【毕业学位论文】（Word原稿）大豆球蛋白基因转化水稻的研究生物化学与分子生物学硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 大豆球蛋白基因转化水稻的研究 I o. F I 中文摘要 大豆种子蛋白质中赖氨酸的含量较高，含硫氨基酸的含量偏低，与水稻蛋白质中的氨基酸成分在营养上具有互补性， 因此 把 大豆种子蛋白基因导入水稻中将可以大幅度提高水稻种子的蛋白质含量并改善水稻中氨基酸的组成 ， 对于改良水稻营养品质和提高蛋白利用率都具有重要意义。 本研究首次利用农杆菌介导法将大豆球蛋白基因导入 生产栽培 品种粳稻 9804 和籼稻 并且成功地获得了表达 。主要实验结果如 下： 1、 对 12 个水稻生产品种进行了成熟胚及花药的愈伤组织诱导、继代及分化效率的比较，筛选出粳稻品种 9804 和籼稻品种 种培养力比较高的基因型，确定以成熟胚作为诱导愈伤 组织的 外植体。 2、 分析 了 影响转化效率的因素， 建立 了适合本试验所用品种的一套高效率的组培转化体系。 3、 将本实验室构建的 植物双元表达 载体 大豆球蛋白基因和潮霉素基因）导入农杆菌 ， 并 用 于 转化水稻愈伤组织，共得到抗性植株 9804 品种 86株， 种 18 株 。 将得到的抗性植株进行目的基因和潮霉素基因的 定，证实目的基因已整合到水稻基因组中，共筛选到 31 株含目的基因的 9804 品种和 2 株 种，阳性植株率分别为 11。 4、 对 转基因植株进行目的基因 大豆球蛋白基因和潮霉素基因的 定，证实目的基因已整合到水稻基因组中。同时目的基因在 植株中发生分离，分离比例较复杂 。 5、 对 植株进行种子蛋白含量测定，大部分种子蛋白含量明显增高， 平均提高幅度为 表明目的基因（大豆球蛋白基因）已经在蛋白质水平上得到 稳定 表达。 关键词：水稻，大豆球蛋白基因，农杆菌转化。 of of is to of in ys of of is in of 0% of up 0% of a of to in no in of In 7% in in An of by be of in by no of So it is to as 1. In to by 3 in 2. A by on 3. ,by by YG on of 4. 86 of 8 of in CR of 1% 1 1 5. of 1 IR It 录 中文摘要 . I . 1 章 文献综述 . 1 稻品质研究现状 . 1 加稻米中赖氨酸和蛋白质的含量 . 2 加稻米中维生素的含量 . 2 加稻米中微量矿质营养元素铁的含量 . 3 豆种子贮藏蛋白研究进展 . 3 豆种子贮藏蛋白的理化特性 . 3 豆种子贮藏蛋白的特点和基因结构 . 4 稻遗传转化 . 4 物转基因研究发展现状 . 4 稻遗传转化现状 . 6 基因安全性问题 . 11 结 . 12 研究技术路线 . 14 第 2 章 材料与方法 . 15 料 . 15 稻材料： . 15 杆菌菌株： . 15 粒： . 15 主要生化试剂： . 15 用溶液 . 15 养基 . 15 菌培养基 . 15 织培养相关培养基 . 16 粒 制备 . 17 肠杆菌受体细胞的培养 . 17 肠杆菌感受态细胞的制备 . 17 粒 小量提取 . 17 粒的转化 . 18 组质粒的筛选与鉴定 . 18 杆菌介导法转化水稻 . 19 癌农杆菌感受态细胞的制备 . 19 粒转化农杆菌 . 19 杆菌转化水稻愈伤组织 . 19 稻转化频率的计算 . 20 性愈伤率 . 20 定转化率 . 20 基因植株的分子鉴定 . 21 基因植株的 定 . 21 基因植株的功能鉴定 . 23 基因植株的农艺性状分析 . 23 基因植株的种子蛋白含量分析 . 23 V 第 3 章 结果与分析 . 24 因转化受体系统的建立 . 24 良水稻受体基因型的筛选 . 24 同类型外植体愈伤组织诱导率的统计及分析 . 25 养基的选择 . 26 脂种类及浓度对诱导愈伤的影响 . 26 杆菌介导水稻遗传转化体系的建立 . 27 培养条件对农杆菌侵染及愈伤生长的影响 . 27 霉素筛选压力的确定 . 27 稻的转化 . 29 伤组织的诱导和培养 . 29 性植株的获得 . 29 化效率分析 . 29 伤组织继代培养时间对分化的影响 . 30 选时间对转化效率的影响 . 31 基因植株的分子鉴定 . 31 基因植株的 定 . 31 基因植株的功能鉴定 . 32 第 4 章 讨论与结论 . 34 论 . 34 因转化受体系统的建立 . 34 基因后代农艺性状分析 . 35 米品质改良问题 . 35 论与 创新点 . 36 参考文献 . 37 致谢 . 44 作者简历 . 45 中国农业科学院硕士学位论文 第 1 章 文献综述 1 第 1章 文献 综述 稻品质研究现状 水稻 (重要的谷类作物，世界上一半以上的人口以稻米作为主要粮食。 同时水稻是我国的第一大粮食作物，约占粮食总播种面积和总产的 24%和 40%，近几年播种面积保持在 公顷，总产保持在 吨，单产突破了 6 吨 /公顷， 20 世纪 90 年代中后期，我国约有 65%人口以稻米为主食，常年稻谷消费量在 吨左右。 但是 与大豆、玉米、小麦等相比，水稻作为蛋白质来源的主要局限是含量较低， 在食用精米中蛋白质的平均含量仅为 在谷类作 物中是最低的，且蛋白质中赖氨酸含量仅为 维生素铁含量也较低，也不含维生素 A、 C 、 D。此外，稻米中还含有一些抗营养因子。 因此，利用传统育种方法提高稻米中蛋白质的含量是水稻育种的一个重要方面。国际水稻所 (1967年 )利用从世界各地征集的高蛋白质品种与品种 行杂交，对筛选的一些繁育品系进行鉴定，发现其蛋白质含量比 高 18% 23%，而稻谷产量无显著差异。 稻米的营养品质受品种、环境因素、栽培技术、收获加工和烹调技术等的影响，其中，主要还是受品种的控制。传统育种 技术已大大提高了水稻的产量 (9t/但是存在着周期长、不能够彻底解决诸如稻米中维生素含量低、蛋白质的氨基酸营养组分不平衡等问题。 随着我国人口的不断增长和人们生活水平的日益提高，对水稻的品质及其产量的要求也相应增加。而 传统的育种方法正面临着巨大的挑战。 随着水稻原生质体培养技术的成熟，筛选抗氨基酸及其类似物的突变体为改良水稻的营养品质提供了另外一条技术途径。在植物体中，甲硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸生物合成的前体均为天冬氨酸。高浓度的赖氨酸通过反馈作用抑制着上述氨基酸生物合成途径的限速酶天 冬氨酸激酶 (二氢吡啶二羧酸合成酶 (活性，使由该途径合成的氨基酸含量急剧减少，细胞最终因缺乏这些氨基酸而死亡。在抗性系中，由于 反馈抑制不敏感，使变异细胞系可以利用该途径合成赖氨酸及相关氨基酸，这样抗性系就能在高浓度赖氨酸环境中生存。在非选择培养基上，由于该生物合成途径缺乏有效的反馈抑制而始终处于开放状态造成氨基酸的积累，可以利用这一点来选择高赖氨酸含量的变异株系。 1997年） 等利用在培养基中添加赖氨酸和苏氨酸来筛选水稻愈伤组织的突变体，对其再生植株 连续 4代的种子分析表明，突变体种子蛋白质中的赖氨酸含量比对照平均提高 12% 14%，个别株系种子蛋白质中的赖氨酸含量高达 种子中蛋白质的含量平均达 但是稻米的垩白率高达 严重影响了稻米的商品品质，使改良的水稻难以在生产中推广应用。 20 世纪后半叶， 随着分子生物学、植物营养学、 组技术、水稻组织培养及水稻转化技术的迅猛发展，基因工程为改善水稻品质开辟了一条新途径。利用基因工程途径改良水稻被证明是一种有力而独特的手段，在一定程度上补充或改进了传统的育 种方法。中国农业科学院硕士学位论文 第 1 章 文献综述 2 加稻米中赖氨酸和蛋白质的含量 稻米蛋白质含量愈高，其营养价值也愈高，但是稻米蛋白质含量与稻米的食味品质呈一定程度的负相关。因此对于食用米而言，营养品质改良应侧重于提高稻米蛋白质中的赖氨酸含量。饲料用米改良则应侧重于最大限度地提高稻米中的蛋白质含量。利用基因工程改变种子贮藏蛋白质基因使其产生改进的氨基酸组成，将改良的贮藏蛋白质基因导入受体植物，或将自然界植物体内分子量较小且富含赖氨酸的蛋白质基因导入水稻，使其稳定遗传和表达，提高稻米中的赖氨酸含量。由于豆类种子蛋白质中赖氨酸的含量较高，含硫氨基酸 的含量偏低，与水稻蛋白质中的氨基酸成分在营养上具有互补性，因此 如果把 豆类蛋白质基因转入水稻中 将可以 改良其营养品质。 1995 年 )将人工改造的水稻储藏蛋白基因 富含甲硫氨酸和赖氨酸 )导入水稻中 ,获得了再生植株 ,并发现其能表达 白。 (1999)将大豆球蛋白基因转入水稻，使种子胚乳中的谷蛋白（富含赖氨酸和甲硫氨酸）含量明显提高。高越峰 (2001)将四棱豆高赖氨酸蛋白基因导入水稻后，报告基因（ 根，茎和叶中都能表达且叶片中的赖氨酸含量升高，最 大升幅达 但由于驱动目的基因表达的启动子是非种子特异性启动子，结果仅提高了转基因水稻叶片中的赖氨酸含量，未能达到改良水稻营养品质的目的。995)等通过 导法分别将菜豆和豌豆的球蛋白基因导入水稻中。通过对再生植株的种子进行分析 表明 上述基因已在水稻种子胚乳中表达，其中菜豆球蛋白约占胚乳总蛋白的 4%。 （ 1999 年） 通过电击法将大豆球蛋白基因 (入水稻中，结果表明大豆球蛋白基因已在转基因水稻种子中表达。大豆球蛋白的量约占种子蛋白量的 4% 5%，达 40 50mg/基因水稻种子中蛋白含量 (g)比对照 (g/g)高约 20%，转基因水稻种子中几乎所有的氨基酸包括赖氨酸均比对照高出 20%，并且稻米中维生素 含量 (g/g)比对照(g/g)高出 50%，而其他性状如稻米的外形、矿物质含量则没有改变。通过导入水稻过敏蛋白的反义基因，降低水稻种子中过敏蛋白的含量，改善水稻的营养品质。 (1996 年 )利用对大米过敏病人的抗体 稻米中分离出过敏性蛋白质，进而在 库中分离出相应的基因序列，利用反 义 理构造了一个嵌合基因，通过电击法将其导入水稻中。通过对再生植株种子进行分析，非转基因对照的种子中过敏性蛋白含量约为 300g/粒，转基因水稻种子中过敏性蛋白含量约为 60 70g/粒，表明在种子成熟过程中过敏性蛋白的合成通过反义 术得到了抑制。 加稻米中维生素的含量 将维生素合成代谢的关键酶导入水稻，使其在胚乳中特异表达，以提 高其在胚乳中的含量。 (1997 年 )利用基因枪法将一个维生素原合成的关键酶 八氢番茄红素合成酶导入水稻中。 结果表明 在转基因水稻种子的胚乳中 有八氢番茄红素。瑞士植物研究所 000年 )等利用农杆菌介导法将维生素 A 原 (合成途径的 3 个关键酶：八氢番茄红素合成酶 (细菌八氢番茄红素去饱和酶 (番茄红素 时导入水稻中。 观 测 发现转基因水稻种子胚乳呈黄色 ，有 类胡萝卜素 的积累 ，部分种子高达 g。 该 工作首次 利用 植中国农业科学院硕士学位论文 第 1 章 文献综述 3 物基因工程 手段 使水稻种子产生本不存在的类胡萝卜素，为作物营养品质改良提供了一个良好的范例。 加稻米中微量矿质营养元素铁的含量 将含铁量高的外源蛋白 （如 与铁的吸收和转运有关的蛋白质和酶 ） 基因导 入 水稻，使其在胚乳中表达， 以 提高稻米中的铁含量。 （ 1999） 通过农杆菌介导法将大豆铁蛋白基因转入 水稻， 并 对转基因种子原位免疫印迹 测定后发现 ，该基因在水稻胚乳中得到了表达。分析 果 表明转基因水稻种子中铁平均含量为 (g/g 高达 (g/g，为对照种子铁含量的 3 倍。 豆种子贮藏蛋白研究进展 种子贮藏蛋白根据它在不同溶剂中的溶解度不同可分为四类：清蛋白（ 球蛋白（ 谷蛋白（ 醇溶蛋白（ 1924）。 豆种子贮藏蛋白的理化特性 大豆蛋白质的功能性，主要来源于大豆球蛋白。大豆球蛋白含量高，具有良好的保水性、乳化性、粘结性、凝胶形成性、粘弹性、薄膜形成性、吸油性、热稳定性、聚合和析离作用等功能特性。大豆球蛋白中以 11S 和 7S 为主。 11S 球蛋白和 7S 球蛋白在氨基酸组成、分子量大小等方面不同。 11S 球蛋白比 7S 球蛋白的二硫键多，凝胶形成速度快（ 1993），硬度大。其凝胶形成的温度分别为 80和 90，因此 11S 球蛋白具有更强的热稳定性 (990)。随二硫键的增多，发泡性增高（刘珊珊等 2002）。 豆种子贮藏蛋白的合成 大豆种子贮藏蛋白主要在发育的大豆子叶中合成，并以蛋白体形式沉积。通常 7S 蛋白在花后 15- 20 天开始合成，与此同时或 3- 5 天后 11S 蛋白才开始积累。 11S 和 7S 蛋白首先在粗面内质网中合成，其中 11S 蛋白的 m 导合成一个含有信号肽 的 60体，进入粗面内质网内腔后， 7S 蛋白进行糖基化，而 11S 蛋白不进行糖基化；此后， 7S 和 11S 蛋白通过液泡膜进入液泡，同时大液泡通过液泡膜分隔 、一些部位的缢缩和出芽三种方式形成小液泡。 在液泡中， 11S 蛋白前体分解为酸性多肽和碱性多肽，然后酸性多肽和碱性多肽结合成为 11S 蛋白质分子，最后 11S 蛋白和糖基化的 7S 蛋白结合在同一个蛋白体中。 ( 1981) 通过 交的结果表明：大豆种子贮藏蛋白基因的表达具有时空特异性。 豆种子贮藏蛋白的分类 大豆种子贮藏蛋白中以球蛋白为主，主要包括豆球蛋白 ( 称大豆球蛋白 ( 豌豆球蛋白 ( 称伴 大豆球蛋白 ( 类，其沉降系数分别为 11S 和 7S，所以又被分别称为 11S 蛋白和 7S 蛋白，这两种蛋白共占种子蛋白总量的 70%，是大豆种子贮藏蛋白的主要成分。此外，在大豆及其它豆类种子中 2S 蛋白和 15S 球蛋白。 11S 球蛋白 中国农业科学院硕士学位论文 第 1 章 文献综述 4 11S 蛋白包括酸性和碱性两类亚基，其数目不等。 ( 1976 )报道至少有 4 种不同的碱性亚基 ( 2)和酸性亚基 ( 4)， 2:4 为 1:1:2:2， 2:4 为 1:1:2:2。而 1975)发现 11S 蛋白有 12 个亚基，在电镜下看到它包装成两个六边形的柱状扁圆体。979)报道 11球蛋白酸性亚基有 6 种， 子量为 45K， 子量为 38 40K， 为 10K。 7S 球蛋白 许多研究表明， 7球蛋白也是有若干亚基组成，亚基的数目及分子量，不同的研究者报道不一致。 984)等发现 7球蛋白至少有 6 种亚基组成，主要亚基为、和 3 种。 豆种子贮藏蛋白的特点和基因结构 大豆种子中，贮藏蛋白主要包装在 2S， 7S 和 11S 三种复合体中。 7S 和 11S 都由被称为亚基的多条不同的多肽组成，用 法可分辨出来。 11S 由 4 个酸性亚基（ 3、 分子数比为 1 1 2 2）和 4 个碱性亚基（ 分子数比也为 1 1 2 2）组成。 7S 蛋白的分子量为 15 000 17 000，由三个亚基（ 76，(83 (53成。 豆球蛋白由 8 个基因编码。它含有 3 个内含子（ 其中 2 个内含子存在于豆球蛋白亚基编码区， 88；另一个内含子存在于豆球蛋白亚基编码区，长 99 豆种子贮藏蛋白基因表达调控的研究方法 近年来，有关大豆 种子贮藏蛋白基因表达调控的研究正越来越受到重视，所用的研究方法主要有三种。 (1) 通过导入外源基因来研究基因表达的特异性 将植物的基因导入异种植物后，基因表达的方式依然不变（林忠平和尹光初， 1983）。种子贮藏蛋白也遵循这一规律。据报道 7S 蛋白的基因能够在转基因烟草的种子中特异表达。 (2) 通过缺失突变来研究与基因表