【毕业学位论文】（Word原稿）防治黄瓜枯萎、青椒疫病木霉菌的研究微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 防治 黄瓜枯萎、青椒疫病木霉菌的 研究 o.: he he 要 黄瓜枯萎病和青椒疫病是设施蔬菜最为常见且危害严重的两类土传真菌病害 ， 它们的有效防治 已成为蔬菜 生产中急待解决的难题。 本研究在分离、筛选对黄瓜枯萎和青椒疫病两类蔬菜 真菌病害拮抗菌的基础上，对防 治 效果较好的两株木霉菌进行鉴定，并对 其 拮抗机制进行初步探讨， 测定了其 产几丁质酶活性 。 同时，通过 温室盆栽试验和田间 小区 试验进行防治效果研究 和 田间 应用效果评价 。旨在为高效生防木霉菌制剂的研制及设施蔬菜真菌病害的生物防治提供理论依据和技术支持。 主要研究内容有以下几个方面： 1、从山东寿光、苍山两地采集的土样中分离、纯化得到拮抗菌共 59 株。其中拮抗疫病病菌的菌株 46株；拮抗枯萎病菌的菌株 13 株。 2、将从土样中分离得到的拮抗菌 59 株与 供的 25 株菌种，共计 84 株菌。分别针对黄瓜 枯萎病菌和青椒疫病病菌进行拮抗菌的筛选。通过室内 拮抗试验 和温室盆栽试验， 筛选到 真菌 2 号菌 株 对防治黄瓜枯萎病的效果最好 ， 防治效果为 达到差异显著 的效果 。真菌 4 号菌 株 对防治青椒疫病的效果最好， 防治效果为 达到差异显著 的效果 。真菌 2 号菌和真菌4 号菌均为 3、 对两株生防木霉菌的拮抗机制进行初步探讨。研究表明，在 木霉菌对病原真菌的拮抗过程中竞争、重寄生作用是重要的作用机制 。 4、采取还原糖法这一更为直观、准确的方法来 对生防木霉菌不同发酵时间几丁质酶活性进行测定，得出同一菌株在 不同发酵时间几丁质酶活性大小变化的趋势大致相同。 真菌 4号菌株在培养 145小时几丁质酶活性达到最大；真菌 2号菌株在培养 170小时几丁质酶活性达到最大。在相同发酵时间内，真菌 4号菌株的几丁质酶活性大于真菌 2号菌株的几丁质酶活性。 、在菌落形态观察和显微形态观察的基础上， 综合 理生化检测以及真菌 列分析等方法， 对生防效果较好的真菌 2 号和真菌 4 号菌株进行鉴定 。 根据试验结果 将真菌 2 号和真菌 4 号菌株分别鉴定为 柄木霉）与 柠檬绿木霉）。 为黄瓜枯萎病、青椒疫病的生物防治提供了新的 有 效拮抗菌 株 。 6、针对 黄瓜 枯萎病和青椒疫病制备生防木霉菌固体制剂，在山东莱阳和泰安进行了田间小区试验 ， 对 田间 应用效果进行评价 。固体菌剂对黄瓜枯萎病的防治效果为 达到差异显著的效果 ， 并且增产 其 防病与增产 效果显著。固体菌剂对青椒疫病防治效果 达 达到差异显著的效果，并且 平均株高比对照增加 达 增产 达 其 防病与促生、增产效果显著。 关键词： 木霉菌，黄瓜枯萎病 ，青椒疫病，生物防治 he of in in on of on to is of on of we on of by of 159 by 6 3 29 5 in of O.2 is of O.4 is 3of 4by of we on of at of of at of O.4 45 of O.2 70 of O.4 of O.2 at 5th,on of as TS of so on,we of O.2 O.4 to 6we on of of ， of on of i 目 录 摘 要 . I . 言 . 1 一、设施蔬菜病害及其防治现状 . 1 1、黄瓜枯萎病和青椒疫病病害概述 . 1 2、生物防治在设施蔬菜病害防治中的应用 . 2 二、木霉属分类研究进展 . 2 1、木霉属分类研究概况 . 3 2、 测技术在木霉分类研究中的应用 . 4 3、 列分析技术在木霉分类研究中的应用 . 4 4、木霉属分类研究展望 . 5 三、木霉菌在植物病原真菌生物防治中的应用 . 6 1、木霉对植物病原真菌的拮抗机制 . 6 2、木霉几丁质酶研究概况 . 8 3、木霉菌的当前应用状况 . 10 4、 存在问题、研究热点及前景展望 . 11 四、本研究的目的和意义 . 12 第一章 防治 黄瓜枯萎、青椒疫病木霉菌的筛选 . 13 一、材料 与方法 . 13 1、材料 . 13 2、方法 . 15 二、结果与分析 . 19 1、拮抗菌的分离、纯化 . 19 2、拮抗菌的筛选 . 19 3、温室盆栽试验 . 21 4、生防真菌拮抗机制的初步探讨 . 23 5、 生防真菌 几丁质酶活性的测定 . 23 三、讨论 . 26 四、本章小结 . 27 第二章 生防木霉菌的鉴定 . 29 一、材料与方法 . 29 1、材料 . 29 2、方法 . 30 二、结果 . 33 1、形态观察 . 33 2、 定 . 33 3、 真菌 列分析 . 34 三、讨论 . 37 、本章小结 . 37 第三章 生防木霉菌制剂的田间应用 效果 评价 . 38 一、材料与方法 . 38 1、材料 . 38 2、方法 . 38 二、结果 . 39 1、固体菌剂防治黄瓜枯萎病田间小区试验 . 39 2、固体菌剂防治青椒疫病田间小区试验 . 41 三、讨论 . 43 四、本章小结 . 43 结 论 . 44 参考文献 . 45 附图 . 50 附录 . 57 附录 1 . 57 1、病情分级标准 . 57 2、病情指数计算方法 . 57 3、防病效果计算方法 . 57 附录 2 96孔 5 种碳源名称 . 58 致 谢 . 59 作者简历 . 60 中国农业科学院硕士学位论文 引言 1 引 言 一、 设施 蔬菜病害 及 其 防治 现状 20世纪 80年代以 来，我国的蔬菜种植业发展迅速， 已 成为仅次于粮食作物的第二大农作物。其中 设施 蔬菜面积 达 到 530万公顷，占蔬菜 栽培 面积的 40%，年产值为 1500亿 元 。 设施 蔬菜的发展，为解决城乡蔬菜供应和增加菜农收入起到重要作用。 由于 设施 蔬菜栽培的特殊环境，给蔬菜病害的发生发展提供了适 宜 的条件 ,致使蔬菜病害发生种类、数量及危害程度都呈现出逐年增加的趋势，严重影响蔬菜的产量和质量，给菜农在经济上造成很大损失，已经成为限制我国蔬菜种植业发展和增强国际市场竞争力的“瓶颈”。 研究 蔬菜病害 的防治 ，已是蔬菜生产 可持续 发展 的必需 ,也是菜农的 迫切要求。 设施 蔬菜多是连年重茬种植，某些病 原 菌大量积累， 致使 一些土传病害日趋严重。如黄瓜枯萎病、茄子黄萎病，多种蔬菜的根结线虫病，青椒疫病等发生危害逐年加重，这些都与 设施 蔬菜不易轮作，连年重茬有关。此外， 由于 处于封闭状态，大量追施化肥、化肥施用不平衡等，致使设施 蔬菜生理障碍严重，影响蔬菜正常生长。加之，目前，广大菜农普遍缺乏科学的病害防治技术，由于病虫种类和农药品种繁多，一般对病害的识别、农药的选择以及某些药剂的使用知识缺乏。因此，存在着重治轻防，重药轻养，不重不治，重了乱治的现象。甚至认为所谓防治就是多打药，以化学农药为主，多药混用，随意加大药量，造成药害。也有的使用生长激素过量或乱用除草剂，造成激素中毒或药害，使植株或果实畸形，影响生长发育，甚至绝产，并使某些病害产生了抗药性，防治次数越来越多，用药量越来越大，病害越来越严重。 1、黄瓜枯萎病和青椒疫病病害概述 黄瓜枯萎病和青椒疫病是 设施 蔬菜最为常见且危害严重的两类土传真菌病害，主要症状表现为植物凋萎和萎蔫 ,根和茎维管束阻塞、变褐等（魏林等， 2002）。 瓜 枯萎 病 病原菌系半知菌亚门镰刀菌属 (菌。主要引起瓜类枯萎病。病菌主要 以菌丝体和厚垣孢子随病残体在土壤中越冬，也能在土壤中进行较长时间的腐生生活，一般从根部伤口或根冠细胞间隙侵入。典型症状：病菌从根部进入维管束导管，并在其内繁殖生长，阻塞导管，使根和茎基变褐，严重时呈水浸状腐烂，地上部茎叶迅速凋萎。 近年来，由尖镰孢菌 (所致的枯萎病已上升为蔬菜的主要病害之一，蔬菜中以黄瓜受害最为严重 ,发病率一般为 20%30%,受害重的地区发病率高达 80%90%以上，甚至绝产 (刘邮洲等， 2004)。 椒 疫病 病原菌系藻菌纲疫霉属 (菌。主要引起青 (甜 )椒疫病，疫病病菌 (要以卵孢子、厚垣孢子在种子或随病残体在土壤中越冬，典型症状：青 (甜 )椒 :苗期中国农业科学院硕士学位论文 引言 2 染病茎基腐烂猝倒 (呈暗绿色 )；定植后叶片染病产生暗绿色病斑，致叶片软腐，易脱落；果实染病也产生暗绿色水渍状斑，迅速变褐软腐；茎、枝染病，病斑可绕表皮扩展成褐色条斑，病部以上枝叶凋萎，湿度大时病斑表面长白色霉层。 青 椒疫病，是由 青 椒疫霉 (起的一种土传病害 ，是青椒的毁灭性病害。整个生育期均可发病， 大水漫 灌和高温高湿条件下容易大面积流行，常造成 青 椒减产，甚至绝收，已成为世界范围内 青 椒的毁灭性病害（朱宗源和吴玲忠， 1998）。 黄瓜 枯萎病 和 青椒疫病 的有效防治成为 生产中急待解决的难题 。 2、 生物防治 在 设施 蔬菜病害防治中的应用 长期以来，在设施蔬菜病害防治方面，农药特别是化学农药的使用发挥了巨大的作用。由于采用化学农药进行病害防治 具有 见效快，杀菌谱广，使用简便等 特 点， 使 其在农业防治中迅速发展，成为防病丰产的有效手段之一。但是长期、反复和大量使用化学农药存在着潜在的危害 导致有益微生物同时被杀死或抑制 ,破坏了生物 群落结构 ,造成了 环境污染、 蔬菜 中有害物质 大量残留、病原菌产生耐药性或抗药性 ,也导致了化学农药用量的增加 ,带来更加严重的问题。 当代农业的可持续发展，要求生产者在利用资源、提高产量的同时，注意保护和改善人们赖以生存的环境，这就对蔬菜病害防治中的传统观念和不良做法提出了严峻的挑战。鉴于长期使用化学药剂防治各种蔬菜病害所导致的对生态环境的破坏和病虫害抗药性增强等方面的副作用，迫使人们急切地 寻求新的安全有效的蔬菜病害防治途径。 生物防治的特点正好弥补了化学防治的不足，因而成为普受重视的研究方向。 利用 生物防治 来 防 治蔬菜 病害不仅避免了化学农药带来了一系列问题，而且安全、有效和持久， 且 具有不易使病原菌产生耐药性，对人畜安全无毒，不污染环境，无残留，能保持生态平衡，生产工艺较简单 的 特点 。 由于 生物防治 兼具了保护生态和抗病的双重功效， 使 其 在 蔬菜 病害防治中发挥着巨大的作用 ，因而 得到世界各国研究者的 关注，己经发展成为 蔬菜病害 防治中十分重要且日益得到重视的有效措施。 但是， 目前生 防 制剂 的 品种较少， 效果不如化学农药快，效果不稳定，受气候条件的影响较大等， 这些都是生产和应用中突出的问题（李增智 ,1999）。 近年来，随着生物技术的迅速发展，为 蔬菜病害的生物防治提供了一种新的途径，已成为农业与生命科学领域重要的发展前沿之一（黄大昉， 1999）。可以预计，随着抗病基因资源的不断挖掘利用和蔬菜与病害相互作用分子机理研究的不断深入，蔬菜抗病基因工程的研究将会取得突破性进展并走向应用，同时生防微生物的遗传改良将更有成效，遗传工程生防制剂将成为蔬菜病害生物防治的重要手段。总之，新的生物技术与传统技术方法的结合将推动农业微生物防治蔬菜病害进入一个新的发展阶段。 二、木霉属分类研究进展 木霉是一类普遍存在的真菌，常见于土壤中，是土壤微生物的重要群落，从植物根围 、叶围、种子及球茎表面，植物残体及腐朽木材上都可以分离到（杨依军等， 2000）。木霉菌 ( 属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目 ,粘孢菌类。在木霉菌的种群中有一大类被称为拮抗木中国农业科学院硕士学位论文 引言 3 霉 ,它们对许多植物病原菌具有寄生或拮抗作用 ,如长 柄 木霉 (、哈茨木霉(绿色木霉 (钩状木霉 (康氏木霉 (（ 1998）。另外某些木霉还具有活性很强的纤维素酶 等水解酶类，可用于生产纤维素酶和微生物源的糖蛋白（杨合同等， 2002）。鉴于木霉在工农业生产中具有很大的应用潜力，有关木霉的研究和应用一直引起人们的广泛关注（杨合同等， 2004）。尽管对木霉的研究和应用很活跃，但是，木霉的分类仍存在很大的分歧。 1、木霉属分类研究概况 木霉的研究最早可追溯到 200 多年前 ， 1794 年建立了木霉属 (。 时并没有认识到木霉的有性型 。 到半个多世纪以 后 ,其有性型 860)阐明 ， 到了 1902年 ， 木霉与其有性型的关系才被完全接受 。 1871年 ， 强调微观特征 ， 特别是瓶梗 (木霉属定界上的重要性 。 1902年 ， 1939 年 ， 认为这些形态变异的木霉菌株都可描述为一个种 ， 即 此以前，木霉的分类鉴定，没有一个统一的标准。 在 20 世纪 60 年代 ， 1966； 1969） 开始了木霉菌的分类研 究 ， 发表了一系列的研究论文 ， 并集其大成于 “A of ， 提出了第一个木霉属的分类系统 。 木霉属分为 9 个集合种 ( 集合种概念的提出受到了许多研究者的欢迎， 使人们第一次可以比较准确地认识木霉 “ 种 ” 。其中 许多研究者感兴趣的并不是分类本身 ， 也不是纤维素的降解 ， 而是有些木霉种 ， 多数是 抗植物病原真菌生长的本领 。 除了 外 ， 1957)通过子囊孢子培养的方法研究了木霉及其有性型的联系 。 而在这个方面 ,以日本学者 1967； 1979） 的研究最具特色 ， 他研究了木霉及其有性型 ， 发表了一系列的研究论文 （ 1994） 进一步研究了有性型的分类 。 80 年代中后期到90 年代初 1984； 1991； 1992） 提出了一个新的分类系统 ， 在其分类系统中引进了组的概念 ,他将木霉属分成了 5 个组 ,组下设若干个种 。 1969） 的集合种基础上发展起来的 ， 也是以分生孢子梗分枝方式及结构为主要特 征建立的 ， 这个系统还将 从而使木霉属分生孢子梗分枝结构更加复杂多变 。 而形态性状易受环境影响而产生 可 塑性进而导致趋同进化 ， 从而可能错误地确定性状的同源性 ， 因而该分类系统不能真正反映木霉属各类群间的亲缘关系和演化系统 。 以生物大分子为主要研究内容的分子系统学研究表明， 不同分类水平的遗传变异可以被描述并用作木霉属级 、 种级的定界 。 长期以来 ,真菌的分类鉴定一直以形态学性状为主要依据 ,而这些形态学性状由于 难以观察、或在人工培养条件下很难产孢而观察不到、或者本身形态特征相近很难区分 ,以及易受环境条件的影响而不稳定等原因，给真菌的分类鉴定，尤其是种及种以下的分类鉴定带来了一定的难度（章中国农业科学院硕士学位论文 引言 4 初龙和徐同， 2000）。 二十世纪八十年代以来，木霉分子生物学研究取得了重大的进展（徐同， 1996）。现代分子生物学技术的发展及其在真菌分类鉴定上的应用 ,为人们从分子水平上分析真菌不同分类单元之间的差异和亲缘关系提供了有力的手段。分子生物学方法能直接从 形态学和生理生化指标更客观准确，并且操作简便， 准确性可靠，特异性高。因此应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明真菌种群之间和种群内的分类关系是目前真菌分类研究的热点。 目 前 用 得 较 多 的 是 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (随机扩增多态性 内部转录间隔区(列分析技术（李敏慧等， 2003）。 2、 测技术在木霉分类研究中的应用 况 1984 年 ， 士和 立 份有限公司，公司位于美国加州北部 全球高新技术百强之一。 力于微生物鉴定领域新技术新产品的开发、生产和销售， 1989 年自 世以来至今，经过不断升级，目前已经可鉴定包括细菌、酵母