【毕业学位论文】新型噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌的机理及其药敏应用效果的研究-分析化学博士论文

学校代号 10532 学 号 分 类 号 密 级 博士学位论文 新型噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌的机理及其药敏应用效果的研究 学位申请人姓名 米贤文 培 养 单 位 化学化工学院 导师姓名及职称 何凤姣教授 学 科 专 业 分析化学 研 究 方 向 生命科学中的分析新方法 论文提交日期 2013 年 12 月 学校代号 ： 10532 学号： 级： 湖南大学博士学位论文 新型噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌的机理及其药敏应用效果的研究 学位申请人姓名： 米贤文 导师姓名及职称： 何凤姣教授 培 养 单 位： 化学化工学院 专 业 名 称： 分析化学 论文提交日期 ： 2013 年 12 月 论文答辩日期 ： 2013 年 12 月 答辩委员会主席 ： 陈金华教授 of of y in of in e 2013博士学位论文 要 结核病是目前单因素引起发病率和死亡率最高的疾病。 全球有三分之一的人群感染结核分枝杆菌，每年新增 800 万结核病人，有 200 万人死于结核病。世界卫生组织于 1993 年宣布：全球处于结核病紧急状态。引起结核病再次大流行的原因之一是不合理用药导致的耐药菌株的出现。 为有效执行 略， 快速检测结核分枝杆菌和正确选择抗生素治疗成为防治结核病的关键。 利用串联式压电石英传感器对环境电参数响应灵敏的特点， 将其应用于微生物生长状态监测中，及早得到微生物的生长信息。用串联式压电传感器，分析培养基不同成分对微生物生长压电信号的影响；用单因素分析方法，分析不同成分对耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌生长曲线的影响。将 养基中成分的作用分为缓冲作用、合成代谢作用、生长促进因子作用，构建分枝杆菌压电检测体系。对压电频移曲线进行分类，将压电频移信号产生的物质基础分为分解代谢所分泌电导成分和合成代谢所吸收电导成分两种类型，分别产生向下的频移曲线和向上的频移曲线，提升对串联式压电微生物传感器频移信号的理论认识。 用噬菌体成斑率为指标，研究噬菌体 在环境中稳定的条件，保证噬菌体的感染效率；研究噬菌体最佳的灭活方法，减少实验过程出现假阳性。分析钙镁浓度对噬菌体吸附、顿挫感染的影响，得出最佳的钙离子浓度、杀毒剂硫酸亚铁胺浓度。用一步生长曲线研究噬菌体 耻垢分枝杆菌作用的特性，分析影响噬菌体生物放大作用的外部环境因素，优化出最适合结核分枝杆菌快速检测的培养基配方。综合考虑噬菌体的稳定条件、灭活条件、一步生长曲线的最优条件和耻垢分枝杆菌在 养基中压电信号的影响因素，选择适合构建噬菌体生物放大的压电传感器检测培养体系。 结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌能被噬菌体 染，保护菌体内的噬菌体被硫酸亚铁杀灭。样品中的结核分枝杆菌被作为载体，将加在样品处理液中的噬菌体 移到检测池。在检测池中，噬菌体 解结核分枝杆菌释放子代噬菌体，子代噬菌体感染耻垢分枝杆菌，经历快速的感染、复制、裂解的循环过程。这个循环过程构成噬菌体链式生物放大反应，最终得到完全抑制耻垢分枝杆菌生长的结果。样品中结核分枝杆菌的浓度不同，转移到检测池中的噬菌体也浓度不同，完全抑制耻垢分枝杆菌生长所需的循环次数不同， 最终导致检测池中耻垢分枝杆菌生长程度不同。当样品中没有结核分枝杆菌充当噬菌体的新型噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌的机理及其药敏应用效果的研究 体时， 则无噬菌体被转移到检测池中， 耻垢分枝杆菌的生长不受噬菌体抑制。 耻垢分枝杆菌在生长过程中，利用培养基中的电导成分，引起压电传感器产生频移响应信号。不同浓度的结核分枝杆菌引起不同强度的压电频移响应信号。 在液体培养基中， 充分发挥噬菌体的链式放大作用， 提高检测方法灵敏度。 应用压电传感器对电参数的灵敏响应，提高检测方法的灵敏度。通过噬菌体 梁作用，将慢速生长的结核分枝杆菌检测，转换成快速生长的耻垢分枝杆菌的检测，大大提高检测速度。噬菌体对结核分枝杆菌的裂解作用，可降低实验风险，安全可靠。耻垢分枝杆菌检测所需要培养基和仪器要求低，成本低廉。用数学模型分析检出时间与溶液中噬菌体浓度的关系， 得出检测时间与溶液中 129 浓度成线性的结果。用双盲对照的原则研究样本处理对检测方法的影响，得出正确的样本处理方法，保证结果的准确度，避免假阳性和假阴性。该方法可以检测 102结核分枝杆菌，检测时间缩短到 30 小时，具有临床诊断实用价值。噬菌体放大多通道压电传感器法（ 60法的统计学比较结果，得出两者检测临床样 本的灵敏度和特异度一致。但检测时间只需 30 小时，优于培养法。 还可以通过提高噬菌体感染效率，进一步提高方法的灵敏度。 防止耐药结核分枝杆菌的出现是控制 结核病的关键措施，实现结核分枝杆菌菌株耐药的快速检测，对合理用药和防止耐药菌株的出现有非常重要的意义。我们根据噬菌体只能感染活的结核分枝杆菌的特点， 将 应用于结核分枝杆菌耐药检测。建立 耐药结果的频移标准，根据实验条件和比例法耐药的判别标准，对利福平、异烟肼和乙胺丁醇三种药物，当耻垢分枝杆菌生长引起的频移小于 121，认为菌株对药物耐受；对链霉素药物，当耻垢分枝杆菌引起的压电频移小于 92，判定菌株对链霉素耐药。将双盲实验中，所得的结果与 60 法所得结果进行统计学分析，得出与 没有统计学差异，能准确检测临床结核分枝杆菌菌株对利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素 等一线抗结核药物的耐受情况。由于能快速报告实验结果，可以替代传统的培养法用于临床结核分枝杆菌菌株的耐药实验。但是 样存在噬菌体感染效率的问题，有可能将未感染噬菌体的结核分枝杆菌当成耐药菌株，影响方法的准确度。因此，优化培养基成分是提高检测方法灵敏度，提高耐药实验准确度的关键。 为建立微生物快速传感检测新方法， 我们使用石墨烯新材料和核酸序列代替适配体进行初步实验。用化学气相沉积法在铜箔表面制备大面积石墨烯，用拉曼光谱分析在不同气体条件下形成石墨烯的质量，研究氢气流量、温度、基底材料对石墨烯质量的影响，直接制备出可用于电极分析的大面积单层石墨烯。用电化学阻抗谱和循环伏安法研究核酸序列在石墨烯电表面吸附和解离的条件，得出钠博士学位论文 浓度在 100、镁的浓度在 5 ，核酸序列通过 集作用而吸附，电极表面电子传递阻力增大；在钙、镁离子的存在条件下，吸附的核酸序列与互补序列作用解离，电极表面电子传递阻力减小；电极表面的电子传递阻力的拟合分析得出，电子传递阻力的改变与 度成线性关系。适配体是与核酸序列同性质的 列， 石墨烯电极和适配体为目标分析物 (如病原微生物 )的快速传感检测提供可能。 关键词：结核分枝杆菌；耻垢分枝杆 菌；噬菌体；压电传感器；石墨烯；适配体 新型噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌的机理及其药敏应用效果的研究 V is of by a at of an B B is in of B of In to it of to be to of to of of on by of 7H9 on by of 7H9 as of of in of . 7H9 a of in a of of to of in of in on of in to of 29 To 29 of on of of 29 to 29 of 29 博士学位论文 VI on of 29 in of on to . In of 29 in of 29 to to of . on . to by . 29 by . in 29 a of . of 29 of of 29 of is to . in is to . in 7H9 by in of is by of to of of by in of of 29 in a a to of of a to of is by of by 29 as a of in be by of is is of 02mL 0 h in 型噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌的机理及其药敏应用效果的研究 to is a at of on by so we to is no of is 0 h is 10 h of .B of of 29, it is to it . is by is at a of be be by of of . is . 05to in of 8 h (a， a). be by 29, 29 is b). is to 0to c), 29 in a of d); of a of 29 e). On by b), is to c). No is d), no of 士学位论文 is e). of by . as of 29. of by To on of on by of on of as of on of of a on of on by - in 00 5 in of on by in of on of of on of is to of of is NA of of on of 新型噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌的机理及其药敏应用效果的研究 录 学位论文原创性声明 . I摘 要 . . V第一章 绪论 . 1究背景和意义 . 1核分枝杆菌检测的历史与现状 . 1片检测 . 1养检测 . 3清学检测方法 . 7子生物学方法 . 8核分枝杆菌的耐药检测 . 11核分枝杆菌耐药的分子机理 . 11药菌株的检测方法 . 12电传感技术的进展 . 15电传感器原理和构建 . 15电传感器的分类 . 16液式压电传感器的应用 . 18相压电传感器的响应特点和应用 . 20文研究的主要内容 . 23第二章 结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌压电检测体系的构建 . 24言 . 24验部分： . 24枝杆菌和耻垢分枝杆菌悬液的制备 . 24同糖类的 . 25器设备 . 26验步骤 . 26果与讨论 . 27电石英晶体传感器的构建和电参数响应特性 . 27核分枝杆菌在不同培养基中信号的代谢机理 . 29垢分枝杆菌在不同培养基中信号的代谢机理 . 31核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌在 7的生长信号差异 33垢分枝杆菌在 养基中的响应机理 . 35博士学位论文 X 结 . 36第三章 噬菌体 耻垢分枝杆菌作用的生物学特性研究 . 37言 . 37器与试剂 . 37剂与菌株 . 37器与设备 . 38验部分 . 39垢分枝杆菌增殖培养方法 . 39核分枝杆菌培养保存方法 . 39菌体的增殖培养方法 . 40果与讨论 . 43菌体 化学和物理特性 . 43垢分枝杆菌吸附噬菌体 位点分析 . 43菌体 耻垢分枝杆菌中的一步生长曲线 . 43 . 44离子对噬菌体 附宿主细胞的影响 . 450 对噬菌体 耻垢分枝杆菌作用的影响 . 47酸亚铁铵浓度的选择 . 49结 . 50第四章 噬菌体放大多通道压电石英传感器快速灵敏检测结核分枝杆菌 . 51言 . 51验部分 . 53测培养基和样品处理 . 53统 . 54验步骤 . 54果与讨论 . 54菌体放大多