单克隆抗体技术

单克隆抗体技术 实验目的 了解单克隆抗体的制备过程 实验原理 根据肿瘤细胞可以无限增殖 B细胞可以分泌抗体的特点将他们在体外融合 通过一定的筛选方法得到既可以分泌特异抗体 又可以无限增殖的融合细胞 细胞融合技术 不分泌抗体长命 分泌抗体短命 分泌抗体长命 K hler和Milstein 1975 1984年Nobel医学奖 杂交瘤细胞的筛选 HAT培养基筛选 H 次黄嘌呤 A 氨基喋呤 T 胸腺嘧啶 A Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 HGPRT 胸腺嘧啶激酶 TK Thymidinekinase B淋巴细胞 HGPRT TK 骨髓瘤细胞 HGPRT TK 存活 死亡 外源性途径 旁路途径 杂交瘤技术操作流程图解 一 抗体分泌细胞的分离 1 以抗原常规免疫小鼠 回收血清作为阳性对照 2 取小鼠脾脏 研磨 过滤 使成单个细胞 3 用淋巴细胞分离液分离B细胞 将14 Ficoll400与33 的泛影葡胺 混匀 取6ml加于离心管底部 然后在其顶部轻轻加上脾细胞悬液 2000rpm离心20分钟 使形成液体界面 吸取界面上的脾细胞制成脾细胞悬液 存于4 冰箱备用 二 细胞融合 肿瘤细胞融合前24h换液一次 培养至对数生长期 收集 洗涤 存于无血清培养基 无菌条件下融合 置于完全培养基 过夜 重新悬于HAT培养基 接种 培养 三 特异抗体分泌的检测 取纯化抗原制成适当浓度 加于96孔板底 4 冰箱过夜 PBS清洗2 3次 加入0 5 戊二醛溶液 室温反应15分钟 PBS清洗2 3次 加入5 的脱酯奶粉 室温封闭30分钟 PBS洗一次 弃去液体 取待检测抗体 按两板孔的对应位置逐孔加入50 l 37 水浴60分钟 TP液洗3次后 加入HPR标记的二抗液 于37 水浴1小时 加入底物液各100 l 于37 反应30 60分钟 酶标仪读数分析 与阳性血清对照 确定阳性分泌的克隆孔 酶联免疫吸附法 ELISA 技术原理 enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA 四 阳性孔进一步单克隆化 混匀阳性孔细胞再次接种96孔板 培养15 20天 Elisa法确定阳性孔后进一步单克隆化 收集阳性孔细胞 悬浮于HT培养基中 计数细胞 稀释至0 8个cell 孔 接种于新的96孔板 再用Elisa法检测阳性的孔 可认为是单克隆化的杂交瘤细胞 培养后移入24孔板进行扩增 酶标仪上检测抗体分泌仍为阳性的细胞冻存 以避免无关细胞克隆过度生长 有些克隆在低细胞密度时生长较差 此时加适量的饲养细胞 使用高质量的胎牛血清可能有帮助 在克隆化过程中 应保留所有可能有意义的细胞 以便作进一步的克隆化和检查 避免杂交瘤细胞的丢失 初期的杂交瘤细胞不稳定 有丢失染色体的倾向 反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株 克隆化的方法很多 而最常用的是有限稀释法 克隆化应尽早进行并反复筛选 饲养细胞 在体外的细胞培养中 单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖 必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖 加入的细胞称之为饲养细胞 Feedercell 在细胞融合和单克隆的选择过程中 就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体 因此在这一过程中必须使用饲养细胞 许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞 由单一克隆的杂交瘤细胞分