【毕业学位论文】（Word原稿）棉花CuZn-SOD基因的克隆与表达的初步研究作物遗传育种博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士 学位论文 棉花 的初步研究 on of in I on of in 要 短季棉 的早熟早衰问题严重影响棉花的产量和品质；目前短季棉早熟早衰问题，在生理生化水平已经作了比较详细的研究，已有的结果显示：早熟不早衰品种和早熟早衰品种相比，它们的抗氧化酶活性后期表现高、稳定，主要起作用的关键酶是 此，进一步从分子水平 揭示早熟早衰的分子机制，克隆相关基因并进行有关研究是非常必要的，对于提高短季棉产量、品质具有重要的意义。 以短季棉早熟不早衰品种中棉所 36 真叶为材料，对其进行伤诱导和高温处理，然后提取总 到 处理叶片的 模板，利用 术，克隆了在棉花 活中占比例最大的 n 因（约占 86），该基因包括两个：叶绿体 n 因和胞质 n 因。其中叶绿体 n 因的注册号为 因序列长度 1043含一个 645开放阅读框，起始于 98 位终止于 745 位，编码 215 个氨基酸。在棉花基因中是两个拷贝，棉花叶绿体 n 白与其它植物的叶绿体 n 白的氨基酸同源性 81。棉花叶绿体 n 白质的分子量为 电点为 蛋白质具有两个酶活性中心，位于叶绿体的基质中，是个球蛋白。胞质 n 因的注册号为因序列长度 682含一个 456开放阅读框，起始于 120 位终止于 578 位，编码 152个氨 基酸。在棉花基因中是一个拷贝，棉花胞质 n 白与其它植物的胞质 n 白的氨基酸同源性为 81 87。棉花叶绿体 n 白质的分子量为 电点为 蛋白质具有两个酶活性中心，位于细胞质中，是个球蛋白。 基因表达分析表明：叶绿体 n 因在幼嫩的茎、花中有微量的表达，在叶片中高效表达；在中棉所 36 的苗期、始花期、盛花期、铃期和吐絮期分别采真叶提取 测叶绿体n 因的表达结果显示：基因在 苗期表达较低，到初花期到达最高，然后表达量下降。 胞质 n 因表达活性在根中最高，其次为叶片，下胚轴，花和茎的表达较弱。说明胞质 n 因主要在根和叶片中表达；在整个棉花生育期中呈现有规律的动态变化，从苗期开始基因表达逐渐增强，到盛花期达到顶峰，以后逐渐下降；但是从整个生育期观察，后期的活性比前期高。 棉花叶绿体 n 因的原核表达检测：在基因的起始密码子和终止子处设计一对引物，以 模板扩增得到完整的基因全长，然后，构建中间重组子 构建原核表达载体 导表达 结果显示转化菌株比对照组 活增高 17，显示表达产物具有 棉花叶绿体 n 因的植物转化载体的构建：在基因的起始密码子和终止子处设计一对引物，以 模板扩增得到完整的基因全长，构建中间重组子 后，再构建植物转化载体 酶切及 测均证实载体构建正确。 关键词：短季棉，早熟不早衰，超氧化物歧化酶，原核表达，植物遗传转 化 he of on in in Up to of in on of of of in if we to it is of us to is is NA u/OD by of of in 6%). of u/OD u/OD of u/OD of 043bp,a 458 45， 15 in u/OD 81 in of u/OD of in a of u/OD of 82bp,a 5620 76， 52 in u/OD 1 87 in of u/OD of in be a of u/OD u/OD in in of in in u/OD in by at u/OD at in in of u/OD in a of in of by ， to to of 7% of u/OD a of in of by to to by CR 文缩略 表 英文 缩写 英文全称 中文名称 n 铜锌超氧化物歧化酶 of 端快速扩增技术 异丙醇 互补 焦碳酸二乙酯 大肠杆菌 卡那霉素 千道尔顿 反转录聚合酶链反应 标准柠檬酸盐缓冲液 非编码区 5 543 V 氨卞青霉素抗性 超纯水 碱基对 脱氧核糖核酸 核糖核 酸 开放阅读框 十二烷基磺酸钠 溴化乙锭 g 克 光密度 每分钟转速 聚合酶链式反应 三羟甲基氨基甲烷 过氧化物酶 过氧化氢酶 氮蓝四唑 I 目 录 第一章 文献综述 . 1 棉花早熟性及早熟不早衰相关的研究概况 . 1 熟性的标记指标方面 . 1 花早熟性的生理测定指标 . 1 熟棉早熟性构成因素的遗传规律的研究 . 2 花早熟不早衰生理生化机制的研究 . 3 关早熟性的基因控制方面的研究 . 3 . 3 . 3 . 7 内外植物超氧化物歧化酶的研究进展 . 10 . 10 . 12 前常用的基因克隆的技术方法 . 12 因芯片技术分离目的基因 . 12 因文库技术分离目的基因 . 13 能蛋白组分离目的基因 . 13 . 13 别显示技术分离差别表达基因 . 13 入突变分离克隆目的基因 . 14 位克隆目的基因 . 14 母双杂交系统分离克隆基因 . 14 物信息学在分离克隆基因中的应用 . 14 . 15 因分离克隆的新技术 . 15 前国内外克隆其它植物超氧化物歧化酶基因的常用方法 . 15 . 16 第二章 棉花超氧化物歧化酶基因的克隆和表达分析 . 17 . 17 材料 . 17 株和质粒 . 17 和生化试剂 . 17 验方法 . 18 . 18 . 19 花 . 20 花 析 . 28 因的表达分析 . 30 花 息学分析 . 31 . 31 棉花 . 31 花 分析 . 32 花叶绿体 . 35 花 n 析 . 42 u/. 44 u/. 46 花叶绿体 n u/同源性比较 . 51 . 52 u/因的克隆和分析 . 52 u/蛋白与植物的活性氧自由基清除 . 53 花叶绿体与胞质 n 蛋白的进化关系 . 54 花叶绿体与胞质 n 因的表达与酶活变化 . 54 第三章 棉花 表达检测 . 55 . 55 . 55 . 55 . 56 u/. 57 达载体 和目标基因的连接 . 58 因表达蛋白的电泳检测 . 59 . 60 果与分 析 . 60 花叶绿体 n . 60 花叶绿体 n . 61 论 . 63 花叶绿体 n . 63 花叶绿体 n . 63 第四章 棉花铜锌超氧化物歧化酶基因的植物表达载体的构建 . 65 料 . 65 法 . 65 . 65 . 66 物表达载体的构建及筛选 . 67 果与分析 . 68 . 68 . 68 论 . 69 第五章 结论 . 70 论 . 70 一步工作的设想 . 71 致 谢 . 72 参考文献： . 73 附录 . 81 作者简介 . 105中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 棉花早熟性及早熟不早衰相关的研究概况 棉花的早熟性是由诸多生育、形态性状构成的复杂的综合性状；如：棉花的生长发育速度、品种各生育期（苗期、蕾期、铃期）的长短、植株形态（株高、第一果枝节位高低、果枝和果枝节间长短）以及开花、吐絮的速率等。研究认为棉花的早熟性受遗传因素的控制和环境的影响；目前，国内外棉花早熟性的研究主要集中在四个方面的研究上。 熟性的标记指标方面 国外最早见于 （ 1962）认为从棉花的全生育期考虑，将 从 播种到现蕾、开花、吐絮的天数作为评价早熟性的标记； （ 1965）建议评价指标还应加上垂直和水平开花的间隔时间，后来经过 （ 1966） 969)、 971)、 1973)、的不断补充，981)总结形成了包括 12 项指标的综合测定方法；但主要是始花期和第一果枝节位。在国内，杨中旭等（ 1997）总结出一套棉花早熟性的综合标准分数， 主要考虑霜前皮棉产量、霜前花率和全生育期的天数；喻树迅等（ 2003）总结前人的结果，认为客观评价棉花早熟性的标准主要有六项：吐絮期、生育期、 第一、二 次收花量占总收花量的百分率、霜前花百分率、平均成熟期和生产率指数。 花早熟性的生理测定指标 棉花早熟性的形态指标无疑受到环境因素的巨大影响，但其基础无疑是特殊类型的新陈代谢的作用结果； （ 1973）发现，早熟性受光合效率的影响，即光合效率的提 高有助于棉花早熟。自七十年代初，美国开始注重早熟生理方面的研究。 在我国， 1979 年棉花专家 李玉才就已进行早熟生理的探讨；随着早熟棉的发展，国内学者（潘家驹 1979、葛知男 1980、林昕 1983、陈仲方 1989、潘学标 1989、喻树迅 1990 等）开始逐步研究早熟棉的生理生化特征，形成早熟棉的生理生化指标特征，主要表现为早熟棉果枝节位发生率高，出叶速度快，叶面积增长峰突出；光合效率高，光合产物形成集中；生理代谢旺盛期与高能期同步。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 2 熟棉早熟性构成因素的遗传规律的研究 目前有关棉花早熟性的遗传研究涉及早熟性的构成因素已达 1518 个性状（田箐化 1983 1985）这些性状大多属于数量性状，研究的方式主要集中在不同性状间的遗传相关分析、配合力的测定以及遗传模型的建立。 传相关分析 遗传相关分析能真实地反映不同性状间的关系，为我们 在 早熟性的 研究中 提供理论依据，因此历来倍受育种家的重视；潘家驹（ 1979）为发掘早期世代或生育前期 和 产量与早熟性的关系，寻找有效的生理指标；研究 了陆地棉品种七十对性状之间的表型相关、遗传相关和环境相关 ，指出棉苗出叶与霜前花产量、霜前花百分率、单株总籽棉产量、阶段生育期与霜前花百分率和单铃重量等具有遗传 负 相关，并且两者的遗 传力比较高，可作为选择早熟、丰产类型的生理指标；潘家驹还指出子叶面积与早熟性状及纤维品质都呈正相关（绒长除外）。喻树迅等（ 1990）通过对 5个推广短季棉品种 9 个生育性状的遗传分析 认为 ：苗期、蕾期、铃期、第一果枝节位和株