【毕业学位论文】（Word原稿）转植酸酶基因胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）NK-2的环境安全性及应用效果研究微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 转 植酸酶 基因胶冻样芽孢杆菌 （ 环境 安全性及 应用效果研究 I 摘 要 鉴 于转基因微生物的潜在环境安全风险，对转基因微生物肥料的生物安全性评价是其应用的前提。本文以一株稳定高效分泌型转植酸酶基因（ ）工程胶冻样芽孢杆菌 其野生型 供试菌株，采用传统的选择性培养基平板测定法与 态微板技术、 16S 析技术相结合，对释放到烟草根际土壤中开展多层次环境安全性研究 ；同时 对其 进行田间应用效果 评价 。 烟草小区试验表明工程菌处理比对照增加 较出发菌增产 烟草叶片含 磷量较出发菌增加 产量和含磷量均达差异显著水平；马铃薯小区试验表明工程菌和出发菌菌液均能极显著地增加马铃薯块茎产量和品质，比空白增产达 但工程菌处理的中大薯的比例较出发菌提高 30%；工程菌和出发菌菌液处理的块茎含磷量分别达到 95.1 ug/g 和 87.2 ug/g ，工程菌较出发菌增加 差异达显著水平。以上结果说明外源植酸酶基因（ 工程菌中得到表达，发挥了改善作物磷素供给的作用。 用选择性培养基平板分别计数烟草根际土壤的细菌和 接种 菌 的 数量， 在 2d、 15d、 35d、 57d、93d 取样 的监测结果表明：在烟草的生长期间，三种处理对根际土壤的细菌数量影响不完全一致，以工程菌处理 的细菌数量 最多，但差异不显著， 说明接种 菌种对土壤根际微生物数量影响甚小 。工程菌和出发菌在根际土壤中的存活数量 显示其在 土壤 中 存活规律相似，都在 57 天后下降至与对照相当水平， 93d 含量已经低至难以检测； 多点监测 工程菌在抗性平板、无抗性平板上的数量差异均不显著，说明 基因工程菌株稳定，无抗性片断丢失。 态微板分析技术的结果显示： 接种 工程菌与出发菌对土壤微生物的代谢活性 均 有明显的增强作用，工程菌处理的代 谢活性较空白对照和出发菌分别提高 这 可能是 田间应用 基因工程菌 的作物 增产 原因 ；三种处理之间其土壤微生物物种丰富度（ H）和均匀度（ E）整体变化规律趋于一致，进一步的 16S 群结构分析也与之相吻合 。 结果 说 明转基因工程菌 土壤物种丰富度、均匀度以及区系结构水平没有明显影响。 本文的研究结果表明转基因工程菌 有效地改善作物的磷素供给，增产效果明显； 但它 在土壤中不能长期存活， 并不明显改变 土壤微生物的物种丰富度、均匀度以及区系结构 ，该工程菌的环境释放 风险较 小。 关键词： 胶冻样芽孢杆菌， 植酸酶基因（ ）， 转基因工程菌，环境安全评价， 态微 板，变性梯度凝胶电泳 of in of to is a in In of , P . in to 4of as 1. by ) of s 4B1 of s ) g, 2) of s of s P) 2. of on of in in by on 1) in by in 2) 4B1 in by of of is in 7d, of so 3. of on of by 1) as of so on 2) H) E) of of on on s 4. By NA of 6S r to of of on of in on of to 录 第一章 引言及文献综述 . 1 言 . 1 因工程技 术为生物肥料的发展提供了有力的技术支撑 . 1 生物肥料的发展需要现代生物技术注入新的活力 . 1 基因工程生物肥料菌种的生物安全研究与评价是其应用的前提 . 2 展转基因工程菌株的环境风险评估的重点 . 3 酸盐菌简要介绍 . 3 酸盐细菌的分类地位 . 3 酸盐细菌的形态学特点 . 4 酸盐细菌的生理生化特性 . 4 酸盐细菌的增产机理 . 5 壤中植酸态磷的转化及植酸酶基因工程菌的构建 . 6 究和应用解磷微生物的意义 . 7 酸及植酸酶 . 7 因工程菌的环境安全性评价 . 8 基因微生物环境安全评价的必要性 . 8 生物肥料基因工程菌株潜的环境风险 . 8 因工程菌株环境释放风险评价需考虑的重点 . 9 于基因工程菌的环境安全评价的方法 . 10 培养技术检测方法 . 11 落水平的生理图谱法 . 12 6S 析方法 . 14 究方法与本文研究目标的结合 . 错误 !未定义书签。 文的研究目的、内容和技术路线 . 15 文的研究目的 . 15 文的研究内容和方法 . 15 论研究的总体技术路线 . 15 第二章 出发菌及基因工程菌的田间应用效果评价 . 16 发菌及植酸酶工程菌株简介 . 16 冻样芽胞杆菌 . 16 酸酶高效分泌型基因工程菌株 . 16 发菌、基因工程菌的应用效果评价 . 17 验材料 . 17 验方法 . 19 V 验结果与分析 . 20 论与小结 . 22 第三章 出发菌、基因工程菌在土壤中的存活及对土壤 微生物的影响 . 24 验材料 . 24 验方法 . 24 壤取样 . 24 壤中微生物数量的测定 . 24 系表面微生物数量的测定 . 25 标菌株在根际的分布测定 . 25 养基平板种类及稀释倍数 . 25 果与 分析 . 26 草根表可培养微生物总数的测定结果 . 26 草根际土壤可培养微生物总数的测定结果 . 27 草根表出发菌硅酸盐细菌的存活测定结果 . 28 草根表工程菌 存活测定结果 . 28 草根际土壤硅酸盐细菌的存活测定结果 . 29 草根际土壤工程菌 量的测定结果 . 29 因工程菌株在烟草根际的分布测定 . 30 论与小结 . 31 第四章 根系土壤的 态微板分析 . 33 验材料 . 33 试的土壤样品 . 33 态微板（ 实验材料 . 33 验方法 . 33 态微板操作方法 . 33 据分析方法 . 34 果与分析 . 34 供试土壤的 定结果与分析 . 34 供试土壤的 数（ H ）测定结果 . 38 供试土壤微板数据的 匀度（ E） . 40 论 . 42 第五章 出发菌、工程菌处理烟草的根际土壤 析 44 验材料 . 44 要仪器设备 . 44 要缓冲液和试剂 : . 44 取试剂 : . 45 验步骤及方法 . 45 壤样品的采集 . 45 壤中 提取 . 45 6S 增 . 46 6S 3 区扩增产物的 泳 . 46 泳结果的银染法 . 47 果与分析 . 48 壤样品总 取 . 48 壤样品的 16S 3 区扩增 . 49 壤样品的 16S 3 扩增产物的 泳结果 . 50 平胶 泳结果的相似性分析 . 52 论及小结 . 54 第六章 全文结论 . 56 参考文献 . 58 致谢 . 62 作者简历 . 63 文缩略表 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 基对 性梯度凝胶电泳 氧核糖核酸 磷酸脱氧核糖核酸 化乙锭 二胺四乙 酸 g 千碱基对 m 钟 米 微克 合酶链式反应 二烷基硫酸钠 t 醋酸 冲液 VP 乙烯吡咯烷酮 缓冲液 g 克 l 升 （羟甲基）氨基甲烷 物根圈促生细菌 孔平均颜色变化率 落水平的生 理图谱 H 数 E 匀度 中国农业科学院 硕 士学 位论文 第一章 引言与文献综述 1 第一章 引言 及文献综述 言 中国是一个农业、人口大国，耕地的不断减少和人口的持续增长使我国农业生产越来越承受着巨大的压力。确保我国农业的高效、可持续发展，对我国的经济发展、国家安全和社会稳定，乃至对世界的农业生产及经济发展都具有战略意义。目前由于全球的化学农药和化学肥料使用量的增长，过于依赖 化学农药和化学肥料，有机肥使用不足，造成了土壤养分比例失调，土地板结，土壤质量下降，河流和地下水污染等一系列问题（考恩 瑞金特吉斯等， 1995）。为避免重蹈发达国家 先污染，后治理 的覆辙，发展可持续性农业，就要减少化学农药和肥料的使用量，寻找其有效的替代品。 微生物肥料作为肥料家族的新成员，是一类以微生物生命活动及其产物导致农作物得到特定肥料效应的微生物活体制品（葛诚， 1996），具有肥效相对较高、无毒无害、不污染环境且成本低、可节约能源等特点，完全符合绿色食品及可持续农业的发展需要，是化学肥料的理想辅助 和部分替代品。合理开发和利用微生物肥料，是保证我国农业持续发展的重要途径之一（吴建峰等，2002）。 微生物丰富的生物多样性及功能多样性为利用微生物在农业生产发挥重要作用提供了可能，孕育着巨大的研究和应用潜力。微生物肥料作为功能微生物的活体制品，在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用，保护环境，以及提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用（李俊等， 2003）。 因工程技术 为生物肥料的 发展提供了有力的技术支撑 生物肥料的发展需要现代生物技术注入新的活力 我国目前微生物肥料近年来发展迅猛，正处于历史上的最好时期 （李俊等， 2007） ： 1）目前约有 500多家企业获得农业部登记，年产量达到 600万吨，应用面积累计近 1亿亩； 2）产品类型多样，菌剂类和菌肥类共计 11个品种； 3）应用菌种种类不断扩大，涉及细菌、放线菌、丝状真菌、酵母菌等 110多个种，而且种类还在不断增加； 4）应用效果已经逐渐被社会广泛认可，微生物肥料标准体系和质量意识已经深入企业。 尽管微生物肥料发展近来发展迅速， 但与整个肥料行业发展规模相比，所占份额还远远不够，发展空间巨大。同时，我国微生物肥料产业的发展也存在诸如：用菌株相对老化，缺乏高效优良生产应用菌株；产品质量参差不齐，应用效果不尽稳定等的问题。而微生物肥料产品的应用效果中国农业科学院 硕 士学 位论文 第一章 引言与文献综述 2 及其前景在很大程度上取决于功能菌株的性能和活体密度，因此选育高性能的功能菌株成为保证微生物肥料产业持续发展的核心环节。在自然菌株选育的基础上开发微生物肥料产品已有长久的历史，对农业生产发挥了重要作用。但是，由于自然菌株和传统技术本身的一些缺陷与不足，诸如研究周期长、活性低等，农业微生物的产业化 仍受到很大限制。 近年来，现代生物科学的发展和生物技术的广泛应用给农业微生物研究注入了新的活力，特别是基因工程的研究为微生物遗传改良提供了有效手段，它不仅大大加速了筛选优质菌种的过程，而且还可以创造符合人们需要的新的优良菌种，使农业微生物发展成为生命科学领域活跃而创新性的前沿之一（ 2000； 2001）。 在我国 九五 期间，仅农业微生物领域分离克隆各类新基因 89个，构建高效工程菌株 51株，其中 5 种菌剂经安全性评估获准进入田间试验， 6种菌剂进入环境释放， 5种菌剂完成产品登记或技术 转让，部分产品已经投产应用（黄大昉， 2003）。在 十五 国家高新技术产业化项目（ 863计划）期间，中国农科院、南京农业大学、南开大学、中国林科院等多家单位，分离克隆溶磷、农药降解、耐盐基因多个，构建了数株基因工程菌，菌株性能涉及：溶磷和抑病工程菌，耐盐、降解苯乙酸，水解甲基对硫磷功能的基因工程菌，降解呋喃丹和甲基对硫磷农药的遗传稳定多功能工程菌，耐盐和固氮功能的花生、苜蓿根瘤菌工程菌，以及增效苜蓿根瘤基因工程菌。 据不完全统计，各国获准进入田间释放的重组微生物占已登记在案的遗传工程体环境释放总数的 其中绝大部分的受体微生物为细菌。目前，中国是世界上农业重组微生物环境释放面积最大、种类最多和研究范围最广的国家，据统计，在我国境内申报并通过农业部农业生物基因工程安全委员会批准的农业重组微生物已超过 40例（林敏， 2002）。 基因工程生物肥料 菌种 的生物安全研究与评价是其应用的前提 随着大量转基因工程菌株的构建及出现，工程菌株的大规模生产和应用已经成为不可逆转的趋势。由于生物肥料是活菌制品，一定数量的活菌体是保证其应用效果的基本条件，作为微生物肥料所用的转基因工程菌株必然会大量的释放在 农田生态系统开放的环境中；微生物肥料中的工程菌株在施用后，与土壤、水体、空气、动植物以及人体都有广泛的接触，某些菌株甚至可在植物组织内定殖而进入农产品、食品中，因此对微生物肥料所使用的基因工程菌株环境安全评价尤为重要。 转基因工程菌株是否安全，目前国际上还没有定论，正面和负面的报道都有，长期以来都是争论 的 热点。在越来越多的转基因生物体向环境中释放已经成为不可逆转的趋势时，深入开展转基因工程菌株的微生态学研究，不仅可以减少转基因生物环境释放中的不确定因素，降低环境的风险性，而且可了解转基因生物释放后的竞争以及 建立种群的必要条件，帮助转基因工程菌株在环境中建立种群优势，发挥其作用。同时，转基因生物安全性和生态学的研究对生物技术的应用有重要的推动作用，有助于分子生态学的发展（张尚通， 1994）。 中国农业科学院 硕 士学 位论文 第一章 引言与文献综述 3 展 转基因工程菌株的环境风险评估 的 重点 工程菌株的环境监控及评价工作主要集中在（林敏， 2002）： 1）监测遗传工程菌在环境中的生存、种群建立、在植物根系定殖的能力以及重组 2）监测遗传工程菌释放后对环境的潜在冲击，主要指环境微生物群体结构的变化和代谢类型的变化。 一些 国际 著名 的 实验室将近年来兴起的免培养分子技术，包括 单一碳源底物利用的 16S 分子水平和群体代谢水平揭示 人类活动 对土壤微生物群落结构和生物多样性的影响和冲击效应 （ 2004） 。 酸盐 菌 简要介绍 硅酸盐细菌，俗称 钾细菌 ，最初分离自蚯蚓肠中，是一类可分解正长石等硅酸盐矿物和磷灰石的芽胞杆菌。 1930年，原苏联学者 现这是土壤中一类 能分解硅酸盐类矿物并释放出磷、钾等元素供植物利用的细菌，同时亦有固氮功能（李元芳，1994）。这类细菌在土壤中能通过自身生命活动， 已经在多个方面表现出良好的应用性能，如：分解硅铝酸盐类及无机磷矿物，释放钾、磷营养元素，产生植物生长激素、有机酸和氨基酸类物质，改善植物营养及生长条件（曹凤明等， 2004），同时产生的胞外多糖具有增强植物非特异性免疫能力，在农业生产实践中表现出良好的应用效果。 该 类 菌种是 我国 近年来生物肥料产业应用最为广泛的菌株，在农业生产中已经有着四十多年的应用历史， 在微生物肥料产业界有着良好的 应用表现。据不完全统计，该类菌种在我国生物肥料行业中 25%以上的企业采用过该菌种作物生产菌种使用，在生物肥料行业中影响巨大，一直是微生物肥料研究和应用的热点。 此外 ，该类菌种 在采矿、冶金、饲料工业领域也有着广阔的应用 。 酸盐细菌的分类地位 硅酸盐细菌的分类地位目前仍没有完全确信的归属，较为认同的观点是 硅酸盐细菌 并不是某个特定种属的特指，而是 具有分解硅铝酸盐类及无机磷矿物，释放钾、磷营养元素功能 一大类细菌的总称，因此不是隶属于单一种，而是属于于几个较为近缘的种 。 1911年 921年研究结果将这类细菌定为 1939年原苏联学者 接从土壤中分离到一种细菌，能分解正长石和磷灰石而释放出磷钾，称之为硅酸盐细菌 (亚历山罗夫， 1955)，后来命名为 1940 年波兰学者 从土壤中分离一种新的可产生明胶状物质的有机体， 指出这种有机体最为显著的中国农业科学院 硕 士学 位论文 第一章 引言与文献综述 4 特征是可在不同的碳水化合物培养基中形成一层厚的、明胶状的荚膜，并对这种有机体的荚膜性质及成分作了比较系统的研究，把这种有机体称之为 健等， 2000）；陈庭伟等发现，硅酸盐细菌在我国分布很广，各地土壤中经常发现且分离菌株的形态差异不大，皆为大荚膜杆菌，产芽胞，革兰氏染色阴性，在无氮的培养基上菌落呈半玻璃珠状光亮突起，与述的形态、生理特征十分相似（陈庭伟， 1960）。 0年代其开始对一株硅酸盐细菌的生长 理形状及其 +定， 6S 1998在国际系统细菌学杂志 壤芽胞杆菌）， 为模式菌株； 1480D 作为 质芽胞杆菌）的模式菌株（ 1986； 997），国际细菌系统学杂志 1998年收录并承认了这两个新种和各自的模式菌株；何琳燕等对南京地区黄棕壤中分离的一株硅酸盐细菌 果表明该菌与胶质芽孢杆菌（ 土壤芽孢杆菌（ 缘关系最近，并将其确定为土壤芽孢杆菌的一个亚种（何琳燕， 2001）。 另外，有学者则提议将硅酸盐细菌归为环状芽孢杆菌（ （ 984；李凤汀 ,1997）；刘光烨等从紫色土壤中分离筛选出具有释钾、拮抗双重活性的硅酸盐细菌 株，并鉴定为多粘芽胞杆菌（ B. 刘光烨， 2002）；贺积强等从四川各地分离到大量的硅酸盐细菌菌株，经分类鉴定分别命名为巨大芽孢杆菌、凝结芽胞杆菌，但上述不同菌种的形态并不一致，而且都称为硅酸盐细菌（贺积强， 1999）。 综上所述，尽管硅酸盐细菌的多样性普遍存在。但综合其形态、生理特征，具有数层厚的、明胶状的大荚膜，革兰氏染色不定，在无氮的培养基上菌落呈半玻璃珠状光亮突起等特点来看，这类产芽孢杆菌与胶质芽孢杆菌（ 土壤芽孢杆菌（ 缘关系最近，国内目前微生物肥料生产应用所使用的硅酸盐细菌都应在这个类群之中。 酸盐细菌的形态学 特点 养体形态 细胞粗长杆状，两端钝圆，革兰氏染色反应不定，产生聚 粒；在无氮培养基上菌体大小为（ 个菌体或多个菌体包裹在同一荚膜边界内形成菌胶团，外被肥厚夹膜，并呈现 2时比菌体大 10倍以上；芽孢壁厚，椭圆形，中生或偏端生，芽孢囊微膨大（曹凤明 ， 2004；何琳燕 ， 2001）。 落形态 在无氮的阿须贝琼脂培养基上菌落胶质粘稠、湿润，形成光亮透明、边缘整齐圆形隆起菌落，挑起时富有弹性，可拉成丝。通常在 28 培养 48小时，菌落直径可达 3庭伟， 1960）。 酸盐细菌的 生理生化特性 中国农业科学院 硕 士学 位论文 第一章 引言与文献综述 5 目前对硅酸盐细菌生理生化特性研究的文献报道相对较少：好氧或兼性厌氧生长，水解淀粉、硝酸盐还原、接触酶反应阳性； V. 檬酸盐利用、氧化酶和卵磷脂酶反应阴性；可使牛奶陈化，使石蕊褪色等特征。最适生长温度 25 35 ，最适 何琳燕， 2001； 连宾 ， 2002）。 酸盐细菌的增产机理 钾效果及解钾机理 长期以来，硅酸盐细菌在我国生物肥料界都被作为能改善作物钾素营养的生物肥料菌种使用，解钾效果及机理也一直是研究的重点和热点。自上世纪 60年代，陈廷伟等都曾对硅酸盐细菌的形态生理及其对磷钾矿物的分解能力作了较为全面的研究 （ 陈廷伟 ， 1960） ，在以长石、云母及土壤矿物为钾该类源的培养试验结果表明，硅酸盐细菌对不同类型矿粉的释钾能力不同，该类细菌接到土壤后长期培养，虽然其增加量不稳定，可增 加土壤中的速效钾。池景良等分离出的硅酸盐细菌在纯培养条件下，用钾长石为底物释钾量可达 在无作物的情况下在草甸棕壤土中速效钾可提高 山地棕壤土中速效钾可提高 池景良， 1999）；盛下放等通过摇瓶和土柱试验对硅酸盐细菌 瓶试验表明接活菌比对照的钾含量增加 土柱试验表明该菌在黄棕壤和水稻土中均能存活并表现一定的释钾作用 （ 盛下放 ， 2000） 。国外学者 果也表明硅酸盐细菌 在土壤生物风化中起了显著作用（ 1984）；徐凤花等将硅酸盐菌剂与土壤混合制成每克干土含 10 亿左右细胞的生物钾肥，用于大豆试验，结果表明可使土壤中有效氮磷钾含量提高，促进大豆植株对养分的吸收，使其干物质积累量增加，根瘤数量提高（徐凤花， 2000）。王思远等研究了硅酸盐细菌与化肥配施对烤烟和土壤的综合效应，结果表明硅酸盐细菌能明显地促进土壤养分的转化，促进烟草植株对养分的吸收利用和生长发育，配合一定量的氮、磷、钾化肥施用效果更好。氮、磷、钾的转化效果分别比对照高 并能明显地促进烟株的生长发育（王思远， 2002）。 在硅酸盐细菌解钾机理认识 方面 ，目前国内外学者见解不同，主要集中在酸解、酶解、荚膜胞外多糖形成、细菌 历山大罗夫认为，硅酸盐细菌产酸是使矿物中不溶性钾释放的主要机制（亚历山罗夫， 1955），但陈廷伟、陈华癸等持不同的观点，他们认为硅酸盐细菌在培养过程中并不产生明显的酸，该细菌为大荚膜芽孢杆菌，它可能是利用本身特有的粘厚的大荚膜包被矿石并与其紧密接触，产生特殊的酶破坏矿石晶体构造释放出其中养分，或是 通过表面的物理化学接触交换作用而将有效钾释放出来（陈廷伟， 1960）。盛下放等人发现所分离到的 酸盐细菌株能合成并分泌草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸等和多种氨基酸到发酵液中，他们认为 株的释钾作用与其代谢产物有关，它们能破坏钾长石矿物晶格结构，主要是通过有机酸、氨基酸的酸溶以及有机酸、氨基酸和荚膜多糖的络和作用共同实现的