酶工程课件整理.doc

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Work, full play party, and branch, and members in five type Enterprise construction in the of core role, and fighting fortress role and pioneer model role; to continues to strengthening four good leadership construction第一章 绪论1.酶的概念：具有生物催化功能的生物大分子。2.酶的来源：适宜的细胞，在人工控制条件的生物反应器中生产各种所需的酶。3.主要目标：经过预先设计，通过人工操作，获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其催化功能。4.酶分类可采用4位标码：第一位：属于六大类中的哪一类；第二位：属于该大类中的哪一亚类；第三位：该亚类中的哪一小类：第四位：具体酶在该小类中的序号。5.六大类酶：（1）氧化-还原酶 ：氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。另有过氧化物酶，氧合酶，细胞色素氧化酶等（2）转移酶 ：转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。（3）水解酶 ：水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。（4）裂合酶：它能催化一个分子分成两个或多个分子，当然也可将两个或多个分子变成一个分子。裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。（5）异构酶：异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。与转移酶不同，异构酶催化的是分子内部的基团转移( 注意！)（6）合成酶 ：又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。 特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需要金属离子辅助因子。6.核酸类酶的分类与命名：核酶本身是一种RNA，但它可特异性催化某个反应，特别是识别和剪切RNA的某个位点。据酶催化反应的类型分为：剪切酶、剪接酶、多功能酶据酶催化的底物分为：分子内催化（自我剪切酶、自我剪接酶）、分子间催化（RNA剪切酶、DNA剪切酶、多糖剪接酶、多肽剪切酶、氨基酸酯剪切酶、多功能R酶）7.酶分析 ：以酶为分析对象，目的是检测食品、药物体液等生物样品中酶的含量或活性。8.酶分析包括两种类型：一是以酶为分析对象的分析，即一般所说的“酶活力测定”；二是以酶为分析工具或分析试剂的分析，称为“酶法分析”。前者的目的在于检测生物样品中某种酶的含量或活性；后者则主要用于测定与生物学有关样品中酶以外其他物质的含量。（1）原理：都是利用酶的专一性、高效催化反应，通过酶反应速度的测定而检测相应的含量；在方法上也都有一个选择适宜反应条件和测定方法，以获得准确可靠的结果的问题。酶法分析：是一种以酶为分析工具（分析试剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶、活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品有关的样品中酶以外其他物质的含量。酶活力：是指酶催化一定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下酶所催化的反应初速度。（单位时间底物减少或产物增加）.（2）酶活力的测定通常包括两个阶段：首先在一定的条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物的变化量。一般经过如下几个步骤：据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配置成一定浓度的底物溶液；据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件；在一定的条件下，将一定的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间；反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。(3)终止酶反应的方法很多，常用的有：反应时间一到，立即取出适量反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离催化反应的最适pH值而使反应终止将取出的反应液立即置于低温冰箱或冰粒堆中，使反应液的温度迅速降低至10以下而终止反应。9.有两种酶活力的标准单位P17：开特（kat）:是酶活力的国际单位（SI），它规定在特定的体系下，反应速度为每秒转化1mol 底物所需的酶量在两种不同的酶活力单位之间换算：1Kat = 6X 107 U酶的一个活力单位：在该酶的最适条件下，在250C，一分钟内催化1mmol(微摩尔）底物的酶量。 酶活力：是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度 比活力：特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。是酶纯度的量度，在酶的纯化过程中它的比活力增高，当酶提纯时，其比活力成为极大和恒定的值。酶活力(或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而比活力是每毫克蛋白质中酶单位的数量（U/mg） 10.测定酶活力的基本要求：（1）要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度的唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）；（2）其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大能力）；11.测定条件选择： （1）底物 种类选择：最适底物a）对于绝对专一的酶无可选择；若相对专一则选Km最小的底物，即所谓最适底物；一般选工作底物；b）要求反应前后有可测定的理化性质变化 c）稳定浓度选择： a） s=100Km； b） 有时不宜采用高底物浓度（有毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等)则根据具体条件，通过实验选一适当浓度。（2）最适pH a）选择最适pH并维持在这一范围。 b）pH稳定常借助缓冲系统来控制，要求稳定、无干扰、价廉。 C）离子种类和强度。（3） 最适温度 酶反应温度系数为每变化 1 摄氏度，反应速度相差10%以上。所以测酶活力时温度保持恒定十分重要，一般应控制在正负1摄氏度以内。多数哺乳动物的酶，其最适温度为37左右，但有些生物机体的酶适应在极端条件下起催化作用，这些酶称极端酶。 （4）样品对某一待测样品测定前,除了上述因素需考虑外，还要确定样品中有无干扰测定结果的因素（与待测酶作用同一底物或生成同一产物的其它酶）。下面介绍几种常用的测定方法：化学法:是取样法的一种,比较古老,但目前仍普遍使用。一是因为此法不需要特殊仪器，而且几乎所有的酶反应都可以根据产物或底物的化学性质找出具体的有特异性的测定方法。（工作量大、误差大、不够准确）光学法：它是一种连续测定法，是根据底物和产物在某一波长或波段上有明显特征吸收差别而建立起来的方法。（灵敏度高、快速、简便）。光学法又可分为三种：光吸收法；荧光法；旋光测定法。 光吸收法：这是几乎所有氧化还原酶都可采用的方法。许多酶本身不能采用光吸收法，但其产物中有脱氢酶底物，则因此可用酶偶联进行测定。荧光法：其原理是酶反应的底物或产物具有荧光性，用荧光变化速度即可测出反应速度。荧光法的灵敏度比光吸收法高2-3个数量级，特别适于酶或底物量低的分析。但荧光法干扰多，需要校正。 旋光测定法：某些酶反应过程中常伴随有底物或产物旋光性质变化。可用自动旋光仪来测定这类酶的反应。此法准确度、灵敏度不高，不方便，但在没有其它更好的方法时，可考虑采用此法。 电化学法:也是一类连续测定法，其灵敏度和准确度都很高，可和光学法相比；而且测定系统被污染也不会影响结果，主要用电极进行测定，常用的是离子选择性电极和氧电极。气体检测法:主要用于有气体吸收或释放的反应，如氧化酶反应耗气、脱羧酶、脲酶等催化的产气反应。常用瓦氏呼吸仪测定恒定体积内压力变化。此法主要缺点是准确度、灵敏度不高，操作麻烦。放射化学测定法:测定时用同位素标记底物，在酶反应进行中，导致放射性标记产物定量形成，分离产物与底物，进行产物的放射性测定或未反应底物的放射性测定，这样就可测知反应进行的速度或酶的活性。酶偶联分析法:某些酶本身不能应用上述几种方法测定时，则可偶联一个酶反应进行测定。12.酶的转换数与催化周期：酶的转换数(KP)，又称摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数，是酶催化效率的一个指标，一般酶的转换数103min-1催化周期：转换数的倒数固定化酶的活力测定：振荡测定法、酶柱测定法、连续测定法。固定化酶的概念：与水不溶性载体结合，在一定的空间范围内起催化作用的酶。固定化酶的比活力测定：一般采用每克（g）干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。相对酶活力的测定：相对酶活力的高低表明了固定化酶应用价值的大小。（1）酶标免疫分析法：它是将免疫学方法的抗体、抗原专一且定量结合的特点和酶的高效专一催化特点有机地结合在一起建立的一种高度特异、灵敏的分析方法。（2）放射免疫分析：是用放射性同位素标记抗原Ag*，该抗原与未标记抗原Ag竞争结合抗体(Ab)结合位点时的能力相同，所以反应生成的Ag*-Ab复合物与Ag的量呈负相关。Ag*-Ab的生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据已知浓度抗原的标准曲线就可以计算出样品中抗原浓度，这种分析方法称为放射免疫分析。酶标免疫测定优点：不需要特殊复杂的设备和仪器;灵敏度高;重复性好;对健康无害（无放射污染）。（3）酶标免疫测定的几个操作问题：酶的要求：专一性强、活性高；在标记测定储存条件下稳定； 测定方法简单、快速、灵敏；纯度高而价廉易得；在被测液中无干扰酶活性测定的因素。酶的标记（1）标记方法：不影响酶活性和免疫活性、操作简便、产量高且稳定；现在最常用的是交联法特别是戊二醛交联法。（2）标记物纯化：酶标反应后必须除去未被标记的抗原或抗体以及未被结合的酶。 （3）免疫活性和酶活性测免疫原的制备 特异性抗体制备 抗体固定定第二章 微生物发酵产酶（1）1.发酵动力学主要研究发酵过程中细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响等。2.细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段。 3.根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即生长偶联型同步合成型、中期合成型；部分生长偶联型延续合成型；非生长偶联型 滞后合成型。（1）同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。这类酶所对应的mRNA很不稳定。（2）延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的mRNA相当稳定。（3）中期合成型：该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。（4）滞后合成型：此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高4.影响酶生物合成模式的主要因素1）mRNA的稳定性（好、差） 2）培养基中阻遏物的存在不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始合成。5.细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。6.产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。7.产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动力学或非结构动力学。也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之微观产酶动力学或结构动力学。8.固定化细胞:固定化活细胞、固定化增殖细胞。指采用各种方法固定在载体上，在一定空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。特点：产酶率提高；可以反复使用或连续使用较长时间；基因工程菌的质粒稳定，不易丢失；发酵稳定性好；缩短发酵周期，提高设备利用率；产品容易分离纯化；适用于胞外酶等胞外产物的生产。9.固定化细胞发酵工艺条件及其控制：（1）固定化细胞的预培养(固定化细胞制备好以后，一般要进行预培养，以利于固定在载体上的细胞生长繁殖。)（2）溶解氧的供给：由于受到载体影响, 氧的供给成为主要的限制性因素。增加溶解氧的方法主要是加大通气量（3）温度的控制(固定化细胞对温度的适应范围较宽，在分批发酵和半连续发酵过程中不难控制 )（4）培养基组分的控制10.固定化细胞生长和产酶动力学：固定在载体上的细胞以一定的速度生长。在达到平衡期以后的相当长的一段时间内，固定化细胞的浓度基本保持恒定。同时，随着细胞的生长和繁殖，有一些细胞泄漏到培养液中，这些泄漏细胞则是游离细胞，它们也在培养液中生长繁殖。 11.固定化微生物原生质体发酵产酶固定化原生质体：是指固定在载体上, 在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。利用固定化原生质体，在生物反应器中进行发酵生产，可以使原来属于胞内产物的胞内酶等，分泌到细胞外，这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺直接从发酵液中得到所需的发酵产物。固定化原生质体的特点：变胞内产物为胞外产物；提高酶产率：稳定性较好;易于分离纯化。12.固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制在工艺条件控制方面需要注意下列问题：(1)渗透压的控制；(2)防止细胞壁再生； (3)保证原生质体的浓度。第二章 微生物发酵产酶（2）1.优良的产酶微生物（酶产量高、产量稳定性好、易培养和管理、利于酶的分离纯化、安全可靠无毒性）2.酶的生物合成(细胞内RNA和蛋白质的合成过程） （1）RNA的生物合成-转录定义 ：以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。反意义链:指导转录作用的一条DNA链有意义链:无转录功能的一条DNA链.（2）蛋白质的生物合成-翻译 定义 ：以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程过程：氨基酸的活化、 肽链合成的起始、 肽链的延伸、 肽链合成的终止与释放。肽链合成的起始阶段：mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物。AUG与蛋氨酰-tRNA结合。大小亚基结合。肽链合成的延伸阶段：进位:氨基酰-tRNA进入受位;转肽:形成肽键,在转肽酶作用下,给位与受位结合; 移位:核蛋白体向3端移动一个密码子的位置,空出受位,不断地进位、转肽、移位,使肽链延长。肽链合成的终止阶段：出现终止密码并与终止因子结合;肽键水解,多肽释放;tRNA,mRNA,大小亚基解离.3.酶生物合成的调节：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，转录水平的调节对酶的生物合成是最重要的调节。意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。 4.调节基因：可产生一种阻遏蛋白 （一种变构蛋白），通过与效应物(effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。5.启动基因（启动子）有两个位点：（1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。CAP：分解代谢产物基因活化蛋白，又称环腺苷酸受体蛋白。只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。 6.操纵基因:位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。7.结构基因:决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质8.酶合成调节的类型 （1）诱导 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：细胞为适应外来底物或其结构类似物临时合成的一类酶。 （2）阻遏 ：分解代谢物阻遏、反馈阻遏 9.酶合成的调节机制酶合成的诱导：加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。反馈阻遏作用：由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。分解代谢物阻遏：是指某些物质分解代谢的产物阻遏某些酶生物合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏现象：葡萄糖效应10.优良产酶菌种应具备的条件：（1）酶产量高 （2）易培养（生长速率高、营养要求低）（3）遗传性能稳定，不易退化（4）易分离提纯（最好是产生胞外酶的菌种）（5）安全可靠（不是致病菌）11.发酵工艺条件及其控制细胞活化：保藏的菌种在用于发酵生产之前,必须接种于新鲜的固体培养基上,在一定的条件下进行培养,使细胞的生命活性得以恢复。（1）培养基的设计原则：1、选择适宜的营养物质 2、营养物的浓度及配比合适3、物理、化学条件适宜 4、经济节约 5、精心设计、试验比较培养基：是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水（2）生长因子：指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另加入少量的生长需求的有机物质分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分等四类。功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 （3）实验室的常用培养基：细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基。（4）发酵条件及控制pH值的控制：为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。细菌与放线菌：pH77.5 酵母菌和霉菌：pH4.56范围内生长细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。 含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使pH值向酸性方向移动；含蛋白质、氨基酸较多的培养基，经过代谢产生较多的胺类物质，使pH值向碱性方向移动；以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被利用，培养基中积累的硫酸根会使pH值降低；以尿素为氮源的，随着尿素被水解生成氨，而使培养基的pH值上升，然后又随着氨被细胞同化而使pH值下降；在氧气供应不足时，由于代谢积累有机酸，可使培养基的pH值向酸性方向移动。调节pH值的方法可以通过改变培养基的组分或其比例；也可以使用缓冲液来稳定pH值；或者在必要时通过流加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的pH值，以满足细胞生长和产酶的要求。温度的控制：通常在生物学范围内每升高10，生长速度加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。 溶解氧的控制：溶解氧的调节控制，就是要根据细胞对溶解氧的需要量，连续不断地进行补充，使培养基中溶解氧的量保持恒定溶氧速率是指单位体积的发酵液在单位时间内所溶解的氧的量。以Kd表示。其单位通常以 mmol氧/hL表示。控制溶解氧方法：调节通气量、调节氧的分压 、调节气液接触时间 、调节气液接触面积 、改变培养液的性质 12.提高酶产量的措施 （1）添加诱导物：对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。诱导物一般可以分为3类：酶的作用底物、酶的催化反应产物、作用底物的类似物。（2）控制阻遏物的浓度：阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。 分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。 （3）添加表面活性剂：表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。 将适量的非离子型表面活性剂添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。 （4）添加产酶促进剂：产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。第三章 动、植物细胞培养产酶1.提取分离法：采集植物有用的物质提取分离纯化得所需物质。特点：提取分离法设备简单，但受到原料来源的限制。2.动、植物细胞培养:是通过特定技术获得优良的动、植物细胞，然后在人工控制条件的反应器中进行细胞培养，以获得所需产物的过程。3.动植物细胞中酶生物合成的调节： 细胞分化改变酶的生物合成（端粒酶） 基因扩增加速酶的生物合成（特殊条件下应急） 增强子促进酶的生物合成（高效增强某些酶基因的表达） 抗原诱导抗体酶的生物合成4.动物、植物及微生物产酶三者之间的差异主要有：l 植物细胞动物细胞微生物细胞。l 动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。l 植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。l 植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。l 植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。l 植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。 5.植物细胞培养与从植物中提取分离相比，具有如下显著特点：提高产率；缩短周期；易于管理，减轻劳动强度；提高产品质量。6.植物细胞培养的工艺流程：外植体细胞的获取细胞培养分离纯化产物7.外植体：从植株取出，经过预处理后，用于植物组织和细胞培养的植物组织（根、茎、叶、芽等）片段或小块常用手段：70%-75%乙醇、5%次氯酸钠、10%漂白粉、0.1%升汞8.从外植体获取植物细胞的方法主要有：（1）直接分离法机械法：捣碎过滤或离心酶解法：利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离出具有代谢活性的细胞。注意：用酶解法分离细胞，必须对细胞给予渗透压保护，如甘露醇等（2）愈伤组织诱导法愈伤组织：能迅速增殖的无特定结构和功能的薄壁细胞团。将外植体植入诱导培养基中，于25左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团诱导获得的愈伤组织可用镊子或小刀分割得到植物小细胞团，也可在无菌条件下，通过振荡，使分散成小细胞团或单细胞。 （3）原生质体再生法植物原生质体可从培养的植物单细胞、愈伤组织和植物的组织、器官中获得，常用酶解法分离原生质体过程：原生质体分离计数、稀释培养9.植物细胞培养的培养基：大量的无机盐、多种维生素和植物生长激素、氮源为无机氮源 、碳源一般为蔗糖。l 温度的控制（一般T为25）l pH值的控制（控制在微酸性范围， pH5.06.0) l 溶解氧的调节控制(通过通风和搅拌来供给） l 光照的控制（据植物细胞的特性以及目标次级代谢l 前体的添加（添加目的代谢物的前体）l 刺激剂的应用（如微生物细胞壁碎片和果胶酶、纤维素酶等微生物胞外酶）10.植物细胞培养产酶的工艺过程 (1)愈伤组织的诱导 (2)悬浮细胞培养 (3)酶的分离纯化11.动物细胞与微生物、植物细胞比较有下列特性：l 无细胞壁，细胞适应环境的能力差，脆弱l 体积比微生物大几千倍，稍小于植物细胞的体积l 细胞培养中，大部分具有群体效应及功能全能性l 动物细胞的营养要求比较复杂，需各种氨基酸、维生素、激素和生长因子，一般要加510%的血清12.血清的作用有以下几个方面：血清中含有各种生长因子，以刺激细胞生长。血清中含有结合毒性物质的因子，可以解除脂肪酸、重金属、蛋白酶等的毒性及中和胰蛋白酶的活性。提供贴壁物质以利于细胞贴壁生长。提供激素、微量元素以及目前还未了解而细胞又需要的物质。13.血清使用的弊端： 血清成份大复杂，据估计多达几百种，因而对于物质-细胞间相互作用机理的研究难以进行，特别是微量生物活性物质的研究。血清各批号间差异较大，实验的标准化和稳定性受到限制。血清在含有促进细胞生长物质的同时也含有抑制细够生长的物质，甚至细胞毒性物质。血清中不能排除含有诱变物质，这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。血清是病毒和支原体污染的主要来源。血清使生物制品生产工艺复杂化。 14.动物细胞培养的特点：可用于各种功能蛋白质的生产；动物细胞的生长较慢；为防止微生物的污染，在培养过程中，添加抗生素；培养过程中要严格控制温度、pH值、渗透压、通风搅拌等条件，以免破坏细胞；原代细胞继代培养50代后，会退化死亡。15.细胞培养的几个重要概念（1）原代细胞：指从体内分离的细胞直接进行培养的培养物，该细胞最接近体内细胞，结果和结论最可靠。但原代细胞的纯度不高，实验重复性不好，操作难度大。（2）细胞系：原代细胞一经传代便成为细胞系。如果细胞获得了“不死性”，便称为无限细胞系，否则称为有限细胞系。原代细胞传代次数的增多将导致细胞性状的广泛变异，细胞系已远离了机体原来的细胞性状。由于优势细胞的快速增殖，细胞系纯度趋向于单一。（3）细胞株：经过单克隆化的细胞群体。为纯度相对最高的无限细胞系。细胞株只能视为具有或保留了某种特性的、有生命活性的实验材料。（4）细胞生长：包括了细胞迁移、形变、体积增大、数目增多。其中数目增多的过程称为细胞增殖。（5）细胞代数：指细胞传代次数而不指细胞增殖次数。16.动物细胞培养的方式：（1）悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。 悬浮培养细胞特点：非锚地依赖性；均匀分散培养液中，生长环境单一，溶解氧和营养成分的利用率高；对剪切力敏感，不能耐受强烈的搅拌和通风，对营养要求复杂。（2）贴壁培养：成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。17.微载体系统特点： 比表面积大，单位体积培养液的细胞产率高 细胞生长环境单一，营养成分利用率高，重复性好固定化细胞培养：细胞和固定化载体结合，在一定的空间范围进行生长繁殖的培养方式。动物细胞的固定化一般采用吸附法和包埋法18.动物细胞培养的工艺条件：种质细胞胰蛋白酶消化处理分散成悬浮细胞接入适宜的培养液（人工控制条件的反应器培养）收集、分离纯化（1）动物细胞培养基的组成成分：氨基酸（各种必须氨基酸）、维生素、无机盐、葡萄糖、激素。培养基（培养液）：是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好。缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。 合成培养基 ：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。（2）温度的控制：一般控制在36.5（3）pH值的控制：一般控制在pH 7.07.6，最适为7.4培养基中pH的调节，通常采用CO2和NaHCO3，增加CO2的浓度，可使培养液的pH降低，但是通过CO2的浓度来调节pH值，会对培养液中的溶解氧产生影响，常在培养液中加入缓冲系统。（4）渗透压的控制：动物细胞培养液中渗透压应当与细胞内的渗透压处于等渗状态（5）溶解氧的控制：供氧不足，细胞生长受抑制；氧气过量，也会产生毒害作用19.细胞培养用液的配制:水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液(BSS):又称生理盐水或盐溶液，是细胞培养中常用的基本液体。它主要由无机盐和葡萄糖配制而成，起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。常用的缓冲液：生理盐水、PB、PBS(注意有无钙镁离子)、Hanks液（含有钙镁离子、葡萄糖、酚红）第四章 酶的提取与分离纯化1.酶的纯化过程： (1) 粗蛋白质: 采样 均质打破细胞 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化: 初步的纯化，使用各钟柱层析法。 (3) 均质酶: 目标酶进一步精制纯化，可用制备式电泳或 HPLC。 2.细胞产生的酶有二类：（1） 由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通常含量高，容易得到。（2） 在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性。3.细胞破碎方法及其原理 ：（1）机械破碎法捣碎法:脆嫩组织细胞的破碎，也可用于微生物。研磨法：设备简单，助磨剂，用于微生物和植物组织细胞的破碎。匀浆法 ：匀浆器的细胞破碎程度较高，对酶的活力影响不大。（2）物理破碎法（多用于微生物细胞的破碎）温度差破碎法：利用热胀冷缩作用 。压力差破碎法：有高压冲击法、突然降压法及渗透压变化法。超声波破碎法：简便、快捷、效果好 。适合微生物细胞的破碎。（3）化学破碎法细胞膜上磷脂的含量直接影响着膜的完整性和流动性（变形能力），影响着蛋白和受体的位置，进而影响酶活性和蛋白质的转运功能。（4）酶促破碎法自溶法：将细胞在一定pH和温度条件系保温一段时间，利用细胞本身酶系作用，使细胞破坏，释出细胞内物质4.酶的提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。提取目标：a. 将目的酶最大限度地溶解出来。b. 保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。为防止酶失活，采用0-10操作。提取原则：a. 相似相溶。b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 5.酶的主要提取方法： （1）盐溶液提取：大多数蛋白类酶都溶于水，对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。盐溶：在低浓度盐存在条件下，酶的溶解度随盐浓度升高而增加。盐析：盐浓度达到某界限后，酶的溶解度随盐浓度升高反而降低。影响酶提取的主要因素：酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。温度：对酶的提取效果有明显影响。适当提高温度，可提高酶的溶解度，也可增大酶分子的扩散速度，但温度过高，易引起变性失活。0-10pH：溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著影响，为提高酶的溶解度,提取时pH值应避开酶的等电点体积：增加提取液用量可提高酶的提取率。提取液的总量一般为原料体积的3-5倍。在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小，则扩散面积越大，有利于提高扩散速度适当的搅拌，可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面，从而增大两相界面浓度差，有利于提高扩散速率适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出来，直至达到平衡。在提取过程中，为了提高酶的稳定性，免致在引起酶的变性失活，可适当加入某些保护剂。6.酶的分离方法（1）沉淀分离：是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。盐析沉淀法：简称盐析法，是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。 在蛋白质的盐析中，通常以硫酸铵最为常用。硫酸铵特点：溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。缺点：缓冲能力差，铵离子的存在会干扰蛋白质的测定。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。饱和度是指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值。等电点沉淀法 ：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在加酸或加碱调节pH值的过程中， 要一边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过碱而引起的酶变性失活。优点： 1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低 3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化缺点：酸化时，容易引起蛋白质失活有机溶剂沉淀法：利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。有机溶剂之所以能使酶沉淀析出是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。有机溶剂沉淀法的分离效果受到溶液pH值的影响，一般应将酶液的pH值调节到欲分离酶的等电点附近。优点： 1）分辨率比盐析法高 2）沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）容易引起蛋白质变性失活 2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 复合沉淀法：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法。常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物 特点：操作条件温和，不易引起生物大分子变性；沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子；沉淀后有机聚合物容易去除。 选择性变性沉淀法：选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀，而不影响所需酶的分离方法据酶和所含杂质的特性，通过加热或改变pH值或加进某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。（2）离心分离：是借助于离心机旋