【毕业学位论文】（Word原稿）番茄与白粉菌互作的细胞学和转录组学分析作物遗传育种博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 番茄与白粉菌互作的细胞学 和转录组学分析 of he of I 摘 要 番茄白粉病 (是一个世界范围内传播的真菌病害，对番茄 (的生产特别是温室生产造成了很大的危害。 本论文在细胞和转录水平上分析了 显性，隐性基因和主效 制的抗性机理。 研究采用了 方法，以非接种为对照分析了病菌诱导的感病，显性单基因和多基因抗性遗传材料的基因表达差异（第二章）。结果表明在番茄和白粉病菌亲和互作中番茄的上调表达基因数是非亲和互作中的 2 倍。抗性基因和 导的对白粉病菌的抗性反应和感病反应在很大程度上诱导了相同的基因，大约 40%的这些基因在抗性基因和 /或 导的抗性反应中表达较早，而其它的基因表达表现相似的时序性。通过序列分析发现，抗性反应特异性或者抗性反应中表达较早的差异表达的 段 （ 要来自植物防御反应和信号转导相关基因，而具有相似时序性的 而我们认为抗病和感病反应可能诱导了相似的基因，而这些基因表达的时序性差异对番茄和白粉病菌互作的最终结果至关重要。 为了更好地研究不同基因或 制的抗性反应机理，在细胞和转录水平上分析了以感病材料（ 遗传背景的含有显性抗性基因 隐性抗性基因 和不同 合的近等基因系 (白粉病菌的抗性反应（第三章和第五章）。显微镜分析结果显示这些基因和 制的抗性反应可以表现在白粉病菌和番茄互作的不同阶段。 导的抗性反应中起主导作用并且在 3 个 间表现加性，而穿透性乳突，小液泡和吸器基质结构异常化也和抗性反应相关但不具有加性效应。含有不同的 现不同类型的坏死细胞。 聚合可以导致和 导的单基因控制抗 性相当的高抗水平，而且这种效应产生主要是因为坏死细胞比率的升高（第四章）。此外，含有相同的 妹 如，接种白粉病菌的含有 3 个 两个姊妹 叶片上表现不同大小的坏死斑。小的坏死斑意味着快速的反应和植物可以用比较小的代价完成抗病过程。因而，含有多个 且表现较小坏死斑的番茄植株应该可以作为一个比较好的抗病亲本应用到抗病育种中。 含有隐性抗性基因 性 抗性基因 速 慢性 关。 析表明它们的基因表达谱不同。大部分的 导的抗性反应中表达，在 导的抗性反应中没有或者比较晚表达。 析显示 导的抗性反应和已知的水杨酸（ , 茉莉酸（ 以及乙烯防御反应途径无关。因而，我们推测 白可能是一个番茄白粉病菌亲和互作所必须的感病因子，或者 导的抗性反应采用了另外一种新的防御反应途径。乙烯防御反应途径参与 导的抗性反应，但是水杨酸和茉莉酸防御反应途径和 导的抗性反应不相关。脂氧化酶（ 导的抗性反应起重要作用，同时这种 脂氧化酶被证实不是 13 构酶。另外， 导的抗性反应和水杨酸和乙烯防御反应途径可能相关，但 需要进一步实验验证（第三章）。 根据以上的实验结果，使用 78 个经过挑选的引物组合对含有不同 合和 M 进行了进一步的 析。在显示的大约 4000 个条带中 204 个属于差异表达。其中 72 个 与基因型有关和处理不相关， 132 个 处理相关 。在亲和和非亲和互作中表现相同上调时序性的 认为来自于和基础防御反应或者亲和反应相关基因，这些基因的表达可能是被成功侵入的细胞反应的体现。那些在非亲和互作中表现较早表达时序性的基因被发现在感病植株中被系统性诱导。水杨酸和过氧化氢可能是这些单基因和多基因控制的番茄抗病材料的抗性反应中的重要信号分子。一小部分的特异差异表达的和调节转录和信号转导相关的基因可能负责着防御反应途径的精细调节。通过电子（ 图确定了一个位于 区域的 者 候选基因。 通过综合分析以上的结果并且和相关文献资料比较，我们得到以下结论：番茄白粉病抗性可以表现在番茄和白粉病菌互作的不同阶段。病菌诱导的番茄转录组变化在亲和互作和慢性 起的非亲和互作间具有保守性和数量性差异的特点。此外，快速 乳突形成（ 导的非亲和互作中番茄转录组变化表现出质的差异。 关键词 番茄 白粉病 细胞学分析 转录组学分析 单基因抗性 多基因抗性 is a of So or on We by of ). in O. as in as in in of TL in 0% of in to a of in of in to or in By of in ). we of of . in of to of ). A of or of ) of ). l . at of of R is s) of in to s). s) a in a of a of a of ). as we on 3Qa 3). A IV is a be in of R R to O. by of A of in in or up in of a of is A, JA we is a of . or is A A. An of 3 a in R) to be A ). We of . of a ,000 8 In 204 . 2 a on in or of of of in to a as 2O2 be in of of in a to a to by to We of of be a V of to -5 in to We . of of R (of . by R (by in 录 第一章 绪论 1 第二章 番茄对白粉病菌的防御机制：感病反应、单基因和多基因抗性反应基因表达的差异主要表现为时序性的不同 11 第三章 番茄乳突形成、快速和慢性过敏反应相关白粉病诱导抗性反应的转录表达谱分析 24 第四章 番茄对白粉病的防御反应：数量性抗性反应主要和过敏反应相关 39 第五章 白粉病诱导下的携带不同抗性 合番茄系的转录组学分析 52 第六章 总 结论和 讨 论 67 参考文献 73 致谢 75 作者简历 77 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 转录子来源片段 异表达转录子来源片段 增片段长度多态性 中国农业科学院 博士 学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 据推测，作物的产量需要增加两倍多才能够满足人类的食物和家畜饲料的需求。培育高产作物之外的另外一个最重要的保证食物和饲料供应的可持续方法就是使植物免受病虫害的危害（ et 2004）。由于植物病害造成的作物生产上的世界性的损失已经达到每年 12多（ 1993； et 2004）。因此，植物保护是全球食物安全的重要保证之一。植物和病原体的互作机理是植物保护研究的 一个热点，可以为抗性育种提供理论依据。下面以植物和专性真菌的互作为例简单介绍植病互作、本论文的植病体系、研究方法以及论文的鸟瞰结构。 一、 植物与活体寄生真菌的互作 真菌病害的种类繁多，大约占在所有的植物病害 2/3（ 1998）。寄生真菌可以划分为活体寄生和死物寄生真菌，前者必须在活体寄主上才能够完成生命周期；而后者则是先杀死寄主从死组织中吸取营养。为了能够从寄主上吸收营养，大部分活体寄生真菌都形成一个专门结构，就是所谓的吸器（ 2003）。植物与活体寄生真菌的互作可以是亲和（植物方面讲是感病的）和非亲和的（从植物方面将是抗病的）。非亲和互作可以发生在病菌感染植物的不同阶段并且往往和过敏反应（ 切相关。相比之下，在亲和互作中 活体寄生真菌能够在活的植物细胞中形成吸器吸收营养，并且改变了寄主细胞的代谢使其有利于自己生长，不导致过敏反应（ 2002）。很长一段时间，对于植物与活体寄生真菌互作的研究集中在植物对病原体的抗性上。相反，对感病性的研究非常少。 针 对于抗性来说，非寄主抗性的研究虽然没有突破性的进展，仍被认为是一种理想的持久抗性类型（ 2004）。寄主抗性是植物保护研究中的一个热点，包括单基因（显隐性）和多基因抗性。以下对感病性和抗病性、单基因和多基因抗性、以及显性和隐性抗性进行了比较和描述。 感病性和抗病性 活体寄生真菌对植物的侵染可以划分为以下几个时期：孢子附着、孢子萌发、形成芽管、寻找气孔、气孔识别、形成附着胞、穿透气孔 /穿透细胞壁、形成吸器、发病和形成分生孢子（ 2002）。 然而，以上所描述的侵染时期涉及到许多植物和活体寄生真菌的互作。针对某一种真菌，也许只是包括其中的某几个阶段。例如，白粉病菌的侵染并不包括气孔识别。看上去，植物可以在任何侵染阶段抵制病原真菌的侵染，然而，至今育种和科研中涉及的抗性主要包括以下几个侵染阶段：穿透细胞壁和吸器形成后的浸染阶段。在吸器形成前的阶段，植物以形成乳突来抑制真菌的浸染；在吸器形成后阶段，真菌往往诱导植物形成过敏反应（ 大麦 因介导白粉病抗性反应和番茄 因介导的白粉病抗性反应 是的 乳突形成相关抗性的典型例子（ et 1999； et 2005）。然而，更经常性的抗性反应是和过敏反应 (关的（ 2002）。大部分这种 关抗性符合 基因对基因 植病互作模型（ 1971）。玉米中的介导真菌 性的 科学家利用转座子标签方法克隆的第一个 R 基因（ 1992）。 码 后来克隆的 基 因具有不同机理。 et 1993) 成功地从番茄中分离出了 因，该 R 基因编码一个丝氨酸 /苏氨酸激酶 ，能够介导番茄对细菌（ pv 抗性。 因 是第一例利用图位克隆方法分离的 R 基因。 第一个被克隆的介导真菌病害（ 性的 R 基因（ et 1994）； C. 于细胞间的半活体寄生真菌，不形成吸器。已经分离的细胞内形成吸器的活体寄生真菌的 2003). 迄今，已经有超过 50 个符合 基因对基因 互作模式的 R 基因得到分离（ et 2005），大部分 R 基因具有亮氨酸丰富重复、核苷酸结合位点和激酶等同源域。这些过去 10 多年克隆的 R 基因极大地丰富了我们对植物抗病性的了解 然而，我们也应该注意 植物的感病性 。研究者通过扫描诱导突变体库和自然群体，发现了一系列隐性遗传的抗活体寄生真菌的 R 基 因，包括大麦 et 1997），番茄 et 2000）和 拟南芥的 因（ 2000; et 2002; 中国农业科学院 博士 学位论文 第一章 绪论 2 et 2003）。因为 因介导的抗性反应和那些防御反应标记基因的表达没有关联（ 2002； et 2002；本论文），所以我们可以推测和这些隐性基因所对应的显性基因是感病 反应必需寄主基因；另一个可能就是这些基因参与了一种未知的防御反应途径。对克隆基因 研究支持了寄主蛋白 别位于植物细胞壁、吸器基质和吸器外膜（图 1）并在该位点起作用。与非亲和互作引起的过敏性细胞死亡相反；在亲和互作中，维生素 B 在吸器中的合成抑制了细胞死亡，寄主的 制子也许是其作用靶子（ 2003）。这种细胞死亡的抑制在大麦和大麦白粉病菌（ f. 的亲和互作中表现为所谓的 绿岛效应 （ （ 2000）。位于病原菌的质膜上的 H+许也参与了亲和互作的建立。 尽管如此，我们对植物与活体寄生真菌互作的理解还是非常有限的。然而，很明显鉴定和分离更多的感病因子不仅可以使我们更好地理解亲和互作的机理，也可以为育种提供新的抗性来源。大麦的 因就是一个很好的例子，该基因在抗病育种中得到了很多年的利用。正如 因 ，这种类因可能介导对所有生理小种的广谱抗性。 p a p il l u ri a l n e ck b a n dE x h a u s ri a l m a xP la n t c e w a la n t p l a sm am e m b ra n P a s eV m i n B sy O?P M P M E x h a u st o ri a lm e m b ra n eP a t h o g e n ce w a a t h o g e n p l a sm am e m b ra n e d e a t h s u p p r e o nb a x i b it o r?De fe n s e s u p p r e o b in d i n g p e i n ?图 1 在植物与活体寄生真菌互作中的在植物细胞中的吸器模式图。这个模式图代表不同的植物与活体寄生真菌互作，不是针对某一种互作。 （ 改编自 003 et 2002） A in a of a a (003 et 2002) 非寄主抗性和寄主抗性 尽管植物病害是影响作物生产中的严重问题之一，事实上许多植物对许多植物病原体是具有抗性的。在自然界中，病害其实只是例外而不是共性的现象。即使病害发生了，其也 往往是发生在一定的寄主范围内和特定的组织中，例如，番茄白粉病主要侵染叶和幼茎。而非 非寄主植物 和 非寄主病原体 指的就是以上这种情况（ 2003）。 如果一种植物的所有品系（ 对某种特定的病原体具有抗性或 非感性 这个植物物种可以被称为这种特定病原体的 非寄主植物 ；而这种病原体被称为这种植物的 非寄主病原体 。如果一个植物物种中的一些品种对某种特定的病原体具有感病性，这种植物被认为是病原体的寄主。因此，非寄主抗性是指物种间的抗性；而寄主抗性是在 物种内表现、的抗性。根据抗性表现的范围，寄主抗性可以划分为小种转化性抗性、非小种转化性抗性及基础防御（表 1）。 表 1 基础抗病有关概念 (引自 et 2003) et 2003) 术语 释 病表现 国农业科学院 博士 学位论文 第一章 绪论 3 非寄主抗性 病性发生在种间 有效抵 抗所有已知病原 无症状 非小种专化性抗性 病性发生在种内 有效抵抗所有已知病原 R 蛋白介导 仅有某些植物基因型表现完全抗性 小种专化性抗性 病性在种内有所变化 仅在植物具有 R 蛋白，同时病原菌专化性小种产生相应激发子的情况下有效抵抗 每一植物基因型表现出对不同病原菌分离小种不同的抗病性及感病性 基础防御 主植物感病基因型中被激活 感病性在不同的感病基因型中有所变化 和寄主抗性相比非寄主抗性更普遍和持久，根据抗性特征可以将非寄主抗性划分为两种类型。第一种类型没有明显的表现特征；第二种类型非寄主抗性表现为快速过敏反应（ 2004）。 2003) 罗列了植物具有的五种非寄主病原体可能遇到的障碍。按病原体侵染的过程，前 4 个障碍包括植物影响病原体分化的信号分子、即有障碍（ 古老 可诱导的障碍和营养吸收的障碍可能是第一种类型非寄主抗性的原因。第五种假设的障碍和由多 独立的 R/因组合介导防御体系相关。其实寄主抗性和非寄主抗性没有非常严格的界限，这也解释了为什么许多研究表明寄主和非寄主抗性反应的基因表达非常相似（ et 2003）。几个有关信号分子，例如水杨酸、乙烯， 热休克蛋白被发现在寄主和非寄主抗性种都起作用（ 2004）。 et 2003), et 1996) 和 et 2003) 介导光谱抗性，是联系寄主 抗性和非寄主抗性的桥梁。尽管许多例子表明寄主和非寄主抗性 反应由很大程度的重叠，对非寄主抗性的理解仍然非常欠缺。然而，对病原体在非生命物质表面、寄主和非寄主植物表面的发育的研究可以帮助理解第一类型的非寄主抗性。对特定植物和那些与寄主植物有不同的遗传进化距离非寄主病原体的互作的进一步研究；以及利用特定的病原体和那些与寄主植物有不同遗传距离的非寄主植物的互作的研究，可能会使我们对非寄主抗性有更深入的理解。 单基因和多基因抗性 寄主抗性像其它性状一样表现为质量性和数量性。寄主抗性也因此可以划分为质量性抗性（通常 有一个基因控制）和数量性抗性（通常由多个基因控制）。再育种应用的大多数抗性是单基因控制的抗性，多基因控制抗性在育种中的应用相对较少（ do et 2001）。多基因控制抗性是许多微效基因共同作用的结果，因此分离群体表现出连续性的抗性水平，抗性个体和感病个体不容易区分。相反，单基因控制抗性由一个主效基因控制，分离群体表现不连续的抗性水平，因而抗性个体和感病个体比较容易区分。除了几个少数几个 R 基因（例如 以介导持久抗性外，大部分显性单基因控制抗性由于相应的病 原体的 进化而被攻克，因此抗性持续时间较短。而多基因抗性通常被认为是非小种转化性和持久的（ do et 2001）。尽管多基因抗性在许多作物中对许多病原体表现除不同水平的抗性（ do et 2001），但是这种抗性并不象单基因抗性在实际生产中应用的那么广泛。多基因抗性没有被广泛利用的主要原因是因为这种抗性常常并不完全和聚集的这些所有的 单一的品种中非常困难。利用侧翼分子标记可以帮助聚集多个 一个单一品种（ 2005）。将单基因和多基因抗性聚集到一个单一品种中可能有利于提高抗性的水平和持久性（本论文）。因而，虽然研究许多微效基因要比研究一个主效基因困难，但是多基因抗性育种仍然值得引起注意。 显性和隐性 R 基因 过去植物抗病性的研究大多集中在显性 R 基因和相应的抗性途径（ et 2004）。 相关的工作已经得到了很好的总结（ et 2003； 003），在本论文中的前言部分主要介绍隐性 R 基因的情况。再已经克隆的 50 多个 R 基 因（ et 2005）中，大部分是显性基因，其中的大部分基因拥有相似的保守区域（富含链亮氨酸重复， 相对于中国农业科学院 博士 学位论文 第一章 绪论 4 显性 R 基因 只有很少的几个隐性基因被克隆。幸运的是，感病性机理正引起人们越来越多的注意，一系列的介导对不同病原体抗性的隐性抗性基因位点也被相继发现。 迄今，有三个隐性 R 基因得到分离，分别是 2004）， et 2002）和 et 1997） 。 与水稻白叶枯病（ 抗性相关的隐性基因；鉴定所用菌株（小种）：菲律宾菌株 编码一个转录因子 A 的 亚基（ 与已知抗病基因具有不同结构， 一般真核生物的转录因子，但以前对其在抗病基因中作用未知，对 序发现，抗病和感病材料之间有两个核苷酸替代从而导致氨基酸的变化（ 2004）。从对青枯菌（ 病和抗病的拟南