纳米孔生物技术探测 DNA序列的基本思想 最 早可以追溯到 1953年 Coulter在利用毛细管脉冲电阻方法统计电流粒子数的基础上提出了纳米孔探测 的概念 34 1970年 DeBlois和 Bean重新对这个概念进行了定义 35 其纳米孔探测的基本原理 当生 物大分子在外界压力下穿过由玻璃等绝缘材料制作的纳米孔或生物纳米孔时会导致通过小孔离子流的 阻塞 小孔电导率的瞬时变化反应了这个过程 电流的减低量反映粒子的体积大小 而电流变化的次数 则反映生物大分子的数目 随着现代电流放大器技术的发展 Coulter方法在分子尺度领域得到了广泛 应用 36 1994年 Bezrukov等的实验证明 在系统中加入乙烯乙二醇时 通过直径为 20 nm 丙甲甘肽 A lamethicin 通道的粒子流减少 对电流波动的分析获得了聚合链在通道内的扩散因子 37 近年来 科学家们已利用纳米孔开展了许多有意义的生命科学研究 原理示意图如图 4 36 41 单 链 DNA或 RNA分子可以加入到膜两边的 Cis 或 Trans 容器中 Trans 电极的正电位导致带有负电 荷的聚合链进入 HL孔并从膜的一边滑动到膜的另一边 在聚合链穿越孔时 电流急剧下降到原电流 的 10 左右 42 43 图 5是溶液中含有 3个碱基数为 100的单链 DNA分子 整个过程发生 3次电流阻塞 现象 37 多聚核苷酸链穿越过程的穿越时间 t 阻塞发生的间隙 t 以及阻塞电流 I B 可定量的检 测出来 研究表明 t对多聚核苷酸浓度非常敏感 而阻塞电流和穿越时间则和多聚核苷酸的基本参数 有关 Meller等科学家检测单链 DNA分子穿越 溶血素孔导致阻塞电流振幅起伏 时间滞留等图案的 图 4 纳米孔 DNA 探测装置示意图 38 41 F ig 4 Sche matics of nanopore detection 38 41 A 固态纳米孔 DNA 探测示意图 Solid state nanopore detec tion B 溶血素孔 DNA探测示意图 HL detection 图 5 穿越事件电流信号表示图 42 Fig 5 Three translocation events 42 The blocked current corresponds to translocation ofDNA po lynucle otides through HL channe l 282 分 析 化 学第 38卷 不同 区分不同 DNA RNA均聚物 PolyA PolyC PolyU PolydC以及 PolyT 等 聚合物 PolyA30C70结构组成 中的两段嘌呤和嘧啶 也通过此种方法成功鉴别出来 12 13 41 45 Baylay研究组通过对 溶血素孔内表面 电荷进行操纵进而对生物纳米孔改性 提高不同的 DNA碱基占据这个纳米孔的时候产生的电流的扩散 同时他们采用核酸外切酶让 DNA分子以一次一个碱基的速度通过小孔 这两种技术的结合可以辨别长串 的 A T C 和 G 碱基 而 且还能进 行更精细的 识别 诸如识 别随机序 列中的 A C G T 这 4个碱基中的任何一个 如图 6所示 不过这种技术在单碱基层次上尚未达到可靠的分辨率要求 46 48 图 6 单通道记录的 dGMP dTMP dAM P和 dCMP穿越 溶血素孔的信号 47 F ig 6 Nucleotide event distributions w ith per manent adapter single channel recording fro m one bionanopor showing dGMP dTMP dAMP and dCM P discri m ination w ith coloured bands added to represent the residual current distribution for each nucleotide 47 迄今 科学家对于纳米孔甄别 DNA特性实验获得的研究结果主要包括 生物大分子是以一定单体 次序穿越 溶血素孔 每一次穿越事件可由电流信号的变化甄别 能够测量生物大分子长度和空间结 构等 然而 溶血素孔探测存在一些局限性 如 溶血素孔嵌入的凝脂双分子层支架的易破坏性 对 环境因素极其敏感性 而这些环境因素恰恰是控制 DNA结构的重要因素 49 除此之外 溶血素内部 孔径也仅约为 1 5 n m 只能容许单链 DNA RNA和聚核苷酸穿越 限制双链 DNA RNA的穿越 44 因 此并不能用它来研究双链 DNA RNA或聚核苷酸等的结构性质 也不可能利用它直接研究 DNA或组蛋 白的动力学结构 由于这些条件的限制 近年来 固态纳米孔 Solid state nanopore 逐渐成为纳米孔生 物大分子识别研究的热点 50 57 目前利用固态纳米孔探针开展 DNA穿孔研究 实验的偏置电压通常 设置约为 120 mV 穿孔事件 穿孔时间 td和电流偏差 Ib信息由膜片钳系统获取 最近 普渡大学 Brick纳米技术中心的研究人员在固相纳米孔检测 DNA技术上取得了突破性的进展 46 Bashir研究组 利用绝缘体硅材料 Silicon on insulator 构建了固相纳米孔通道 并用发夹 Hairpin loop 结构 DNA探针 修饰纳米孔 他们发现在电场的作用下与探针 DNA完全匹配的单链 DNA能够迅速通过孔道 形成狭深 的电脉冲图谱 而即使只有一个碱基不匹配的错配 DNA 通过时速度缓慢 也无特征峰谷形成 该项研 究实现了生物纳米孔的选择性与固相纳米孔的稳定性的结合 为精确模拟生物膜提供了更有效的纳米 材料模型 从而有望实现在芯片上对少量 低浓度的蛋白质 核酸等生命大分子的测定 可以预见 随着该 纳米孔研究的进一步完善 可以快速提高传统 DNA的测序效率 扩展 DNA测序的应用领域 为后基因组 学提供有力的研究手段 以及进一步为临床医药提供更加精准和个性化的诊疗手段 除了利用纳米孔研制新型 DNA测序技术外 科学家开始尝试利用纳米孔研究 DNA与组蛋白间的 相互作用 在前人的基础上 王鹏业等 50 57 提出通过利用 FIB技术研制的纳米孔研究 DNA分子与核 小体相互作用方案 众所周知 DNA分子通过与带正电的组蛋白静电相互作用使得 DNA分子紧密缠 绕到核小体上 因此在适当的外力作用下 缠绕在核小体上的 DNA分子将被分开 DNA双螺旋是由两 股 DNA单链逆向绕制形成的 具有不同碱基数目 排列次序的 dsDNA片段 与组蛋白结合成核小体 其相互作用力 空间结构 构象等不相同 当其被剥离并穿越纳米孔时 引起电流阻塞振幅 阻塞时间等 变动 双链 DNA与组蛋白八聚体结合在不同的位点上 这些结合位点也具有不同的结构 在电场力作 用下 dsDNA从八聚体上被剥离下来的过程以及 dsDNA拉伸的扭曲等将导致其它结构的转变等 利用 纳米孔研究 DNA与核小体结合动力学 其基本原理与利用纳米孔进行 DNA的超快速测序技术原理基 283 第 2期丁克俭等 生物大分子纳米孔分析技术研究进展 本相同 不过由于纳米孔的空间结构和阻挡力 使组蛋白不能穿越 从而诱使 DNA从组蛋白八聚体上 分离下来 因此 通过准确检测 DNA分子穿孔过程中引起的电流阻塞的振幅起伏 时间迟滞等特性 可 将 DNA与组蛋白的相互作用的一些性质反映出来 5 总结和展望 纳米孔作为一种新型的纳米探测器 其在生物大分子方面的研究方兴未艾 离子流阻塞效应 电流 特征检测以及 DNA特征信息成为 DNA的超快速测序技术实现的关键 但是由于生物大分子聚合物链 穿越纳米孔是一个非常复杂的科学问题 其过程涉及纳米孔与聚合物链的空间结构排列 流体动力学 以及纳米孔 聚合物链间的相互作用等 尽管目前探测器灵敏度已经足够高 但是生物大分子链在受限 空间中构像变化以及其运动的详细特征还无法直接观测到 一些非常重要的物理量也只能通过间接方 法获得 要达到实用阶段还面对许多挑战性问题 例如生物大分子穿越纳米孔的稳定性差 穿越速度快 以及特征信号弱等 随着纳米孔技术难关的攻克 今后纳米孔技术的应用研究 主要将集中以下几个方 面 利用纳米孔探测技术与分子生物学技术结合破译生物大分子各级结构与功能 利用纳米孔研究生物 大分子之间的相互作用 利用纳米孔技术开发疾病诊断系统和新型药物传输系统等 其在生命科学中的 应用必将得到拓宽 许多生命活动规律将揭示 纳米孔技术必将给人类的生活带来深远影响 References 1 Bezrukov SM J M e mbr Biol 2000 174 1 1 13 2 H ille B Ionic Channels of ExcitableM e mbranes Sunderland MA Sinauer Associates Inc 1984 3 LodishH BerkA Z ipursky S L M atsudaira P Balti more D Darnell J M olecular CellBiology 4th Ne w York Free man 2000 4 Seo T S BaiX P K i m D H M eng Q L Shi S RuparelH Li ZM Turro N J Ju J Y Proc Nat Acad Sci USA 2005 102 5926 5931 5 Kasianowich J J Brandin E Branton D DeamerD W Proc Natl Acad Sci USA 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