【毕业学位论文】（Word原稿）羊痘病毒P32基因的克隆、表达及多重PCR诊断方法的建立预防兽医学论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 羊痘病毒 因的克隆、表达及多重 32 of 32 of I 摘 要 羊痘（ 由羊痘病毒（ 起的绵羊和山羊的一种急性、热性、接触性传染病，被世界动物卫生组织（ 为 A 类传染病，在我国被列为一类动物疫病。羊痘病毒属痘病毒科（ 脊椎动物痘病毒亚科（ 羊痘病毒属（ 成员。羊痘病毒 白是位于羊痘病毒膜表面的主要结构蛋白，含有中和抗原表位，是目前世界各地分离、鉴定的所有羊痘病毒毒株所共有的且特异性很强的羊痘病毒结构蛋白。 针对羊痘病毒 反向末端重复序列结构中的一段基因和 白基因 分别设计一对引物，进行增，扩增产物分别为 289969过对实验条件的优化，建立了诊断羊痘病毒的多重法。 经试验证实该法具有良好的特异性和敏感性， 可用于对羊痘病毒进行快速诊断。 本研究应用 术扩增了 羊痘病毒 白基因 ，连接于 体， 再将目的基因插入到表达载体 ，经 切及测序 鉴定 ，成功构建了重组表达 质粒 导，目的基因在大肠杆菌中以包涵体形式得到表达，目的 蛋白的分子量为 58能够与羊痘血清反应 。利用电洗脱方法对表达蛋白进行纯化， 法检测纯化重组表达蛋白的活性，证明 纯化后的 表达蛋白 依然保持了与羊痘标准阳性血清的良好 反应 原 性。 关键词： 羊痘病毒； 因；表达；多重 a in is as is of of of on It is of is in in to of of 289bp 69bp by In to a of of By to PV 0-7 32 of CR to 32 NA of 832 be by It 32 be of by of 录 第一章 前 言 . 3 第二章 文献综述 . 5 原 . 5 痘病毒基因组 . 5 痘 的发病机理和临床症状 . 8 理变 化 .断方 法 . 6 疫苗及免疫 .三章 羊痘病毒 测方法的建立 .料 . 13 法 . 14 果 .论 . 19 第四章 羊痘病毒 因的克隆及 其 在大肠 杆菌中的表达 .料 .法 . 25 果 .论 .五章 结论 .考文献 . 46 致谢 . 51 作者简历 . 52 1 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 苄青霉素 基对 血清蛋白 胞病变 ,3,3氧胆酸 磷酸脱氧核苷 氧核糖核酸 化乙锭 二胺四乙酸 联免疫吸附试验 肠 埃希氏杆菌 胱苷肽 h 时 丙基硫代 千个碱基 B 培养基 克隆抗体 钟 NC 酸纤维素膜 密度 放阅读框 苯二氨 际动物 卫生组织 el 丙烯酰胺凝胶电泳 酸盐缓冲液 合酶链式反应 糖核酸酶 2 r/速每分钟 s 二烷基磺酸钠 二烷基肌氨酸钠 羟甲基胺基甲烷 甲基乙二醇 向末端重复序列 43 g 克 L 升 mL 升 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 3 第一章 前言 羊痘（ 称“羊天花”，包括山羊痘和绵羊痘，是由羊痘病毒属的山羊痘病毒或绵羊痘病毒引起的山羊或绵羊的一种急性、热性、接触性传染病。其特征是体温升高，精神不振，食欲废绝，全身性丘疹或结节、水疱，口唇、舌面、鼻镜、乳房、会阴及尾根处可见大小不等的痘疹。羊痘在非洲中北部、亚洲中部和西南部以及印度大部分地区呈地方性流行，我国及与我国接壤的一些周边国家均有本病的发生。近年来，羊痘在我国南北省份均有流行，如黑龙江 (张前群 ,马承俊 ,2004)、吉林 （ 邓继军 ,周霞 ,2004） 、河北 (林敏 ,倪凤娥 ,2003)、福建 (廖振续 ,1997)、甘肃 (王殿军 ,1995)、贵州 (王开功 ,2003)、江西 (王效田 ,2001)、青海 (才旦 ,2004)、内蒙古 (敖特根夫 ,2002)等省。该病发病率高， 传播迅速， 可导致妊娠母羊流产，羔羊死亡，一旦暴发即造成巨大的经济损失，严重威胁了养羊业的发展。我国是畜牧业大国，也是养羊大国，预防和控制羊痘的发生与流行，对我国的经济和社会有着重要的意义。 羊痘病毒在分类上属于痘病毒科（ 索动物痘病毒亚科（ 的羊痘病毒属（ (et 1996)。羊痘病毒属包括绵羊痘病毒（ 山羊痘病毒（ 疙瘩皮肤病病毒（ 羊痘病毒是双股 毒，在细胞浆内复制 。电镜下观察 呈椭圆形，大小为 167292爱珍 ,2001)。 病毒中央由 蛋白质组成的核心，核心凹陷，两个侧体分别位于凹陷内。一层栅栏状的核心膜紧贴于核心周围。核心和侧体一起，由脂蛋白性表面膜包围，其间充填着可溶 性蛋白。羊痘病毒有结构复杂的囊膜，囊膜内含有病毒特异的蛋白质。 羊痘病毒为线形 双股 毒，其基因组大约为 150大约有 75%A T， 共有 147 个开放阅读框（ 和其他痘病毒一样，羊痘病毒基因 组 包括中间编码区和两端相同的反向末端重复序列（ 基因组的中间区域（ 与其它病毒同源的保守序列， 所编码的蛋白参与病毒复制，包括病毒的转录、 饰、 胞外被蛋 白膜包裹成成熟的病毒粒子等过程 (et 001)。与在疙瘩皮肤病 病毒 基因组上发现的相似基因一样，羊痘病毒基因组两端的基因序列（ 是与病毒毒力和宿主范围相关的基因 (et 2001)。这些基因序列包括一个基因家族（ 5 个与 复基因和 3 个 复基因）及其它与病毒修饰或逃避宿主细胞免疫识别和反应的相关基因和 负责编码胞质分裂丝蛋白、白细胞介素及痘病毒所特有的致病蛋白、宿主范围 蛋白 的 基因 等 (et 2002)。 山羊痘病毒和绵羊痘病毒基因组的同源性非常相近，高达 96%。有研究表明，两种病毒基因在自然条件下可能发生重组 (et 1998)。山羊痘病毒和绵羊痘病毒的氨基酸以及 氨基酸序列上山羊痘和绵羊痘之间差异较大的基因都在基因组的末端。 羊痘病毒的 白 由痘苗病毒 源的基因所 编码 ，是羊痘病毒基因组的 段的一部分 (et 1999)。 段含有 5 个 痘苗病毒的因同源 (et 1986)。 白是位于羊痘病毒 囊 膜表面的一中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 4 种主要结构蛋白 (et 1994)，分子量为 32是羊痘病毒属特有的蛋白，含有主要的抗原表位，在病毒感染早期产生抗体。针对该蛋白的单一血清可以中和羊痘病毒，这表明 可强烈的诱导细胞免疫 (et 1993)。羊痘病毒的附着蛋白基因具有羊痘病毒属的特异性，可作为 断的 目的基因 ( 7 个纵向串联的重复序列，是病毒增殖的非必需基因，在羊痘病毒基因组的末端形成了发卡结构，具有较强的保守性 (et 1989)。羊口疮与羊痘在临床上最容易混淆，因此以 目的基因做 测可以区分这两种病毒。 根据 发病动物临床症状和流行病学特征 可对羊痘 做出初步诊断 。绵羊和山羊的临床症状 相似，很难区别。要确诊须进行病原检测、病毒中和试验和酶联免疫吸附试验。目前国内的一些方法如病原分离、电镜观察等较为耗时、费力，有的还无法确诊。羊痘病毒的分离是一个比较长的过 程，因为病毒在细胞上生长缓慢，一般 10 天后才出现比较理想的 了适应诊断需求，我们需要建立一种快速、简便并且准确的诊断方法。 羊痘病毒 白是目前世界各地分离、鉴定的所有羊痘病毒毒株所共有且特异性很强的结构蛋白 (林敏 ,2002)。在国外， 白已经用于羊痘病毒抗体的检测，以重组 白作为抗原的间接 测感染后的羊痘病毒抗体要比中和试验结果得到的早。澳大利亚动物卫生实验室的研究人员 H. G. (et 1999)在大肠杆菌中克隆并表达了 构蛋白，研 究发现在大肠杆菌中表达的全长 原和不同片段表达水平及表达 产 物的可溶性不同。经切割的因片段虽然表达量比全长 因要高，但是其在 的反应性较差。全长的 因表达的多聚组氨酸融合蛋白最适于作为 应中的抗原。纯化的蛋白活性保持不变，而且和绵羊痘病毒感染的血清反应性很强。将 白用于 法进行对羊痘的诊断，其敏感性和特异性都远远高于传统方法，并且可以进行批量样品的检测。 在国外，已成功利用多重 法从活体组织、组织培养物中检测出羊痘病毒 (et 1998)。因为羊痘病毒属于双股 毒 ,故更适于 测。根据 人的研究，在羊痘基因组末端有一个末端反向重复序列（ 具有较强的保守性 (et 2000)。用一对以上的直接针对基因组不同区域的引物能够 极大的提高检测方法 的敏感性和特异性。 本试验根据羊痘基因组末端反向重复序列 和 白基因分别 设计两对特异性引物， 扩增片段大小分别为 289 969初步建立了检测羊痘病毒的多重 法。同时，对羊痘病毒 达，获得了 重组抗原， 为 建立检测羊痘抗体的 断方法 奠定了基础 。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 文献综述 5 第二章 文献综述 羊痘（ 由羊痘病毒（ 起的一种可以感染山羊、绵羊的急性、热性、接触性传染病。特征是发热、无毛或少毛部位皮肤黏膜发生丘疹和疱疹，内脏病变（特别是肺），乃至死亡。根据不同毒株的毒力差异，易感羊群的致死率可达 10% 75%等，羔羊致死率高达 100%，妊娠母羊极易流产，受感染的羊群生产力也大大下降，造成巨大的经济损失。 该病的流行已 有很长的历史，现主要分布在北非和 中非、印度次大陆 。 是危害养羊业最为严重的传染病之一。该病已被世界动物卫生组织（ 为 A 类重大传染病，我国也将其列为一类动物疾病。 病原 羊痘病毒属于痘病毒科（ 脊椎 动物痘病毒亚科（ 的羊痘病毒属（ (et 1996)，可引起山羊痘（ 绵羊痘（ 牛的疙瘩皮肤病（ (et 2002)。羊痘病毒是一种亲 上皮性的病毒，是唯一在细胞浆中复制的有囊膜的双股 毒，呈椭圆形，大小为 167292病毒大量存在于病羊皮肤和粘膜的脓 疱 及痂皮中，适合在 绵羊的睾丸、肾、肺和甲状腺单层细胞上培养繁殖，能使细胞产生病变（ 在发育的鸡胚绒毛尿囊膜上亦可繁殖。其抵抗力表现 为 对热敏感， 50以上很快使其失去感染力，在 3%的石炭酸、 5%的甲醛、 2%硫酸、 10%的高锰酸钾中几分钟即被 杀死。本病毒对 10%漂白粉、 2%的硫酸锌溶液有一定的抵抗力 (孟日 ,2005)。 羊痘病毒基因组 羊痘病毒属包括绵 羊痘病毒（ 山羊痘病毒（ 疙瘩皮肤病毒（ 分别引起绵羊痘、山羊痘和牛的疙瘩皮肤病。三者之间关系紧密，同源性高。 因组 通过对多株 因组测序表明绵羊痘和山羊痘的基因 组 大约在 150间，大约含有 75%的 A T(et 1998)。像其它痘病毒一样， 因组含有一个中央编码区，在其两端各有一个同源的末端倒置重复区（ 大约含有 2000 个核苷酸，不同的毒株有的碱基数目不同。根据 已知的基因组末端区域的数据表明痘病毒的串联重复序列在性质和大小上是有差异的。值得注意的是，所有的 株在靠近末端开放阅读框的串联重复区里含有 46碱基，而 虽然已经将 全测序，但是没有发现末端串联重复区 (et 1989)。对比实验和发表的限制性片段数据分析表明在所有的基因组中都有不少于 200额外末端重复序列和发卡环状序列。 山羊痘病毒（ 绵羊痘病毒（ 线形、双股 毒， 二者 同源性非常相近，高达 96%。基因组共有 147 个开放阅读框（ 编码密度为 93%，所编码的蛋白为 3氨中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 文献综述 6 基酸不等。基因组中间的区域（ 24与其它病毒同源的保守序列，其所编码的蛋白参与病毒复制，包括病毒的转录、 饰、病毒 复制以及在胞内组装成熟、在胞外被蛋白膜包裹成成熟的病毒粒子等过程。与在疙瘩皮肤病上发现的相似基因一样，羊痘病毒两端的基因序列（ 01 是与病毒毒力和宿主范围相关的基因。这些基因序列包括一个基因家族（ 5 个与 复基因和 3 个 复基因）及其 它与病毒修饰或逃避宿主细胞 免疫识别和反应相关的基因和 负责编码胞质分裂丝蛋白、白细胞介素 及痘病毒所特有的致病相关蛋白和宿主范围相关 蛋白 基因 等 (et 2002)。 因组比较 基因组水平上高度相近，但是系统发生树仍然不同。从一个给定的物种特异的宿主范围，痘病毒系统分组可以发现痘病毒物种特异宿主范围的遗传背景，山羊痘病毒和绵羊痘病毒的起源可以经过染色体限制片段模式分析来区分 (et 2002)。 外分离株证实平均氨基酸差别为 4%。 26 个 于在 或者在起始密码子和终止密码子内插入或删除氨基酸而大小 不同 （ 1氨基酸）。 有一个90 个氨基酸的 它和 羧基末端是同源的。这个 没有。 7 个相似性少的 有三个和黏液瘤病毒（ 21）、痘苗病毒（ （ 1力因子（ 似，其它 4 个在大小方面有差别（ 4 到 14 个氨基酸），而且包括一个痘病毒特异的 和后转录因子 4（ 130R（ 一个像免疫球蛋白的 域蛋白（ 源 (et 2002)。 绵羊痘病毒、山羊痘病毒和疙瘩皮肤病病毒（ 较 将 9 个有可能和病毒毒力、宿主范围功能有关的基因在 破坏，经过插入、 删除、替代的基因包括一个 异的基因（ 体（ 液瘤病毒）（ 痘病毒） 11L（ 和 7L（ 似的基因 (989)。在因中，这些受到影响的基因高度片段化，相对于 一个 4 到 23 个潜在的移码核苷酸变化。在 9 个 因组区域中和 关的基因组变化的数目相对于整个基因组剩余部分（每 100 个碱基平均 核苷酸插入 /删除位点）的变化要相对高（每 100 核苷酸插入 /删除位点）。虽然 高度片段化，预测蛋白的三分之二在 对于 据几个 因被破坏的始祖性质的可能性，利用已有的数据表明，在 先适应于绵羊和 /或山羊期间，发生了基因破裂和序列的分歧。 在 发生广泛破裂的 9 个 可能导致功能性的失活。 在 9 个破坏的基因中，只有因（ 与已知功能的基因互为直向同源基因，包括 R 同源物，结合、灭活宿主 l 来影响病毒毒力的分泌蛋白， 有 3 个 域，有个 士学位论文 第二章 文献综述 7 结合蛋白可能相似的功能。在 ， 破坏可能影响病毒调节宿主 导的反应的能力。 2L 相似，一个 病毒对 以前描述过的痘病毒基因家族有着有限的相似性，包括 53R，一个和宿主细胞 体介导的细胞内信号是敌手的基因家族 (et 2000)。 缺少这些基因，有可能影响 力和宿主范围并且表明在牛宿主范围中对毒力和宿主范围有特异的作用。 构蛋白基因 羊痘病毒的 白 由与痘苗病毒 源的基因所编码 (993)，是羊痘病毒基因组的 ,段的一部分 (999)。 ,段含有 5 个 痘苗病毒的 因同源 (986)。 白是位于羊痘病毒膜表面的一种主要结构蛋白 (et 1994)，分子量为 32是羊痘病毒特有的蛋白，含有主要的抗原表位，在病毒感染早期产生抗体。针对该蛋白的单一血清可以中和羊痘病毒，这表明 白具有中和表位。它可诱导强烈的细胞免疫 (et 1993)。 研究发现，利用 构蛋白，可以区分绵羊痘病毒和山羊痘病毒。 构蛋白和痘苗病毒 因编码的 白是相似的。 白在装配成熟病毒粒子、病毒毒力、 免疫原性等方面起主要作用 ( 测序表明， 32 的结构基因全长 969码 322 个氨基酸； 构基因全长 972码 323 个氨基酸。对比推导的氨基酸序列证实， 白具有高度保守性。用 消化 因， 生三个片段（ 300， 327， 400 生两个片段（ 327， 697这样 就可以用 鉴定山羊痘与绵羊痘病毒 (et 2004)。 构基因序 列比较 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 文献综述 8 通过对比现有的痘病毒序列资料，在所有的 株中， 163 位有一个特别的天门冬氨酸密码子，然而其它痘病毒在相同的位置缺少此密码子。相对于其它痘病毒，所有山羊痘病毒在 77位、 867 位、 964 位出现 G 碱基的置换，在 275 位、 403 位、 552 位出现 T 碱基的置换，这些特征可以看作是 信号。在 186 位、 654 位、 672 位出现 A 碱基的置换，在 395 位、 664 位出现 657 位出现 G 碱基的置换，在 401 位出现 T 碱基的置换可以看作是 特征 。相似的，在 147 位出现 T 碱基的置换，在 910 位 出现 G 的置换可以看作是 特征 。这些差别大多数出现在基因组的 5端。 另外，通过对比推导的氨基酸序列，发现： 独特的置换，即： 289I、 其它痘病毒却没有出现这种置换。同样， 现了这种置换。在 也出现了一些独特的置换，包括 般来说，这些变化主要出现在 N 末端区域。因为 C 末端有可能在接近病毒膜表面并有可能暴露 于 宿主免疫细胞。对比序列发现， 遗传性上非常相近，可能和 所有的半胱氨酸胺残基有关 (et 2004)。 羊痘的发病机理和临床症状 病毒对皮肤和黏膜上皮细胞具有特殊的亲和力，无论通过哪种感染途径侵入机体的病毒，都经过血液到达皮肤和黏膜，在上皮细胞内繁殖，引起一系列的炎症过程而发生特异性的痘疹，即丘疹、水疱脓疱和结痂等病理过程 (丁打海 ,1997)。羊痘病毒在细胞内繁殖，且大部分以裸露的形式留在细胞内，病毒感染通过被感染的巨噬细胞和血液中的胞外衣壳病毒随血液到达皮肤和黏膜。在此过程中，病毒可有效避免接种疫苗所 产生抗体的中和，抗体并不能阻止病毒在感染细胞内复制。自然感染潜伏期一般为 6，长的达 16 天。病羊以体温升高为特征（可达 41，精神不振，食欲废绝，鼻黏膜和眼结膜潮红，有浆液性 分泌物 ，后转为黏液脓性鼻涕从鼻孔流出，呼吸、脉搏增速，寒颤。约 1开始发生痘疹，开始为红斑， 1后形成丘疹，突出于皮肤表面，坚实而苍白，随后丘 疹逐渐扩大， 变成灰白色或淡红色、半球状的隆起结节。结节在 2疱内容物逐渐增多，中央凹陷，呈脐状。 在此期间，羊体温稍下降。不久水泡变为脓性，不透明，形成脓疱、化 脓。如无继 续感染，几日内脓疱干瘪为褐色痂块，脱落后遗留下灰褐色瘢痕而痊愈。 整个病程 14。该病会混合感染传染性胸膜肺炎或化脓性乳房炎，使怀孕后期的母羊流产 (俞乃胜 ,2000)。本病也有非典型经过，良性经过的称顿挫型，有的形成“石痘”，有的形成所谓的“臭痘”和“坏疽痘”，又有的形成“出血痘或黑痘” (孙悦 ,2003)。 病理变化 体表病变 体表呈现典型的痘斑病变，口唇、舌面、鼻镜、乳房、会阴及尾根无毛处可见大小不等的痘疹，较为严重的有溃疡灶 (王开功 ,2003)。 检变化 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 文献综述 9 在前胃或皱胃的 黏膜 上往往有大小不等的圆形或半圆形坚实的结节，单个或融合存在，严重的引起前胃 黏膜 糜烂或溃疡，咽和支气管 黏膜 也常有痘疹，呼吸道黏膜有出血性炎症，有时增生性病灶呈灰白色，圆形或椭圆形，直径约 1气管及支气管内充满混有血液的浓稠黏液。肺部干酪样结节和卡他性 炎区，淋巴结肿大，与腺瘤很相似，多发生在肺的表面，切面质地均匀，但很坚硬，数量不定，性状一致，特别是肺膈叶，有许多直径长达 5硬块，在这种病灶的周围有时可见充血和水肿等。有继发病症时，肺有肝变区。肠道黏膜少有痘疹变化。此外常见细菌性败血症 变化，如肝脂肪变性、心肌变性、淋巴结急剧肿胀等。 显微病理变化 皮肤、瘤胃的鳞状上皮细胞和肺上皮细胞明显水肿，胞浆稀疏。线粒体肿胀变圆，内质网扩张，可见小泡状增生。高尔基复合体扩张，甚至破裂解体。胞浆内有大量散在的多为卵圆形的成熟病毒颗粒，有的细胞中可见到病毒包涵体形成；个别细胞胞浆内可见角质丝。皮下组织可见巨噬细胞和中性白细胞浸润。巨噬细胞的线粒体肿胀，内质网扩张，胞浆内可见数量不等的病毒颗粒。有时可见细胞的裂解和细菌的并发感染。毛细血管内皮细胞肿胀，亦有线粒体肿胀，内质网扩张的现象，胞浆内也可见 少量的病毒颗粒。有髓神经纤维可见轴索变性呈空泡状，神经膜细胞肿胀，胞浆稀疏，线粒体肿胀，溶酶体增多，胞浆内有少量病毒颗粒，也有一些成熟的病毒颗粒游离于神经膜细胞外。神经外膜和神经内膜之间有巨噬细胞浸润，其内有大量病毒颗粒散在 (许乐仁 ,2003)。 诊断方法 本病仅羊感染发病，故根据临床症状、病理变化，并结合其流行情况，可做出初步的诊断。但对于隐性感染或是非典型病例不能确诊，还需进行相应的实验室诊断。 血清学诊断 琼脂免疫扩散试验（ 早在 1963年 et 1963)。 1997 年 用绵羊痘病毒的可沉淀抗原进行琼脂扩散试验提高了该试验的有效性。另外， 1986 年 用 35 s 甲硫氨酸标记沉淀抗原极大地提高了琼扩试验在绵羊痘抗体检测 中 的敏感性 (et 1986)。 对流免疫电泳（ 被用于各种病毒抗原和抗体的检测，它比 快速、敏感。 1985 年 立了对流免疫电泳快速诊断绵羊痘的方法，该法不仅可检测出感染后 45 d 的患畜血清中的抗体，而且还能检测出患病绵羊的皮肤痴皮、肺脏病灶、肝脏病灶中的抗原 (et 1985)。 1999年 设计电泳时用巴比妥缓冲液代替普通的盐溶液极大地提高了 敏感性 (et 1999)。由于 够检测出感染绵羊痘病毒的绵羊脏器中的病毒，因此也常被实验室人员们中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 文献综述 10 用做一种快速检测绵羊痘的方法。 乳胶凝集试验（ 在 ，乳胶颗粒作为抗原的载 体，抗原很容易吸附在乳胶颗粒上，且 有快速、简便和不需要昂贵的设备等优点。 因此， 在被广泛的应用于抗原一抗体的检测试验中。 1996年 应用该方法对田间收集的山羊痘血清样本进行检测，证明该方法比 感 (et 1996)、方便。 1997 年 人经实验证明该方法也可用于绵羊痘的检测。 反向间接血凝试验 ( 反向间接血凝试验应用致敏的绵羊红细胞在实验室诊断绵羊痘病很有效 。 1997 年 可 在绵羊痘的诊断中取得较好的效果(997)。 2005 年，贵州大学的王开功等人以兔抗山羊痘病毒 敏绵羊红细胞，采用反向间接血凝试验检测山羊痘病毒抗原，并通过对贵州省 8 个疫区现场采集山羊痘待检抗原的检测结果表明，该方法阳性检出率达 7/8），与琼脂扩散试验（ 性检出率为 50%（ 4/8）相比较 感性比 ；同时通过对山羊痘野生强毒 H 细胞培养物进行检测，就可检出 价，而 不能检测 (王开功 ,2003)。一些凝集试验如协同凝集试验、 被动 血凝试验和点凝集试验也常有助于绵羊痘的快速诊断，协同凝集试验以蛋白质 A 的一球蛋白的粘附力为基础，蛋白质 A 是存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁上的一种不含糖的蛋白质。 迹试验 迹是以羊痘病毒感染的细胞溶解物检查血清样品中病毒结构蛋白的特异性抗体 ,将细胞溶解物离心后，与蛋白样品及标准分子量蛋白 时进行 泳。再将凝胶中蛋白转移到硝酸纤维膜上，然后染色观察。该法具有较高的灵敏性和特异性，但该试验价格昂贵、操作难度大 (et 1994)。 酶联免疫吸附试验 ( 已被广泛的应用于各种抗原抗体的检测试验中，各种类型的 有助于绵羊痘的诊断。 1988 年 用绵羊痘痂皮制成粗制抗原利用间接 法进行绵羊痘抗体的检测获得成功，但该试验本底高易出现假阳性结果 1。 应用纯化的 具有较强抗原性 的 重组蛋白做抗原进行 可提高其敏感性。 1999 年 羊痘病毒 抗原进行 得成功。但是 ， 由于该方法抗原制备难度大，常常限制了 绵 羊痘诊断中的广泛应用 (et 1999)。 1997 年 人建立了免疫捕获该方法以兔抗绵羊痘病毒的高 免血清为捕获抗体，同时检测到了绵羊痘和山羊痘痂皮中的痘病毒抗原。 人认为免疫捕获 以作为绵羊痘和山羊痘的共同的检测方法，但该方法单独使用时存在一定的限制，需要与 验共同应用才能确诊 (许乐仁 ,2003)。近年来，方 法成为绵羊痘诊断的有益补充，而且该方法更简便，眼观即可判定结果。 1998 年中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 文献综述 11 经成功的应用 行山羊痘抗体的检测并取得了满意的结果， et 1998)。最近， 被用于绵羊痘抗体的检测中，该方法运用绵羊痘的可溶性抗原片断，极大地减小了 本底反应，并且可有效地应用于绵羊痘免疫效果的评价和流行病学调查中。 聚合酶链式反应（ 术是以特异性引物扩增特定的 段。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。 特异性好，灵敏度高，简便快速，对检测样品要求低。该技术 既可用于序列测定鉴定特异病毒，又可用于血清型鉴定和分子流行病学研究。 此外，它还可以检测灭活的核酸片段， 2时内便可得到检测结果。 1999 年 O. 基于山羊痘病毒的基因组中末端反向重复序列设计引物鉴定 了 在细胞培养的 绵羊痘病毒 (999)。 定皮肤悬浮物中的病毒非常敏感，但与绵羊痘同属的各病毒的鉴别诊断还不十分容易，各国学者们正尝试着通过对 增产物进行限制性分析，可能有助于山羊痘病毒属的各病毒的鉴别诊断。 近