【毕业学位论文】（Word原稿）玉米耐旱主效QTL定位与候选基因鉴定作物遗传育种博士论文

i 密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 玉米耐旱主效 位与候选基因鉴定 o.: 要 玉米（ .）是重要的粮 、经、 饲作物。 但是，在干旱与半干旱地区，水资源短缺一直制约着玉米产量的 进一步提高。近些年，随着分子生物学技术在作物遗传育种领域 的 广泛应用，尤其是通过分子标记技术和分子生物统计方法相结合，对数量性状位点 （ 行了大量 定位研究，为突破常规耐旱育种模式，探讨玉米耐旱的遗传机制和作用方式提供了新的思路。 通过 进一步 对 位方法的优化组合和定位结果的筛选验证，并且与 功能基因组学 技术和比较基因组学手段相结合，探讨与植物耐旱性相关的功能基因，为揭示玉米耐旱遗传机理提供契机，从而为耐旱遗传研究与标记辅助育种奠定初步的基础。 在本研究中，利用 子标记对 内耐旱玉米自交系 )耐旱自交系 )杂交后获得的 234 个 株进行标记 分析 ， 采用 图函数进行重组率转换和件进行误差检测， 构建 了 玉米 记框架连锁图谱和 相对 饱和的遗传连锁图谱，为以后的耐旱 位研究奠定基础。随后， 在 体中套袋 姊妹 交获得相应的 家系，在田间进行耐旱表型鉴定 ， 分别于 2002 年山西临汾、 2003 年山西临汾和 2003 年海南三亚在干旱胁迫（ 灌溉处理（ 件下对 家系的雌雄开花间隔 (结穗率 (籽粒产量 (行田间表型鉴定。根据测定结果，采用 件的区间作图法和件的复 合区间作图法以及 件的两两位点互作方差分析法 ，对影响玉米耐旱性的 行定位与分析。最后，与参考文献中对玉米耐旱 位的资料相整合，初步确定玉米耐旱性的主效 为 进一步了解 耐旱基因 的表达模式和作用方式，以及最终实现 用 旱差异表达序列 。本文还采用比较基因组方法，利 用玉米和水稻在标记水平上的同源性，对部分耐旱表达差异序列进行了 初步的遗传定位， 以 发掘玉米耐旱的功能候选基因 ， 主要获得以下结果： 1. 将 值设定在 5 以上，使用 135 个在两个亲本之间表现多态性的 记，对 234个 株进行基因型测定， 继而用 其中的 130 个 记 优先构建了玉米的高精度遗传框架连锁图谱。框架图谱全长为 记之间平均遗传距离是 后在 值 降 为3 的情况下 ， 增加 119 个显性的 记 ，构建了玉米的饱和遗传连锁图谱。增加 记位点以后的图谱全长为 记间平均遗传距离为 记之间平均遗传距离小于20 达 ， 该相对饱和的遗传图谱为玉米遗传研究与耐旱 定位奠定了基础。在对标记进行遗传分析的过程中，观察到某些分子标记发生了偏分离，在染色体 1、 2、 5、 8、 10 上找到了一些偏分离热点区域。同时，在对 记位点定位过程中，提出并讨论了一种使 在标记辅助育种上扩大应用 记提供了一种新思路。 2. 对 234 个 家系和两个亲本在三个地点、两种水分处理条件下的雌雄开花间隔（ 结穗率 (籽粒产量 (观察值进行统计分析，发现各性状在不同的环境条件下都表现出较好的一致性，耐旱亲本 干 旱胁迫下的表现优于另一个亲本 说明观察数据的真实可用。从各个性状在不同环境条件下的最大值、最小值和两个亲本之间的比较来看，后代群体出 超亲分离，群体内各家系之间出现较大变异。各个性状在 的相关性都达到了极显著水平，而且不同性状在不同地点也达到了显著或极显著的水平。性状的方差分析表明，群体不同家系之间、不同地点之间的差异均达到极显著水平，不同处理之间的差异达到了显著或极显著水平，群体的家系与地点，以及地点与处理之间的互作在三个性状上都达到极显著水平，适合对 行定位研究。 3. 以三个地点 的产量作为模式性状， 基于同一作图群体，利用框架连锁图和饱和图谱 分析标记密度对 图的影响。 结果显示增加图谱密度以后，检测出的 目增多，用 架连锁图谱找到的 目明显少于加密以后的图谱。因此，适当地增加标记密度，即增加遗传连锁图谱对基因组的最大代表性，可以提高 位的精确度。同时，针对 位方法的统计局限性，在进行标记筛选的过程中，能使标记更均衡地分布在染色体上，因而可以增加 4. 利用区间作图法对三个性状的 行分析，在三个地点总共找到 45 个相关 别位于玉米的第 1、 2、 3、 5、 6、 7、 8、 9 染色体上。 用 复合区间作图法共找到 65 个 别位于除第 7 和第 10 染色体的其余染色体上 ， 其中有 30 个是在干旱胁迫条件下找到的 ，且 不同性状的 用方式不同。本研究检测到的与性状 关的 要是以部分显性为主，而 以超显性效应居多。总体 上，检测到的 部分显性、显性和超显性 作用方式为主。单个 释的表型变异率在 - 间， 其中解释表型变异最大的 2002年在山西临汾干旱胁迫条件下检测到的 1 个与结穗率相关的 于玉米第 9 染色体上 的 标记近 。两种方法的定位结果显示，在玉米的第 1、 3、 9 染色体上检测到三个性状的 。综合分析结果显示，在玉米第 1 染色体的标记 近 可能存在一个与胁迫诱导相关的 在 第 9 染色体的 标记 近可能存在与耐旱性状紧密相关的一个 基因簇。 两两位点互作分析 表明 ， 2003 年在山西临汾的结穗率 第 1 染色体的标记 第 3 染色体的 间有互作，而且与其 它 性状以及另外一个主效 间没有发现显著的互作关系。通过与参考 文献中对玉米耐旱 定位结果相整合，得出一致性 结果 ，说明在玉米的第 1（ 第 9（ 色体上确实存在与玉米耐旱高度相关的主效 此 ， 与 两个 密连锁的标记 以用作耐旱育种的标记辅助选择依据。 5. 通过增加主效 近染色体区段的标记密度，结果表明，增加标记后在第 1 和第 9 染色体上的 应值变大，而且以下降 2 个 所定义的 信区间来看，明显比以前缩小。因此，对主效 在的区间适当加密，不仅可以提高 位的准确性，而且 还可以验证 用 将来开发出的来源于耐旱差异表达序列的标记，可能更准确地定位主效 段，这 对于 隆以及了解耐旱机制都是非常有用的。 6. 采用 术研究群体的两个亲本在干旱胁迫和正常灌溉条件下的基因表达方式，发掘了 79 个与耐旱性相关的 中大多数序列与玉米耐逆性存在着不同程度的同源性，因此可以用来确定 来源和研究玉米的胁迫表达。通过玉米和水稻的基因组学研究，对部分序列在玉米染色体上的位置进行了初步定位。其中定位在第 1 和第 9 染色体上的序列可能与本研究发现的耐旱主效 表达有关。因此，其表达模式及序列全长是下一步工作的目标。 7. 构建的玉米遗传连锁图谱将用于后续的其它研究 ， 分析得到的耐旱相关 用于 键词 ： 玉米（ .），耐旱性， 选基因， .) is an in to in in TL it is to TL by be to of in In to OD .0 A SR an on NA 34 F2 178 73. on 2:3 002 003, as as in TL by of of a of at 建了一个包含有 130 个 玉米遗传连锁框架图（ et 1993a）。其中有 5 个标记因为没有与其它标记连锁而未做到遗传图 谱上。在此图的基础上，采用 和 双 引物 术，增加 态性位点 ，以 对该图谱上的遗传距离较大的区间进行适当的加密。 程参照 （ 1995）文章，所有程序都对其过程进行了一定的优化。具体的实验流程如下： （ 1） 基因组 提取、纯化和检测 在亲本和 株长到 9叶时，分别剪取叶片。 按照取样原则选取亲本和每个单株叶片各 3 5g，放入研钵中。 在液氮下迅速磨成粉末，将粉末 转入 50心管中，加入 155预热的冲液（ 140 700 100 50 1% 巯基乙醇，现用现配），用玻璃棒搅拌使其混匀。 在 65下水浴加热 隔 20右摇匀一次。水浴后，取出 心管，冷却至室温。 在通风橱加入 10仿 :异戊醇（ 24:1），轻轻倒转摇动 10 3000 40001300 1500 g）离心 10上清液转至另一新的 50心管。 加入 20L 溶液（ 10mg/室温下或 37下温浴 1h。 重复 4骤，进一步纯化，以提高 度。 加入 3020预冷无水乙醇，轻轻混匀。 箱静置 30 ，至 集，室温下用玻璃钩取出 放于事先加入 10%乙醇的 中，室温下洗涤 20涤完毕后，转入另一 中，将 空抽干。 加入 1 10 溶解 4下保存备用。 用紫外分光光度计（ 测定 度，一部分 浓度调至 20一部分 00 100 脂糖凝胶电泳检测质量，其余 存备用。 (2) 记分析 物序列由上海 生工生 物工程 有限公司合成 , 参照 验手册（ 1998）中的 合本实验室的仪器设备，对 增体系、热反应程序、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染程序等流程进行优化组装，建立 记优化检测技术。 增体系 反应体系： 反应总体积为 10L，组分配制如下： 组分 浓度 积 国农业科学院博士学位论文 第二章 玉米饱和遗传连锁图谱的构建及相关标记特征 35 10 20 1 1L 25 250 引物 (20 (2U/L)(鼎国公司 ) 10L) 25 反应液上加盖 15L 矿物油（ 以防止反应过程中水分蒸发。 应热程序： 增反应在 （ 进行。热循环反应程序如下： 94 2 60 30s 72 50s 94 50s 60 30s 72 50s 40 72 5 4 12h 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 仪器： 电泳系统 (北京六一仪器厂 ) 胶型： 3830 凝胶： 丙烯酰胺变性凝胶 电泳程序如下： 清洗玻璃板：用自来水沾上洗涤剂将玻璃板反复擦洗，再用 95%酒精擦洗两遍，自然干燥。在玻璃板上涂 ，主板上涂 0.5 2%)。操作过程中防止两块板互相污染。 组装电泳槽：待玻璃板干燥后组装电泳槽，用水平仪校平。 凝胶制备如下： 组分 浓度 积 605% 27g 10 60% L/0L 25%L/0L *40% 190 g 10 g 水稀释至 500 4贮存备用。 10 第二章 玉米饱和遗传连锁图谱的构建及相关标记特征 36 的配制是： 108g; 55g; 37定容至 1L。 25% 灌胶：用干净的塑料瓶装凝胶液，然后由电泳槽上部轻轻灌胶，防止出现气泡。待胶流至胶板底部时，在上部轻轻插入梳子，然后使其凝聚至少 1h。 预电泳：取 1800 冲液，其中 800 入正极槽中， 1000 热至 65，加入负极槽，拔出梳子。在 85W 恒功率下预电泳 30温度达到 50。 变性：在 10L 增产物中加入 5L 3 制方法如下 )， 混匀后，在 95变性 5即放至冰上冷却 10上，放入 冰箱效果更好。 3 组成： 组分 浓度 积 00% 甲酰胺） 98% 49 100 1酚蓝） 二甲苯氰） 电泳：用吸球吹吸加样槽，清除残胶和气泡，插入样品梳子，每一个加样孔点入 4L 样品（分子量标准为 在 70W 恒功率下电泳约 40泳结束后，小心分开两块玻璃板，胶会紧贴在涂 玻璃板上。 银染程序 固定：将凝胶板置于 酸溶液 (10%)中，轻轻摇荡 5 漂洗：用 蒸水漂洗 3 染色：在 1L 新配的染色 液中 (1g 7%甲醛 )，摇荡 10 漂洗：用 1L 双蒸水漂洗，时间不超过 10s。 显影：在 1L 显影液 (30g 无水 提前 5 h 配制，置于 4冰箱中预冷； 200 L 1%7%甲醛 ) 中轻轻摇荡，至带纹出现。 定影：在 1L 10%醋酸溶液中定影 2 漂洗：用 1L 双蒸水漂洗 2 干胶：室温下晾干。 扩增带型统计 在白炽灯下读取电泳胶板上的扩增片段，在相同迁移率位置上，以 A、 B 和 H 统计。每对物检测一个基因座，每对多态性带为一 对 等位基因，将所观测到的每一条带视为一个性状，亲本 型记为“ A”，亲本 型记为“ B” , 杂合带型记为“ H”。 (2) 记分析 内切酶接头与引物准备 本实验中引物所用的组合是 六个碱基引物位点） 和 个碱基 引物 位点）。 引物 位点 : 5 T3 3 5 物 位点 : 5 3 中国农业科学院博士学位论文 第二章 玉米饱和遗传连锁图谱的构建及相关标记特征 37 3 G5 头序列 : 5 3 3 5 头序列 : 5 3 3 T 5 内切酶接头合成以后取等量混合， 95加热 5室温慢慢冷却，直至两个接头退火结合。 物是根据接头序列和 引物 位点设计的，如下所示： 扩引物 ： 5 3 扩引物： 5 3 扩引物： 5 扩引物： 5 或 扩引物： 5 “ N” 指选择性碱基，可以是四种碱基中的任意一个。 物 连接反应体系 :反应总体积为 25L，组分配制符合如下： 组分 浓度 积 10 100 100 ) 0) 2 U/L)( 20U/L)( 10U/L) ( 200L L） 600L 配制好的混合液 37（ 置 7 然后作为预扩增程序的模板。 扩增反应体系 :反应总体积为 20L，组分配制 应符合如下 : 组分 浓度 积 10 25 5mM 扩引物 (50L) L 扩引物 (50L) L U/L)(1U 引物连接反应产物 2L 预扩增产物用 释 20 倍，稀释后的产物作为选扩的模板。 中国农业科学院博士学位论文 第二章 玉米饱和遗传连锁图谱的构建及相关标记特征 38 扩反应体系 :反应体积为 10L，组分配制应符合如下： 组分 浓度 积 10 20 1 25 扩引物 (50L) 2.5 L 扩引物 (50L) 2.5 L U/L)(鼎国 ) 预扩稀释后产物 扩增 应程序如下： 94 5 94 40s 56 30s 72 80s 34 72 7 4 12h 扩 应程序如下： 94 5 94 30s 65 30s 80s 12 94 30s 56 30s 72 80s 23 72 7 4 12h 电泳和银染过程如 析流程 电泳时需要注意在 50W 恒功率下电泳约 90右。 带型统计 对于 记，多态性条带依显性遗传方式记载，有带记为 1，无带记为 0，然后形成数据矩阵，转换成软件 格式 (et 1987)。 记的命名 中国农业科学院博士学位论文 第二章 玉米饱和遗传连锁图谱的构建及相关标记特征 39 在本实验中 记的命名规则参照 1999）文献。字母 P 代表内切酶 字母 M 代表内切酶 母后的数字代表相应的 物组合编码，不同编码的引物组合在其选择性碱基上的差异见表 2 1， -后面的三位数字代表 物多态性位点的分子片段大小（ (2) 图谱构建方法 使用 件对标记数据进行连锁分析。通过两点测验， 值定为 5，采用 数转换遗传距离，最大遗传距离定位为 50先用 记位点构建玉米遗传框架图谱。操作步骤简单介绍如下：分子标记的记录采用 件的要求，用“ A”表示母本 纯合带型；“ B”表示父本 纯合带型 ；“ H”表示两个亲本的杂合带型。首先按软件要求调入数据，然后是“ 令对所有的标记位点进行统计；接下来用“ 令（ 0标记进行分组；分组后分别对每组标记用“ 令进行自动排序，对于无法自动排序的 行手工排序，即先选择 6 7 个标记用“ 令进行比较排序，选定最好的一组序列，用“ 令把该组剩余的标记逐一添加到该序列中去，最后使用 图函数和误差检测，用“ 令确定标记之间的遗传距离。然后把 同样的方法尽可能把更多的 点定位到遗传连锁图上。标记的偏分离进行检测和标记位点相似性分析 (1993； 2001)。 果与分析 记的多态性统计 从 356 对 物 中筛选出在两个亲本间存在多态性 (图 2且扩增条带清晰的 135 对 引物，占总数的 每对 物 在亲本间 扩增出一个多态性位点，多态性条带的大小从 2000等。为获得相对饱 和的遗传连锁图谱，又选择了 13 对 物组合对 记构建的遗传框架图谱加密（图 2本实验中选用的 物组合及其选择性碱基，每个 态性以及分布的染色体位置列在表 2 从表中看出， 记。平均每个 物 组合扩增出 10 多个从 60 650等的多态性位点。从所有 物 组合扩增的总带数来看，其中具有多态性的条带数占扩增的总条带数的 对于单个 物 组合来讲，多态性最低的是组合 54（ ，最高的是组合 22，达到 这说明 物 组合 22 的多态性比较高，可能与其扩增引物两个选择性碱基有关。 中国农业科学院博士学位论文 第二章 玉米饱和遗传连锁图谱的构建及相关标记特征 40 图 2物 亲本和部分 of 2 SR ： A:亲本 带型； B：亲本 带型； F:杂合体的带型；数字 1 26:代表 图 2物组合 亲本和部分 of 2 66 偏分离的统计分析 在本实 验中，由于 基于共显性分析，而 基于显性分析记录数据的，所以标记的偏分离检测分别是在 5的水平 上 检验 否 符合 1:2:1和 否 符合 3:1的比率。实 验结果显示，在所检测的 267 个分子标记中（其中 135 个 记， 132 个 记位点） ， 有 标记在群体中表现偏分离，其中包括 点和 记与 记的偏分离所占的比率基本 相同 。 图 2注出偏分离的标记位点。从图中看出，虽然偏分离位点在玉米的十条染色体上均有分布，但是在染色体上的分布还是不太均匀，大 多数偏分离标记位点分布在着丝点附近，而且这些偏分离的位点比较倾向于某一集中区域和某一个亲本。如在第 1、 2、 5、 8 和 10 染色体上就分别存在一个偏分离的热点区域，这些染色体上的偏分离标记位点占总偏分离标记位点数的 它们在第 1、 2、 5 和 10 染色体上表现的偏分离倾向于亲本 在第 8 染色体上的那个偏分离热点区段倾向于 表明两个亲本在 体的单株中所占的比例可能不一样，两个亲本染色体发生重组时，来源于父本 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 15 1 6 17 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 24 2 5 2 6 X 1 7 8 B 7 3A 8 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 1 2 13 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 6多态性带 中国农业科学院博士学位论文 第二章 玉米饱和遗传连锁图谱的构建及相关标记特征 41 表 2 1 选用的 物组合的选择性碱基，扩增带数，多态性统计和染色体分布 1 of 选择性碱基3增带数 多态性带数 多态性%) 染色体分布 51 1 8 , 4 52 9 12 , 3, 4, 5, 6, 7, 10 53 2 9 , 5, 6, 8, 9 54 7 7 , 4 46 3 10 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 47 6 8 , 2, 5, 8, 10 48 6 7 , 5, 7, 10 62 7 14 , 2, 3, 6, 8 22 T 63 18 , 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10 36 1 9 , 2, 6, 9 37 0 7 , 2, 3, 4, 38 4 10 , 3, 4, 5, 7, 9 46 0 13 , 2, 3, 4, 5, 6, 8 米遗传连锁图框架和饱和图谱的构建 以 234 个 株为作图群体，采用 图函数以及 (et 1993a)， 135 个 点中的 130 个构建了覆盖玉米 10 条染色体的 77 个 点的框架连锁图谱，其中 5 个标记因为没有与其它标记连锁而未被定位到玉米染色体上。框架图谱全长为 记之间平均遗传距离是 记间最大间隙 连锁群的 间。与玉米的 谱相比较，大多数 记的位点与其位置相一致，不过 位在 近， 位在 些标记经过重复实验结果仍然如此，因此这些差异可能是由于材料的不同或基因型变异误差造成的 ， 但需要进一步验证。为了充分饱和图谱，在 13 个 物组合总共找到 699 条 增条带，其中 132 条在两个亲本间存在多态性 。同样，除了一部分位点可能与其它位点偏离较远而未做 定位 图谱上， 119 个 增位点被定位到了 架连锁图谱上。加入这些 点不仅没有影响原来的 记位点顺序和相对遗传距离，而且还把框架图谱上一些较大的间隔区连接上。例如 架 图谱上的第 5 连锁群 间的遗传距离 最大 变成了 而 隔变成了 555外一个大于 40 间隔区是在第 2 染色体的 间，这两个标记区间将来可能需要增加标记。用 记位点饱和以后的图谱全长为 记间平均遗传距离缩小为 中最长的是第 1 染色体，全长 212.4 最短的是第 10 染色体，全长