流式细胞仪应用VIP

流式细胞仪的应用 流式细胞术在基础研究中的应用 细胞活力的检测细胞周期分析细胞凋亡分析多药耐药基因研究 MDR RNA测定 DNA测定细胞内离子的测定及pH值测定 流式细胞术的临床应用 白血病免疫分型HLA B27 强直性脊柱炎淋巴细胞亚群造血干细胞计数 造血干细胞移植网织红细胞PNH诊断 CD55 CD59 血小板活化试验 guavaeasyCyte 8HT微毛细管细胞分析仪厂家 Millipore获奖理由 突破性的微毛细管技术 无需鞘液 样品体积少 废液更少 让细胞分析变得更简单 快捷 易于操控 4 细胞活力的检测 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞 总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力 DeadCellDiscrimination Cellsshouldnotbefixed permeabilizedpriortorunningontheflowcytometer Cellsareincubatedonicefor1 5minutesinPIatafinalconcentrationof2ug ml 细胞周期分析 在细胞周期内DNA含量各时期发生周期性变化 通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定 可分析细胞周期各时期相对的百分比 了解细胞群体的倍体性和增殖能力 DNA含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测 来分析细胞处于某一特定周期阶段 恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体 DNA含量分析对肿瘤的诊断预后有很高的价值 尤其对细胞毒性药物的研究很有价值 G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 s DNAcontent Count G0期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞 即为静止细胞 其细胞DNA含量为较恒定的2N值 G1期细胞与G0期细胞DNA值相同 均为二倍体DNA含量 当细胞进入S期后 DNA含量逐渐增加 当细胞DNA倍增结束 进入G2期 最终进入M期 在M期分裂为两个子细胞之前 G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4N值 即为四倍体细胞群 G0 G1 S G2 M FluorescenceIntensity ofEvents AtypicalDNAHistogramofcellproliferation 样品制备 1000rpm5分钟收集2X106个细胞 PBS漂洗两次 70 酒精4度固定过夜 收集固定的细胞 PBS漂洗 0 5mlPBS悬浮细胞 2 5 l10 g lRNaseA 37度消化1小时 过300目细胞筛 50 l0 1mg mlPI 含1 Triton 1000rpm5分钟离心 两次 混匀 室温静止5分钟 上机 经RNA酶处理前后的比较 RNA也是核酸 也会被PI染色 为避免干扰 染色前需用RNAse降解RNA 这样PI只染DNA 能精确以荧光强度反映DNA的含量 结果解读G0 G1期细胞占总的61 2 峰位于横座标的45 76G2 M期占13 07 峰位于横座标的91 43S期占25 73G2 G1为2 0 即G2期为4倍体细胞 而G1期为2倍体细胞 比值为2 峰的变异系数为4 54 好 细胞碎片为0 48 细胞聚集体有0 06 总的细胞数 仪器检测到的 为17525个 在细胞周期中分析的细胞数为17431个 即排除了碎片及聚集体后 CV是变异系数 一般CV越小 峰形越好 越尖锐 能控制在5 左右是比较好的结果 一般小于10 就可以认可了 应用DNA含量测定鉴定细胞凋亡 如果有凋亡 在G0 G1期前面有个凋亡峰 也称sub G0期 在凋亡细胞中 用PI染色 通过流式检测DNA含量 可以发现一种亚群的细胞 其染色荧光强度下降 这是由于随着调亡的进行 核酸内切酶活化 随后一部分DNA泄漏出去 造成细胞内DNA含量下降造成的 FlowCytometryofApoptoticCells 缺乏IL 3诱导的细胞凋亡 在DNA直方图上区分凋亡峰和细胞碎片峰 上图为细胞碎片峰 在二倍体G0 1峰之前呈左高右低的抛物线 蓝色 上图为细胞凋亡峰 在二倍体G0 1峰之前呈对称分布的抛物线 蓝色 流式细胞术在生殖医学中的应用 精子细胞和精子为单倍体细胞1C 次级精母细胞为二倍体细胞2C 初级精母细胞和处于G2M期的精原细胞4C 细胞凋亡分析 细胞凋亡 特点 染色质的浓缩 核膜及细胞膜的内陷 接着核碎裂成分离的片段 凋亡小体 apoptosisbody 的出现 在流式细胞仪上 对于光散射特性观察凋亡细胞的改变 由于细胞的固缩 体积变小 FSC会变小 而细胞碎片及颗粒增多 SSC也会改变 在细胞凋亡过程中细胞形态学的变化 早早期凋亡的检测 capase3早期凋亡Annexin V FITC PI双染法早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测晚期凋亡 TUNEL 法晚晚期凋亡 DNA含量分析法 caspase 3 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用 其中caspase 3为关键的执行分子 它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能 Caspase 3正常以酶原 32KD 的形式存在于胞浆中 在凋亡的早期阶段 它被激活 活化的Caspase 3由两个大亚基 17KD 和两个小亚基 12KD 组成 裂解相应的胞浆胞核底物 最终导致细胞凋亡 但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞 caspase 3的活性明显下降 Massivesubstratecleavage ApoptosisSignaling Receptor FlowCytometricAnalysisofApoptosisinJurkatTCells RelativeCellNumber ActiveCaspase 3 FITC 00 5124 IncubationwithCamptothecin喜树碱 hr 早早期凋亡的检测capase3早期凋亡Annexin V FITC PI双染法早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测晚期凋亡 TUNEL 法晚晚期凋亡 DNA含量分析法 Annexin V FITC PI双染法 正常细胞膜磷脂的分布是不对称的 膜内表面含有带负电的磷脂 如磷脂酰丝氨酸 PS 而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂 在细胞凋亡早期 细胞表面发生变化 细胞膜内部的PS迁移到细胞外层表面 AnnexinV是一种对Ca2 依赖 对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白 可作为探针识别细胞膜表面是否有PS 从而识别凋亡细胞 AnnexinVAssay 细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻染色体局部凝聚 Annexin V FITC PI双染法 由于坏死细胞也可能在细胞膜表面出现磷脂酰丝氨酸 又在细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的 而细胞坏死在其初期 细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生红色荧光 而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生 因此 在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号 正常活细胞与此相似 在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞 为 AnnexinV PI 右上象限是非活细胞 即坏死细胞 为AnnexinV PI 而右下象限为凋亡细胞 显现AnnexinV PI AnnexinVAssay区分死亡与凋亡 AnnexinV PIAnalysis Camptothecin 喜树碱 抗肿瘤药物 实验步骤 1 离心收集悬浮细胞 微量离心机转速2000RPM 离心时间5min 弃培养基 2 用冷PBS洗涤细胞两次 3 用400ul1XBindingBuffer悬浮细胞 浓度大约为1X106cells ml 4 在细胞悬浮液中加入5ulAnnexinV FITC 轻轻混匀后于2 8 C避光条件下孵育15分钟 5 加入10ulPI后轻轻混匀 于2 8 C避光条件下孵育5分钟 6 在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测 早早期凋亡的检测capase3早期凋亡Annexin V FITC PI双染法早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测晚期凋亡 TUNEL 法晚晚期凋亡 DNA含量分析法 原理 细胞凋亡与坏死在形态特征上有明显的区别 根据细胞凋亡和坏死的形态特点 一般认为在细胞坏死早期就会出现细胞膜通透性及线粒体跨膜电位的改变 而在细胞凋亡时这些改变的发生则要晚 一旦线粒体跨膜电位崩溃 则细胞凋亡不可逆转 凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒 JC 1 JC 1ApoptosisDetectionKit 采用一种阳离子脂质荧光染料JC 1作为检测线粒体跨膜电位指示剂 JC 1有单体和多聚体两种存在状态 在低浓度时以单体的形式存在 高浓度时以多聚体形式存在 两者的发射光谱不同 单体在流式细胞仪绿色 FL 1 通道检测出绿色荧光 多聚体在流式细胞仪红色 FL 2 通道检测出红色荧光 JC 1可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内 正常健康线粒体的膜电位 y 具有极性 JC 1依赖于 y的极性被迅速摄入线粒体内 并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体 发射红色荧光 而细胞发生凋亡时 线粒体跨膜电位被去极化 JC 1从线粒体内释放 红光强度减弱 以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光 根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化 凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡 利用凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒 JC 1 进行检测 通过流式细胞仪分析分析结果 正常细胞 FL 1亮 FL 2亮 R1 凋亡细胞 FL 1亮 FL 2暗 R2 R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 早早期凋亡的检测capase3早期凋亡Annexin V FITC PI双染法早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测晚期凋亡 TUNEL 法晚晚期凋亡 DNA含量分析法 原理 细胞凋亡时 核酸内切酶活化 双链DNA会出现许多不对称的断裂点 即产生一系列3 OH的末端 外源性荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶 terminaldeoxynucleotidyltranferase TdT 能够催化外源性荧光素或酶标记的dUTP连接到DNA的3 OH末端 用流式细胞术检测 BrdUrdIncorporation BrdU作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA中 当细胞处于DNA合成期而同时又有BrdU存在时 就会有BrdU掺入新合成的DNA中 只要细胞不消亡 这种BrdU就在胞核的DNA中长期存留 掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体显示 该方法能对细胞周期进行迅速而稳定的测量 而且标记BrdU的细胞只要不受到紫外线照射 对细胞本身没有功能损害 该技术可应用到跟踪检测移植细胞的存活 分化和功能状态 5 Bromo 2 deoxyUridine 5 溴脱氧尿嘧啶核苷 Br dUTP Br dUTP比生物素 荧光素标记的脱氧核苷酸磷酸盐复合物 地高辛更容易掺入到凋亡细胞的DNA中 因为Br dUTP有很强的掺入能力 所以在用荧光素标记的抗BrdU单克隆抗体来检测时 会得到更好的流式细胞信号 未凋亡的细胞因为没有暴露的3 未端 所以不会被检测 TUNELAssay TUNELAssay 早早期凋亡的检测capase3早期凋亡Annexin V FITC PI双染法早期凋亡线粒体细胞膜电位的检测晚期凋亡 TUNEL 法晚晚期凋亡 DNA含量分析法 细胞凋亡时 细胞核 细胞器及细胞膜成分 细胞形态均发生了改变 由于核的改变造成各种荧光染料对凋亡细胞的DNA可染性发生改变 其原理为在凋亡过程中 细胞内核酸酶的释放 将DNA降解 分解成小的片段 在标本制备中的固定处理时 细胞膜的完整性被破坏 使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出 造成总体DNA含量减少 成为亚2倍体 细胞凋亡相关基因蛋白的流式细胞术检测 1 Fas FasL Fas配体 Fas抗原与Fas配体的交联是淋巴细胞诱导靶细胞凋亡的必需途径 它们的异常与免疫相关疾病 肿瘤 移植排斥 病毒性肝炎 肾小球肾炎等多种疾病高度相关 2 p53 p53是细胞周期中的 检查点 分子 其控制着细胞在DNA损伤无法修复时启动细胞的 自杀 进程 p53的缺失或突变已被证明是多种肿瘤 如 乳腺癌 胃肠道肿瘤及肝细胞癌等 发生的重要原因 其表达高低是肿瘤诊断和预后的重要指标 3 Bcl 2 Bcl 2是细胞凋亡的抑制蛋白 其与肿瘤的发生 发展和治疗等有着密切关系 其表达上调是肿瘤诊断的指标和预后的参考 多药耐药 multidrugresistance MDR 是由一种药物诱发而同时对其它多种结构和作用机制完全不同的抗癌药物产生的交叉耐药 既对广泛的结构和功能不相同的抗肿瘤药物产生的耐药 导致某些联合化疗方案失败 肿瘤多药耐药性 multidrugresistanceMDR 检测 P170糖蛋白 MDR基因编码的产物P糖蛋白是分子量约为170Kda的胞膜蛋白 P糖蛋白具有一种能量依耐的跨膜药物外输泵功能 当肿瘤细胞与抗癌药物接触时 脂溶性药物浓度梯度进入细胞 而P糖蛋白则结合药物分子 同时其ATP结合位点连上ATP ATP水解后释放能量将药物从胞内泵出胞外 药物在胞内浓度不断下降 其细胞毒作用因而减弱甚至丧失 出现耐药现象 用流式细胞术检测人肿瘤组织细胞多药耐药基因表达产物P170 摘要 为研究检测人肿瘤组织细胞多药耐药基因表达产物 采用间接标记法 用鼠抗人 单克隆抗体 二抗为 标记兔抗鼠 应用流式细胞仪检测了 例新鲜实体肿瘤组织和一株多药耐药的 细胞株 结果显示 例肿瘤细胞表达 其阳性率为 例未检出表达 其阴性率为 细胞表达 在 例 阳性表达的样本中 有 例阳性表达百分比低于 只有 例高于 提示大多数肿瘤组织细胞表达 阳性率高 但表达 肿瘤细胞表达百分比低 检测肿瘤组织的 表达能为临床治疗提供一个可靠的参考指标 Fluo 3 Am为一新型的高度特异性Ca2 荧光指示剂 可以灵敏地反映细胞内游离钙离子浓度的变化 Fluo 3 Am进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯 成为脂溶的Fluo 3留在细胞内 当Fluo 3与细胞内游离钙结合后 其荧光强度是Fluo 3本身的40倍以上 当用480nm波长激发时 其荧光强度与游离钙离子浓度成正比 细胞内Ca2 浓度测定 检测淋巴细胞引起的细胞毒作用 细胞毒性淋巴细胞 包括细胞毒性T细胞CTL和自然杀伤细胞NKC 能释放包含穿孔素蛋白和颗粒酶的颗粒或通过Fas Fas连接作用于靶细胞 引起靶细胞内Caspase酶激增 导致细胞死亡包括凋亡 具有重大研究和应用价值 流式细胞术测定细胞毒作用 FCC 利用Caspase专一性荧光底物测定受害细胞的细胞毒作用强度 准确简便迅速 DNA RNA的测定 临床研究 淋巴细胞亚群测定造血干细胞研究肿瘤相关基因表达研究血小板分析白血病和淋巴瘤免疫分型HLA B27分析PNH诊断 淋巴细胞亚群测定 淋巴细胞担负着免疫的主要功能 淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测 临床经常测定的淋巴细胞亚群包括T淋巴细胞 CD3 T辅助细胞 CD3 CD4 T抑制细胞 CD3 CD8 B淋巴细胞 CD19 或CD20 NK细胞 CD3 CD56 等 1 首先用CD3来区分全部T细胞 CD3 CD4双阳性的细胞为真正的辅助 诱导性T细胞 这些细胞主要是HIV病毒感染对象 在HIV感染后 随着疾病的发展出现免疫抑制后 这群细胞会明显减少 在临床中 对HIV的监测主要依靠检测这群细胞的数量 2 CD3 CD4 细胞群体是由单核细胞组成的 这些细胞相对于CD4 和T细胞来说弱表达CD4 在光散射参数的位置分布也较广 CD3 CD4抗体组合能完全将CD4阳性辅助 诱导性T细胞与CD4阳性的单核细胞区分开来 因为CD4 T细胞能与单核细胞完全分离 故在光散射坐标上设淋巴细胞 门 时 门 可设得大一些 即使包含了单核细胞或其他细胞都不会影响检测值 细胞表型的检测 淋巴20 25 T 70 B 20 NK 10 单核2 6 粒细胞 40 60 淋巴细胞亚群分析 淋巴细胞是免疫系统中执行免疫功能的重要细胞 各种白细胞分化抗原 CD 分子广泛分布在T细胞 B细胞 自然杀伤细胞等免疫细胞 免疫细胞表面标志改变与细胞的活化和功能的改变有着密切关系 不同类型免疫细胞间的比例也对机体免疫功能具有重要的影响 而这些变化与临床疾病的病理变化密切相关 PeripheralWhiteBloodCellsCD45 1 Th细胞 CD3 CD4 CD8 T细胞 能辅助B细胞分化成熟 产生抗体 参与促进细胞介导的免疫应答 一 淋巴细胞及其亚群分析 2 Tc细胞 CD3 CD4 CD8 T细胞 能特异性直接杀伤靶细胞 所有表达MHCI类分子的靶细胞 抗肿瘤免疫 抗病毒感染 移植排斥反应和自身免疫疾病中均起了重要作用 B细胞膜表面免疫球蛋白 Smlg 表达CD19 CD20 CD21 CD22分子 B细胞也是免疫系统重要的免疫细胞 主要功能是介导体液免疫 二 B淋巴细胞及其亚群 NK细胞为一组大颗粒的淋巴细胞 标志CD16 CD56 CD2 CD11a CD18 CD3 CD16 CD56 淋巴细胞定为NK细胞 主要功能是参与细胞免疫 在肿瘤免疫抗病毒感染中均起重要作用 三 NK细胞分析 淋巴细胞亚群检测的临床意义 总T和总B及其亚群的意义总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 对CD4 和CD8 T细胞的测定有助于免疫缺陷疾病 自身免疫性疾病 移植排斥反应的监测 CD4 CD8的意义评价自身免疫失调 免疫失调或免疫缺陷病病人的免疫状态 自身免疫病比值升高 病毒感染 肿瘤 再障比值降低 NK细胞的意义NK 7 40 细胞能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用 HIVANDAIDS 细胞内因子的检测 Th1 Th2细胞 PMA 佛波脂 Ionomycin 依诺霉素 刺激4 6hr 流式细胞细胞因子分析图 肿瘤相关基因的表达 P53 Bcl 2 P53控制着在DNA损失无法修复时启动的 自杀 进程 P53的缺失或突变已被证明是多种肿瘤发生的重要原因 它表达的高低是肿瘤诊断及预后的重要指标 Bcl 2是细胞凋亡的抑制蛋白 其与肿瘤的发生 发展和治疗等有着密切的关系 表达上调是肿瘤诊断的指标和预后的参考 nm23与多种肿瘤的转移及预后相关 造血干祖细胞检测 CD34 造血干 祖细胞的检测 主要用于干细胞移植及基因治疗方面的检测 上图中红色群体是经过多参数设门后精确设定的CD34阳性细胞群体 绿色部分是进行定量计数的标准微球 血小板的测定 白血病和淋巴瘤免疫分型 正常白细胞在其分化过程中 随着系列的不同 成熟阶段的差异 会在细胞膜表面表达不同的分化抗原 白血病细胞则在癌变的过程中 丧失了正常细胞的系列专一性和分化阶段规律性 在本质上有别于正常骨髓细胞 应用此特点可进行免疫