【毕业学位论文】（Word原稿）麦长管蚜G蛋白β和γ亚基的基因克隆及其相互作用蛋白的筛选农业昆虫与害虫防治论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 麦长管蚜 G 蛋白 和 亚基的基因克隆 及其相互作用蛋白的筛选 I 摘 要 G 蛋白偶联信号传导系统是生物体内一类重要的细胞信号传导途径，其在高等动物、简单真核生物、昆虫及植物中普遍存在。 国际上，以果蝇为模式昆虫，对 G 蛋白的结构与功能作了较多的研究，证实 G 蛋白参与 了昆虫的嗅觉、视觉和内分泌激素等多种信号的传导过程。但是，目前对其它昆虫 G 蛋白及其信号 传导途径的研究报道很少，针对一些重要害虫的 研究更少。开展昆虫G 蛋白偶联信号传导途径研究，不仅可以明确昆虫对信号分子的感受机理，还可以阐明影响 G 蛋白偶联信号传导途径某个环节的阻碍机制 ， 为今后深入研究病虫害信号 传递机制和调控机理奠定理论基础。 本文选择小麦上的重大害虫麦长管蚜作为实验材料， 利用 术及 法进行异源三聚体 G 蛋白 和 亚基的基因克隆，并利用酵母双杂交系统研究已克隆的麦长管蚜 和 亚基之间是否互作，并筛选与其相关的作用蛋白。本研究取得如下主要结果： (1) 从麦长管蚜中首次克隆了 G 蛋白 和 两个亚基基因，已被 据 库收录，登录号分别为 克隆的 亚基与冈比亚按蚊 ( 果蝇( G 蛋白 1 亚基 氨基酸序列同源性 达 90 %， 与哺乳动物 2 型亚基的同源性为 80， 具有一个由 7 个 40(色氨酸天冬氨酸， 复片断组成的保守区； 克隆的 亚基与果蝇脑中表达的 1亚基氨基酸同源性为 60 %， 与哺乳动物 7亚型 的同源性为 38，具有 守区， 个氨基酸 守基序。根据氨基酸 序列 同源性比较 结果，初步推测 克隆的麦长管蚜 和 亚基与果蝇的 1 和 1亚型、哺乳动物的 2 和 7 亚型相似。 (2) 用半定量 法对麦长管蚜 G 蛋白 和 亚基基因进行了组织和虫期的转录平 研究。结果表明，两个亚基的基因在麦长管蚜各虫期及头、胸和腹部 都能 转录，且头部的转录水平最高。麦长管蚜 G 蛋白 和 亚基的这种组织分布广泛性，可能预示其参与细胞的 多种信号 传导途径。 (3) 通过 构建麦长管蚜的 库，用克隆的 亚基做诱饵进行 酵母双杂交筛选 ，得到与其 相互作用的蛋白。共鉴定了 120 多个阳性克隆，对 40 个具有代表性的克隆进行测序。通过询和分析，发现 13 个克隆分别与 G 蛋白受体激酶 7( G 蛋白偶联受体126(核糖体蛋白等基因序列部分同源，其它的克隆序列在 未查到相似基因，可能是一些尚未公布的新基因片断。这些克隆的获得，为进一步研究麦长管蚜 G 蛋白 亚基在信号传导中的作用奠定了基础。用克隆的 亚基做诱饵仅筛到了 7 个阳性克隆，在 没有查到与之类似的基因，有待进一步鉴定。 (4) 用酵母 双杂交系统研究克隆的麦长管蚜 G 蛋白 和 亚基之间是否存在互作。在生物体内， G 蛋白 和 亚基只有结合成二聚体才具有信号传导的功能。本试验没有 筛到相互作用的阳性克隆，可能是克隆的这两个亚基之间不能结合或结合 力很弱， 推测 麦长管蚜中可能存在其它亚型的 和 亚基，有待进一步试验证明。 (5) 克隆了麦长管蚜小 G 蛋白 族 基因， 在 的登录号为 是一类 结合 具有 活性的信号传导蛋白，它能通过调节细胞骨架肌动蛋白 聚合来控制昆虫翅脉 (分化。通过半定量 法研究发现，麦长管蚜 一龄若蚜 就有较高 的转录水平， 且若蚜期高于成蚜期， 有翅蚜高于无翅蚜。这些结果表明， 因具有时空转录 的特异性，在翅脉的分化过程中起正调控作用，由此推测翅脉的分化可能从一龄若蚜期开始。 (6) 克隆了麦长管蚜肌动蛋白基因的部分 列。获得了四个阳性克隆，通过序列比较分析，将核苷酸序列差异较大的克隆 登记，登录号分别为 索结果发现，与所有已知的肌动蛋白氨基酸同源性都在 94%以上。该基因的分离为深入研究小 G 蛋白 何通过调节细胞骨架肌动蛋白的聚合来调控翅脉的分化奠定了基础。 通过本文研究，首次从 麦长管蚜中分离和克隆了 G 蛋白及其与信号传导途径相关蛋白的基因5 个。通过转录水平的研究证实，克隆的 G 蛋白 和 亚基属于广泛组织分布型，可能参与细胞多种信号途径的传导。酵母双杂交的研究表明， G 蛋白 亚基能与其偶联受体激酶作用，使受体脱敏化而终止信号的传导。半定量 昆虫翅脉分化相关的小 有时空转录的 特异性，在翅脉的分化过程中起正调控作用。 以上对麦长管蚜 G 蛋白的研究结果，目前在国内外均未见报道。 这些成果的取得，为进一步研究麦长管蚜 G 蛋白的功能及其信号传导途径奠定了基础，对深入开展昆虫与寄主植物互作 机理及植物抗虫机制的研究，开辟防治新途径具有极为重要的理论和实践意义 。 关键词 ： 麦长管蚜， G 蛋白 亚基 ， 基因克隆， 酵母双杂交 ，信号传导 in is of in as on in as is in in to in on of In an in as (1) 3/5) 0% 0% 0% 1 in 8% 7 in is of GL G in by an on of it 1 1 2 7 in (2) by in at in in in (3) as 20 0 to os ( 26 ( 28S 8S NA No IV be of in as no to (4) no of is or is no is to - it be (5) of ho by in at in in in in in it of of (6) By of 4% of on of In on in in by of V is no at It on of of 录 第一章 引 言 . 1 蛋白的基本结构和种类 . 1 蛋白的调控循环 . 2 蛋白 亚基 . 2 蛋白 亚基的种类及组织分布 . 2 蛋白和亚基的基本 结构特点 . 3 蛋白 和 亚基形成二聚体的能力 . 3 蛋白 亚基与 亚基、受体和效应器的结合 . 4 蛋白偶 联的信号传导系统及各组分的结构和功能 . 4 蛋白偶联受体 (. 5 蛋白各亚基结构和功能关系 . 5 蛋白主要效应器 . 6 G 蛋白信号传导途径及网络化 . 6 s 途径 . 7 i 途径 . 8 q 途径 . 8 12 和 径 . 8 G 蛋白超家族概述 . 8 虫 G 蛋白信号途径的研究进展 . 9 蛋白偶联受体 . 9 蛋白及其下游效应器 . 10 蛋白在昆虫信号传导中的作用研究 . 10 母双杂交系统研究蛋白与蛋白之间的相互作用 . 12 母双杂交系统简介 . 12 母双杂交系统的应用 . 12 母双杂交系统的优点 . 13 究的目的和意义 . 14 第二章 麦长管蚜 G 蛋白和亚基的基因克隆与组织分布 . 15 料与方法 . 15 试昆虫 . 15 养基 . 15 要试剂 . 16 器设备 . 16 验技术路线图 . 17 提取 . 17 合成 . 18 物的设计 . 18 应 . 20 应 . 21 应 . 22 物的回收纯化 . 23 接反应 . 24 肠杆菌感受态细胞的制备 . 24 化大肠杆菌 . 24 落 定阳性克隆 . 24 列测定 . 25 头、胸 和腹部进行半定量 . 25 果与分析 . 27 亚基的基因克隆及序列分析 . 27 亚基在不同组织及各 虫期的转录水平 . 35 亚基的基因克隆及序列分析 . 37 亚基在不同组织及各虫期的转录水平 . 43 论 . 45 隆的麦长管蚜 和 亚基与其它物种的氨基酸同源性分析 . 45 和 亚基的结构与其功能关系 . 45 于半 定量 法的探讨 . 45 第三章 双杂交筛选与麦长管蚜 G 蛋白 和 亚基作用的蛋白 . 47 料与方法 . 47 料 . 47 剂： . 47 术路线图 . 51 别用麦长管蚜 G 蛋白 和 亚基构建诱饵蛋白 . 52 建 库 . 55 用构建好的诱饵蛋白筛选 库 . 57 母共转化法研究克隆的和亚基之间的互作 . 60 果与分析 . 61 饵蛋白的构建 . 61 . 63 麦长管蚜 . 64 麦长管蚜 亚基做诱饵筛选 . 84 母双杂交研究克隆的 与 亚基 之间的互作关系 . 85 论 . 86 酵母双杂交试验结果的分析 . 86 于酵母双杂交试验常见问题的探讨 . 87 一步工作设想 . 88 第四章 小 G 蛋白 肌动蛋白的基因克隆及序列分析 . 89 料与方法 . 89 料 . 89 法 . 89 果与分析 . 90 隆了小 G 蛋白 . 90 头、胸和腹部的转录水平 . 91 不同发育阶段的转录水平 . 91 蛋白 . 92 隆了麦长管蚜肌动蛋白基因的部分 . 97 论 . 101 第 五 章 结 论 . 102 参 考 文 献 . 105 致 谢 . 112 作 者 简 历 . 113 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 - 1 - 第一章 引 言 细胞信号传导是所有生物体具有的一种十分重要的生理功能。早在 20世纪 80年代初， 发现跨膜信号传导需要 存在；后来， 人发现 激型 G 蛋白 )激活肾上腺素依赖的腺苷酸环化酶系统。这些工作阐明了胞外信号转换为胞内信号的机制，由于两人在 G 蛋白发现过程中的重要贡献而被