【毕业学位论文】（Word原稿）菠萝（台农16号）遗传转化体系的建立以及白藜芦醇合成酶基因转化菠萝的研究生物化学与分子生物学论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 菠萝（台农 16 号）遗传转化体系的建立以及白藜芦醇合成酶基因转化菠萝的研究 .) .) I 摘 要 菠萝 (深受人们喜爱的热带、亚热带四大水果之一。由于用种子繁殖容易产生变异，目前生产上多采用无性繁殖。自上世纪 70 年代组织培养技术开始应用于菠萝以来，菠萝组培再生技术得到了极大发展，菠萝工厂化育苗效率得以大幅提高。转基因技术的发展为培育新的作物品种提供了新的途径，但在菠萝基因工程育种上，菠萝遗传转化效率低下成为制约菠萝基因工程育种的瓶颈，自 2001）首次报道得到抗除草剂转基因菠萝植株以来，该领域的研究进展甚为缓慢。 本论文建立了台农 16 号菠萝的再生和遗传转化体系，并将有望能提高菠萝附加值的白藜芦醇合成酶基因导入该品种，获得了相应的转基因植株。白藜芦醇（ 一种存在于葡萄、花生等少数关联不强的植物的多酚类次生代谢产物，在植物、微生物相互作用中发挥重要的作用。它是由一分子香豆酰 三分子丙二酰 白藜芦醇合成酶（ 催化下缩合而成。 具有一些重要的生物生理活性，如抗氧化活性、植物雌激素活性 等，是一种对人类健康具有重要意义的化合物，在临床上常用于抑癌、抗炎症，预防及治疗高血压、动脉硬化、骨质增生、更年期综合症等。 虽只存在于有 成的植物中，但其 2 种底物广泛存在于各种植物中，且只需一步反应即可合成 此将 因导入异源植物使之表达，从而使该植物获得合成 能力具有很高的可行性。 因在异源植物中表达，一方面有望增强植物抗菌、抗逆境胁迫的能力，另一方面可有效改善植物的品质，提高其附加值。此外，还可以以植物为生物反应器生产 业提供新的原料来源。 本论文通过丛 生芽以及愈伤组织诱导两条途径建立并优化了台农 16 号菠萝的再生体系，确定培养基 为 4 的液体培养为丛生芽扩繁的最佳条件；愈伤组织途径中，菠萝无菌苗叶片诱导愈伤的最佳培养基为， .0 mg/l 2,41.5 mg/l 6 0.1 mg/l 片外植体的最佳苗龄为 7。 本研究构建了分别以潮霉素抗性和 性为选择标记的 因的高效植物表达载体 用农杆菌介导法、基因枪介导法以及超声波介导法导入台农 16 号菠萝。其中，只有基因枪介导法获得了抗性植 株。本研究进一步探讨了基因枪介导法中的各个因素对转化效率的影响。确定叶片外植体的最佳预培养时间为8d；叶片外植体的最佳高渗处理时间为轰击前 2h，而丛生芽外植体的最佳高渗处理时间为轰击前 9h；最优的轰击次数为每皿外植体轰击两次。 经 析检测表明 6 株抗性苗为阳性植株，说明 因已整合到菠萝基因组中。 析检测表明有 2 株菠萝已在 平表达了 因。 关键词 菠萝，白藜芦醇合成酶，基因枪，再生，转化 is of in of of on 970s, in In we of of in It is be in S .0 mg/l 2,41.5 mg/l 6.1 mg/l at To of in a of no be No be in of In of S CR of S in 录 第一章 前言 . 1 萝生物技术研究进展 . 1 萝 . 1 萝再生体系的建立 . 1 萝转化 . 3 景展望 . 3 . 4 藜芦醇的化学结构 . 4 藜芦醇的生物合成 . 4 藜芦醇合成酶转基因研究 . 4 . 6 藜芦醇抑癌作用机 理 . 6 藜芦醇作为植物雌激素 . 7 第二章 材料与方法 . 8 料 . 8 物材料 . 8 株 . 8 粒 . 8 物由上海激康公司合成 . 8 养基 . 8 养条件 . 9 法 . 10 萝再生体系的建立 . 10 本分子生物学实验方法 . 11 肠杆菌感受态 细胞的制备与转化 . 11 杆菌感受态细胞的制备与转化 . 12 粒提取 . 12 段的回收 . 14 切与连接 . 15 提取 . 16 转录 . 16 萝的遗传转化 . 17 定转基因植株的 . 19 基因植株鉴定 . 19 三章 结果与分析 . 21 萝再生体系的建立 . 21 生芽途径 . 21 伤组织途径 . 23 物表达载体 . 25 构建 . 25 物表达载体 构建 . 27 萝的遗传转化 . 29 片预培养时间对基因枪介导法 转化率的影响 . 29 击前干燥处理对转化率的影响 . 30 击次数对叶片外植体转化率的影响 . 31 基 因菠萝的检测 . 31 基因菠萝的 测 . 31 基因菠萝的 测 . 32 . 33 第四章 结 论 . 35 参考文献 . 36 致 谢 . 43 作 者 简 历 . 44 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 6 6 酰丁香酮 苄青霉素 孢霉素 吲哚丁酸 那霉素 养基 S 培养基 萘乙酸 密度 聚合酶链式反应 藜芦醇 福平 糖核酸酶 RS 藜芦醇合成酶 二烷基磺酸钠 羟甲基氨 基甲烷 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 前 言 1 第一章 前言 萝生物技术研究进展 萝 菠萝（ .)是 凤 梨 科 （ 凤 梨 属（ 单子叶、多年生常绿草本植物，是热带、亚热带四大水果之一。菠萝全身都是宝，其果实汁甜味美、营养丰富，可生食亦可加工成果汁、罐头、果脯、菠萝酱等；其植株的叶片、茎、果实的果肉、果皮、冠芽均含有菠萝蛋白酶（ 菠萝蛋白酶是一种重要的植物蛋白酶之一；其叶纤维还可用作编织和造纸等原料，用途广泛。 萝再生体系的建立 织培养 由于种子繁殖容易变异，菠萝在生产上主要 采用无性繁殖。但传统的育苗方法繁殖速度慢，难以满足生产的要求。 20 世纪 70 年代，组织培养技术开始应用于菠萝，这种方法繁殖速度快，不易变异，可提高繁殖系数，大量而迅速地繁殖优良的无性株系，解决了传统方法存在的问题。目前我国对菠萝组织培养方面的报道主要集中在台农四号（剥粒菠萝）等少数几个品种上，而对其他多数优质菠萝就很少有报道。 菠萝的冠芽茎尖、裘芽、吸芽、幼果果肉组织以及植株的茎、叶等都可作为组织培养的材料，现有报道中多以冠芽为外植体，也有报道对这些材料的培养能力进行对比，证实其冠芽茎尖的的再生能力明显优于其 它部位 (李华赐等，1990；何 铁剑等 ， 1994)。组 织培 养上， 菠 萝的再生 途径主 要有 两条，一 是通过愈伤途径诱导再生苗；二是由外植体直接诱导出芽原基，通过丛生芽大量诱导再生苗。前者主要是为遗传转化提供受体材料，而后者主要为了再生出大量组培苗。 伤组织途径 诱导愈伤途径在组培苗快繁中很少用到，这一途径的主要目的是获得愈伤组织，为遗传转化提供受体材料。由于菠萝叶片纤维化程度很高，田间材料灭菌困难 ，并 且幼 嫩叶 片的效 果会 好于 老叶 片，所 以 ,愈伤 组织 诱 导中一 般选 取中国农业科学院硕士学位论文 第一章 前 言 2 幼嫩的无菌苗叶片作为外植体材料（ ， 1998； ， 2003；， 2004），基本培养基 1962），激素用到 22,4（ ， 1995；黄俊生等， 1995；， 1998； ， 2003；李再峰等， 2003）。愈伤组织诱导大约需要 10 周的时间。愈伤组织形成以后，肖兵等（ 1992） 在 其 分化过程中进行细胞学研究，观察到菠萝 愈 伤组织中薄壁细胞随机脱分化形成胚性细胞，胚性细胞经分裂形成两种分生组织 ， 即分生细胞团和分生组织结节，它们可以进一步形成器官原基，分化为芽、根 。 有关菠萝愈伤组织生长分化过程中各激素所起的作用，肖兵等（ 1992）认为， 苄氨基嘌呤 （ 对愈伤组织 向 芽的分化起决定性作用 , 它 能 刺激分生细胞团产生单向极性生长形成芽原基。萘乙酸 （ 则对根的分化起决定性作用。玉米素在有 在 的情况 下 , 能够 加速细胞型分裂和分生组织向芽 原基 的分 化 ； 水 解乳 蛋白 （ 以 促进 芽的 分化 ， 但 却 抑制 维管 组织结节 向根 的转 化 ； 酵 母提 取液 （ 对 两种 分生 组织 的进 一 步分 化都 有抑制作用。 生芽途径 菠萝组培的培养周期比较长，尤其是从外植体诱导发生愈伤组织或者芽原基的阶段。芽的启动一般需要 1月的时间，诱导率在百分之五十左右，有些品种则很低，仅可达到百分之十左右。丛生芽增殖过程相对时间就比较短，且诱导率很高，增殖很快。无菌苗作外植体可使诱导率达到百分之百。一次芽的继代增殖数可达 11（吴俊玲， 1995）。可见，芽的诱导是菠萝再生体系的关键，提高芽的启动率和加快芽的启动速率是急待解决的问题。 在菠萝芽诱导中常用的激素有 62,4（陈健妙等， 2001；罗丽霞等， 2002；白先进等， 2002），也有报道用到 （沈清景等， 1991； ， 2001； 2003）。 6菠萝外植体芽的诱导与增殖过程中的关键，用量在 1l，而 之相配合用量在 mg/l 即可（ ， 1993）。其它激素为非必需，用量在 1 mg/（ 2000）认为，在培养基中添加 500mg/l 左右的水解酪蛋白（ 会提高诱导率。在芽增殖过程中仅 用 1.0 mg/l 6.1 mg/l 可达到很好的效果。在生根壮苗培养阶段，采用 1/2 加 活性炭，也可在此阶段添加 （陈健妙等 2001）。上述培养过程中基本培养基均为 加蔗糖 3培养温度 28 2，光照每天 14强 2000外，在培养基中添加椰乳、香蕉泥、蔬菜汁等对培养物很有帮助。 厂化育苗 液体培养基用于菠萝组培上，有时能收到很好的效果。应用液体浅层静置培养和液体振荡培养（ 100 右）效果明显好于固体培养 （ 李华赐等， 1990；郭建辉等， 1990；庄西卿等， 1991；黄德贵等， 1993） 。很多研究者在研究中中国农业科学院硕士学位论文 第一章 前 言 3 使用临时性浸泡装置（ 收到很好的效果（ 1999； ， 2003），这一装置也被当作反应器应用于菠萝转化（ ， 2002） 。但国内的研究报道中尚未见此类装置的应用。 国内有关菠萝组培的报道以台农四号（剥粒菠萝）的研究报道最多，技术最为成熟。在对该品种进行工厂化育苗中，可以利用井水 代替蒸馏水，食用白糖代替化学纯蔗糖，使生产成本降低一半 （ 李华赐等， 1990； 郭建辉等， 1990；沈清景等， 1991； 庄西卿等， 1991； 黄德贵等， 1993；吴俊玲， 1995；罗丽霞等， 2002）。 萝转化 有关菠萝遗传转化方面的研究在国内还未见报道，国际上的报道也屈指可数。 （ 2001）用基因枪将抗除草剂基因 入菠萝叶片，并获得了抗性植株，成为第一例具有农业用途的菠萝转化报道。报道中所用的受体材料是经微繁获得的泰国菠萝 组培无 菌 苗 的 叶 片 ， 质 粒 时 携 带 了 - 葡 （ 萄 ） 糖 酸 酶 （ 告基因及耐除草剂的抗 基因。外源基因在转基因菠萝植株中的整合及表达已分别由 检测证实。再生植株经评估在温室中培养可对包含 效成份的商业除草剂 耐性。喷射浓度为 1400 mg/l 的除草剂后，植株仍保持健康颜色并能正常生长。 另外一篇值得关注的报道是， （ 2002） 利用临时性浸泡装置成功地用农杆菌转化了具 性的转基因菠萝，依据不同品种，转化率在 。另外，该报道中还对卡那霉素（ 潮霉素（ 膦丝菌素（ 种抗生素筛选标记进行了对比，证实后两者可以作为有效的筛选标记，而卡那霉素无论是在传统方式下还是在临时性浸泡装 置中， 当浓 度 高达 125mg/l 时仍无 法有效 地发挥 作用 。 潮霉素 用量在10l, 传统固体培养方式中用量为 l，而在临时性浸泡装置中用量 为 l。 景展望 菠萝的组培再生体系已经比较完善，但仍存在一定问题：一方面，脱毒效率有待 提高 ;另 一方面 ，培养 周期长 ，尤 其 芽诱导 期过长 ，有 待 进一步 优化。另外，愈伤组织途径有待于进一步优化，以便于遗传转化的研究。 菠萝转基因方面，抗性苗的再生以及转化效率的提高将成为研究的重点。高效、稳定的菠萝遗传转化体系的建立将为菠萝基因工程育种及利用菠萝作为生物反应器生产天然活性物质奠定基础。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 前 言 4 藜芦醇及白藜芦醇合成酶 藜芦醇的化学结构 白藜芦醇（ ,5 一种具有众多生物生理活性的的芪二酚（ 1， 2 类 植物 次生 代谢 产物 。 它在植物中的分 布较窄 ，只 存在于少 数关联 度不 高的植物中，如 花生， 葡萄 藤等。大 多数芪 二酚 类化合物具有植 物抗毒 素的 特点，因 此芪二 酚的 合成可以看成是植物防御机制的一部分。 藜芦醇的 生物合成 由 一 分 子 香 豆 酰 和三分子丙二酰 白藜 芦醇合 成酶 ( 化 合成的 。 芪二酚类物质合成的关键酶，它催化合成其它酶作用底物的骨干分子。根据作用底物分子的特征，芪二 酚 合 成 酶 可 以 分 为 两 类 ： 二 羟 基 苯 乙 烯 合 成 酶 ( 用的底物都为 2 种，苯丙氨酸前体丙二酰 二者的共有底物。 另一种底物 , 而 以桂 酰 为 另 一种 底 物。 两类 酶 催化 的反 应 类 型是 一样的，产物不同是由于香豆酰 一个羟基而肉桂酰 有。 藜芦醇合成酶转基因研究 应用基因工程方法在异源植物中表达 因引起了人们的重视，因为为植物外源植保素，它的合成只需引入一个单基因，并且其作用底物广泛存在于植物。人们对 因研究的重视主要是由于它们在植物防御系统中的相互关联作用，因此将 因转入无 因表达的植物可提供抗真菌侵染的防御体系。 (1990) 将 因克隆转入烟草中，转基因烟草悬浮细胞系经真菌诱导因子作用后， 积累快速增加。 (2001)通过 法从葡萄（ 克隆得到 在烟草中表达， 测表明 因整合到烟草基因组并转录，表达一个与 子量大小相同的特异蛋白。应用流氏细胞计还观察到，从转基因烟草中纯化得到的活性 理 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 前 言 5 留在 的细胞数目增加，而 S, 期的细胞数目减少。 （ 1993） 将 葡 萄 因 转 入 烟 草 中 ， 转 基 因 烟 草 的 后 代 对 侵 染抵抗力增加 ，这是 在转基因植物 中基于 一种植物本身没有的外源植保素而增加植物抗病能力的首次报道。选择 染烟草是因为在一些特定种类的葡萄中发现，在被该种病原物侵袭时， 度与对该真菌的抗性之间存在正相关。 (1997) 将 来 自 葡 萄 的 两 个 因 通 过 农 杆 菌 介 导(方法转入番茄中。检测证明两个基因都稳定整合到番茄基因组中，并经真菌侵染、受伤、诱导因子诱导、紫外光照射后，在转基因再生植株及其后代 中都表达。真菌 染短时间后就可以检测到植保素 且转基因番茄对该真菌的抗性明显增强。真菌 染后同样检测到 转基因番茄对该真菌的抗性没有明显的增强。 贾旭等（ 1999）用基因枪法将来源于葡萄的芪合成酶基因（ ）转入普通春小麦品种京红 5 号，并获得转基因植株，并从 单株中鉴定出一个对白粉病免疫植株和 3 个高抗白粉病植株。但有关转基因植株抗病性与 因表达量之 间的对应关系及 因在植株中表达的影响因素等问题还需进一步研究。 因在植物中的表达一般为诱导型的，当植物受到微生物的侵袭或其它环境胁迫时，就会启动 因的表达，以抵抗外来胁迫。 （ 2000）将由组成型启动子 5S 启动子调控的花生 RS 因转入紫花苜蓿中，首次报道表达 因的转基因植株中有 组成型积累。紫花苜蓿是一种重要的草料作物，本身没有 积累，但是含有高水平的黄酮类和异黄酮类物质的合成。在转基因苜蓿中检测到一种在野生型和只转空载体的苜蓿中 都没有的化合物，经鉴定为 浓度在最嫩的叶子和最老的结间部最高，而在根部只有痕量。 录本的水平在叶和茎部最高，而根相对来说则几乎没有； 转录本水平与此模式刚好相反。可能是因为 接与 争底物，这也可以解释通过限制底物浓度来调节 平的相应变化。琼脂平板（ 物鉴 定表明 能抑 制苜 蓿真菌 病原微 生物 的 菌丝的 生长。 积累能够减轻叶片的坏死，抑制由菌丝侵袭引起的黄萎，并且显著地减少真菌复制结构 (数目。高水平的 性的出现及对 谢中间产物的竞争并没有对转基因苜蓿正常的生长发育产生负面影响。 这 些 报 道 都证 明 了 外 源 植 物物 种 中 表达 能 够 增 强广 谱 抗 真菌 病原微生物的能力。但是目前对转基因植物的生理化学方面的研究进展缓慢。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 前 言 6 藜芦醇的生理生化作用 藜芦醇抑癌作用机理 藜芦醇作为核苷酸还 原酶抑制因子 哺乳动物细胞的核苷酸还原酶和 成具有抑制作用。 这 种 特 点 使 它 作 为 一 种 有 效 的 增 殖 抑 制 剂 和 癌 化 学 抑 制 剂 应 用 到 人 类 抗 癌 的研究中。核苷酸还原酶是一个多酶复合体，它催化核苷酸还原成相应的脱氧核苷酸，在细胞周期的早 S 期为 成提供原料。哺乳动物细胞，大多数真核细胞，疱疹病毒中的 毒，和一些细菌，都含有由异二聚体（ 基和 基）组成的含有离子的复合体。每个蛋白亚基都是增殖抑制药物作用的重要的目标。 基有底物结合位点，能够被特定核苷酸类似物不可逆的抑制，尤其是 2修饰的 半核糖，例如， 2脱氧胞嘧啶现在在临床上证明是非常有效的核苷酸还原酶抑制因子。另一种抑制作用是从酶活性依赖于小亚基 定位点酪氨酰自由基的出现。临床上用羟基脲和羟基苯甲醚作为作为抗癌药消除自由的酪氨酰，这两种药物需要大剂量使用，而且有副作用。998)实验结果表明至少在体外 够显著的抑制核苷酸还原酶 ,而且比羟基脲和羟基苯甲醚更有效，现在已知的最有效的消除核苷酸还原酶自由基的是 5异喹啉缩氨基硫脲，可是缩氨基硫脲因为它的强毒性不能作为药物使用。由于 有效 的抑制核苷酸还原酶和其毒性弱等特点使其可以成为更有效的临床替代品，例如在 双治疗方法的应用。 藜芦醇作为癌化学抑制剂 发现具有抗氧化、突变抑制的功能，并且能诱导 药物代谢酶（具有抑制 启动的活性）。 介导抗炎症作用，抑制环氧化酶和过氧化氢酶的活性（即抑制启动功能）。此外，它还抑制鼠乳腺癌细胞岛出发性肿瘤伤害的发展和鼠皮肤癌模型的肿瘤细胞的发生。这些数据都说明 为人们日常食谱中的一种成份，值得人们作为一种潜在的化学抑癌物质来研究。癌化学抑制剂包括非固醇类抑制 发炎药物（ 如茚甲新、阿司匹林、吡氧噻嗪、苏灵大等均是抑制环氧化酶（ 这种抑制剂的活性是与癌化学抑制作用相关的，因为 化由花生四烯酸到炎症初始物质的转换，这种物质能够促进肿瘤细胞生长，抑制免疫监控作用。此外， 激活癌发生物质，从而破坏遗传物质。化学癌发生过程被分为 3 个过程，化学抑制剂根据它所抑制的时期分类。 抑制作用与肿瘤起始、促进和发展相关。如上所述，这些物质是通过抑制 能力被鉴定出来的，这种活性是与抗肿瘤促进作用相互关联的。尽管 抑制活性要低于某种特定 的 茚甲新，但还是高于阿司匹林。与茚甲新和大多数其它的 同的是， 氧化氢酶作用。 导的抑制作用是对 异的，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 前 言 7 因为当观察 种酶对炎症的应答形式）吸收氧气的活性时没有检测到性，对 过氧化氢酶的抑制作用相对于对 著减少。流行病学发现适当饮酒尤其是红葡萄酒可以降低冠心病死亡率。因为有报道 变类花生酸合成，调节脂蛋白代谢机制，所以人们推测 有预防心脏病的功能。 藜芦醇 作为植物雌激素 基于 人工合成的雌激素二乙基已烯雌酚（ 结构上相似，人们推测 能是一种植物雌激素。 （ 1997）发现在 现其它生物 学 功 能 ， 如 抗 炎 症 、 抗 血 小 板 和 抑 制 癌 发 生所需浓度的条件下， 抑制被标记的雌二醇 与 雌 激 素 受 体 结 合 ， 并 且 激 活 被 转 化 到 人 乳腺 癌 细 胞 中 的 雌 激 素 报 告 基 因 转 录 ， 这 种 转 录激 活 作 用 是 雌 激 素 受 体 依 赖 型 的 ， 需 要 在 雌 激素 报 告 基 因 上 有 一 个 雌 激 素 应 答 元 件 ， 被 特 定的雌激素抗体抑制。 加天然雌激素调控基因的表达，刺激依赖雌激素的乳腺 癌 细 胞增殖。因此可以确定 一种植物雌激 素 ， 在 不 同 的 实 验 体 系 中 表 现 不 同 的 雌 激 素受体拮抗性。 雌激素样的激活作用拓宽了它的生物学作用。 本论文研究将以建立菠萝再生和遗传转化体系为重点，在建立了菠萝遗传转化体系的基础上，将由组成型启动子 动的 因导入菠萝，以期 获 得 能 有 效 提 高 菠 萝 抗 病 性 的 转 基 因 菠 萝 植 株 ， 同 时 提 升 菠 萝 的 营 养 附 加值，为利用菠萝为生物反应器生产 下基础。 O E s t r a d i o D i e t h y l s t i l b e s t r o O R e s v e r a t r o 第二章 材料与方法 8 第二章 材料与方法 料 物材料 植物材料为菠萝品种台农 16 号。 株 大肠杆菌（ 室保存 农杆菌（ 根癌农杆菌 室保存 粒 美国 司 A( 本室保存 本室保存 本室保存 物由上海激康公司合成 养基 1) 菌培养基：每升含胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g， 0 g。用 1 菌待用。加 脂配成固体培养基。 2) 养基：每升含胰蛋白胨 5 g，酵母提取物 1 g，蔗糖 5 g， .5 g。用 1 菌后待用。加 脂配成固体培养基。 3) 养基：每升含贮备液 50 备液、，各 5 蔗糖 30 g。用 1 菌后待用。加 脂配成固体培养基。贮备液配方见表 2 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 材料与方法 9 表 2 养 基 贮 备 液 配 方 o o f MS m 贮 备 液 成 分 浓 度 （ mg/l） 2 7 33000 38000 8800 7400 3400 3 4H 2 O 7 H 2 O n O 4 2 H 2 O 5 H 2 O 6 H 2 O 166 1240 4460 1720 50 5 5 7H 2 O 5560 7460 肌酸 烟酸 苷 氨 酸 20000 100 100 100 400 养条件 基本培养基为 1) 愈伤组织诱导培养基： 加不同浓度及配比的 6- 2, 4- D，设计成 交表，探讨不同的激素水平对芽诱导的影响，见表 2 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 材料与方法 10 表 2不 同 激 素 浓 度 对