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文档简介

实验三 PCR扩增检测乙肝病毒 乙肝病毒 HBV 感染引起的乙型肝炎 我国发病率很高 HBV的检测极其重要 HBVDNA存在就可以引起乙肝的传染 乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分 是病毒复制的发动机 PCR技术可以检测出极微量的病毒 是判断其传染性最直接 最可靠的证据 PCR技术已成为公认的对病毒性肝炎的诊断 疗效观察及预防研究工作最理想的方法之一 一 实验目的1 掌握PCR技术扩增的原理2 熟悉PCR扩增检测乙肝病毒的基本操作过程 二 实验原理聚合酶链反应 PolymeraseChainReaction 简称PCR 是在体外条件下利用DNA聚合酶 催化一对引物间的特异性DNA片段合成的基因体外扩增技术 它包括三个基本过程 1 变性 加热使双链DNA变为单链2 退火 急速降温使引物和互补模板在局部形成杂交链3 延伸 耐热DNA聚合酶按5 3 方向催化以引物为起始点的延伸反应 模板DNA 高温变性 低温退火 引物 适温延伸 经过25 35次循环后 目的片段扩增2n倍 两条子代DNA 一次循环 Tap酶 5 3 3 5 3 5 5 3 5 3 三 主要器材及试剂1 主要器材 9700型PCR仪 电泳槽 电泳仪 紫外分析仪 台式高速离心机 2 主要试剂 四 操作步骤1 标本处理 取患者血清40 l 加入DNA提取液40 l 沸水浴10分钟 10000转离心5分钟 取上清液4 l做PCR反应 2 加样 加入提取好的标本4 l 6000转离心10秒 三个扩增步骤温度及时间 循环次数 25次 3 PCR仪上扩增 PCR仪上扩增 加入标本 离心 6000转离心10秒 4 电泳检测 制备2 琼脂糖凝胶 2 琼脂糖的制备 电泳槽的准备 称取0 8g琼脂糖 40mlTBE电泳缓冲液 PH8 0 煮沸溶解 加入 冷却 60 左右 加入溴乙啶EB20 l 倒胶 加样 取扩增后的产物10ul点样于凝胶孔 取样 点样 电泳 点样端接 稳压 50V 电泳30分钟 五 结果观察 紫外分析仪下观察 出现橙黄色条带则为HBV阳性 HBV阳性 HBV阴性 HBV阳性对照 HBV阴性对照 正极 负极 点样孔 五 注意事项1 试剂盒内阳性标本及DNA提取液使用前需充分融化离心 2 反应液的表面为固体封盖剂 电泳取样时从反应管底部吸液 3 EB为强致癌物 操作过程应注意防护 4 注意无菌操作 以免出现假阳
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