C反应蛋白基因单核苷酸多态性与脓毒症易感性及严重程度的关系.doc

C反应蛋白基因单核苷酸多态性与脓毒症易感性及严重程度的关系 浙江中西医结合杂志2019年第29卷第10期Zhejiang JITCWM（Vol.29No.102019）C反应蛋白基因单核苷酸多态性与脓毒症易感性及严重程度的关系唐玉霞1单国勇2狄君斐1关键词C反应蛋白；单核苷酸多态性；脓毒症脓毒症是一种由感染引起的危及生命的系统性炎症反应综合征1。 炎症反应的程度与脓毒症的预后密切相关。 C反应蛋白（CRP）是脓毒症的重要生物标志物，可反映炎症反应和败血症的严重程度2-3。 CRP基因的遗传变异在血管损伤中发挥作用，而血管损伤可能是脓毒症引起的微血管功能障碍的基础4-5。 然而，CRP基因多态性与脓毒症易感性和严重程度的相关性尚不明确。 基于此，本研究探讨CRP基因rs1205位点和rs3093062位点与脓毒症的易感性和严重程度之间的关系，报道如下。 1资料与方法1.1一般资料选择xx年5月xx年8月期间浙江省台州市中西医结合医院普内科收治的125例脓毒症患者作为研究组，年龄2375岁，其中一般脓毒症患者72例，急性生理与慢性健康评估II（APACH II）（16.544.47）分；严重脓毒症患者53例，APACH II（22.355.12）分。 根据研究组患者的年龄、性别等匹配招募同期健康体检者125名作为对照组。 本研究经医院伦理委员会审核通过，所有受试者均签署知情同意书。 1.2纳入与排除标准纳入标准 （1）符合xx年美国危重病医学会/美国胸科医师学会制定的脓毒症的诊断标准6； （2）年龄18岁； （3）临床病历资料完整。 排除标准 （1）年龄18岁； （2）孕妇或处于哺乳期的妇女； （3）严重的脏器功能异常； （4）患免疫系统疾病； （5）肿瘤患者。 1.3基因分型所有受试者均抽取4mL静脉血，其中2mL采用EDTA抗凝后使用天根生化科技（北京）有限公司的血液基因组提取试剂盒（DP318，规格50次）提取基因组DNA，保存于-20冰箱。 利用Primer5.0软件根据NCBI（s:/.ncbi.nlm.nih/snp/term=）数据库中相应SNP位点序列信息设计引物，引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。 rs1205位点的引物序列为上游5-AGGGGACTCTTGGAC-AGGTT-3，下游5-TTATGGACTTTGGGAGTGAG-AC-3；rs3093062位点的序列为上游5-CAAACT-CTATGATTTGGGCTGAAGT-3，下游5-ACGAGT-GGCCATCTGGGTG-3。 PCR扩增体系为20L，模板基因组DNA25ng，10PCR buffer2L，25mmol/L的Mg2+1.5L，10mol/L dNTP1L，10pmol/L的上、下游引物各1L，0.25L DNA聚合酶，用无菌水补足至20L。 PCR反应条件为95，5min；94，20s；60，30s；72，30s，35个循环；72，5min；4保存。 PCR完成后将PCR扩增产物纯化，然后将纯化产物送上海生工生工生物工程技术公司进行测序，结果见图1。 1.4血清CRP蛋白水平检测将剩余的2mL全血3000r/min离心20min，取上清，保存于-70冰箱。 血清CRP检测试剂盒采用abcam酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（货号ab99995，批号xx03021）检测，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。 1.5统计学方法应用SPSS20.0软件进行数据统计，计量资料以均数标准差（xs）表示，采用t检验，计数资料以频数n（%）表示，采用2检验。 基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡采用2检验。 采用2检验分析等位基因和基因型频率的差异，并估计比值比（OR）和95%置信区间（CI），P0.05），具有可比性。 2.2CRP基因单核苷酸多态性（SNP）与脓毒症易感性CRP基因rs1205位点和rs3093062位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡（P0.05）。 CRP基因rs1205位点基因型频率在研究组和对照组之间差异有统计学意义（2=6.64，P=0.04），该位点TT基因型是脓毒症的危险因素（OR=3.02，95%CI=1.187.87，P=0.01），研究组rs1205位点T等位基因频率显著高于对照组（2=5.05，P=0.03），该位点T等位基因是脓毒症发生的危险因素（OR=1.53，95%CI=1.04-2.25，P=0.03）。 研究组和对照组CRP基因rs3093062位点不同基因型频率之间的差异有统计学意义（2=18.30，P0.01），GA和AA基因型是脓毒症的危险因素（OR=2.68，95%CI=1.194.83，P0.01；OR=4.18，95%CI=1.5911.29，P0.01），研究组rs3093062位点A等位基因频率显著高于对照组（2=19.51，P0.01），该位点A等位基因是脓毒症的危险因素（OR=2.43，95%CI=1.603.70，P0.05），见表2-3。 2.4CRP基因多态性与脓毒症严重程度相关性不同严重程度脓毒症患者CRP基因rs1205位点和rs3093062位点基因型频率之间比较，差异有统计学意义（P0.05），CRP基因rs1205位点TT基因型患者的脓毒症较为严重，CRP基因rs3093062位点AA基图1CRP基因rs1205位点和rs3093062位点测序结果注AC为rs1205位点CC、CT、TT基因型；DF为rs3093062位点AA、GA、GG基因型；CRPC反应蛋白SNPrs1205基因型CCCTTT等位基因CTrs3093062基因型GGGAAA等位基因GA表1CRP基因rs1205位点和rs3093062位点基因型和等位基因频率例（%）研究组（n=125）47（37.60）56（44.80）22（17.60）150（60.00）100（40.00）49（39.20）56（44.80）20（16.00）154（61.60）96（38.40）对照组（n=125）58（46.40）58（46.40）9（7.20）174（69.60）76（30.40）82（65.60）35（28.00）8（6.40）199（79.60）51（20.40）P值0.520.010.030.010.010.01OR（95%CI）1.00（reference）1.19（0.682.10）3.02（1.187.87）1.00（reference）1.53（1.042.25）1.00（reference）2.68（1.194.83）4.18（1.5911.29）1.00（reference）2.43（1.603.70）2值6.645.0518.3019.51P值0.040.030.010.01注CRPC反应蛋白；SNP单核苷酸多态性；OR比值比；CI置信区间；研究组脓毒症患者；对照组健康体检者807万方数据浙江中西医结合杂志2019年第29卷第10期Zhejiang JITCWM（Vol.29No.102019）因型患者脓毒症较为严重，见表4。 2.5CRP基因多态性与血清CRP水平的相关性检测受试者血清CRP蛋白水平，结果显示，研究组患者血清CRP水平显著高于对照组，差异有统计学意义（75.4623.54）mg/L比（5.241.17）mg/L，t=33.31，P0.01。 比较CRP基因rs1205位点和rs3093062位点不同基因型受试者血清CRP水平结果显示，CRP基因rs1205位点CC基因型受试者血清CRP水平最低，其次是CT基因型，TT基因型受试者最高（24.539.17）mg/L、（35.7512.15）mg/L、（71.2418.45）mg/L，F=65.34，P0.01。 CRP基因rs3093062位点GG基因型受试者血清CRP水平最低，其次是GA基因型、AA基因型最高（31.4515.42）mg/L、（47.9813.54）mg/L、（66.9717.42）mg/L，F=59.64，P0.01。 3讨论CRP是由肝细胞产生的急性期蛋白，CRP蛋白水平与炎症反应、癌症、心脏病和糖尿病有关7-9。 CRP基因rs1205位点SNP位于CRP基因的3UTR区域，与许多疾病有关，包括牛皮癣、结肠直肠癌和糖尿病等10-12。 rs3093062位点SNP位于CRP基因的启动子区域，有研究显示，rs3093062位点基因多态性与血浆CRP水平有显著相关性13。 本研究结果显示，CRP基因rs1205位点稀有突变型等位基因是脓毒症的高危因素，且与疾病严重程度相关，分析不同性别、年龄受试者中rs1205位点SNP与脓毒症风险相关性，结果显示，不同性别、年龄受试者rs1205位点SNP与脓毒症风险不相关，表明性别、年龄对rs1205位点SNP无明显影响。 进一步分析结果显示，rs1205位点突变型患者血清CRP水平比野生型高。 笔者分析原因认为，rs1205位点位于CRP基因的3UTR区域，该区域可能处于微小RNA（microRNAs）的靶点区域，突变可能影响mi-croRNAs对CRP的表达调控作用，但还需要进一步研究证实。 本研究结果还显示，CRP基因rs3093062位点GA和AA基因型是脓毒症的危险因素，携带A等位基因群体是脓毒症发生的高危群体。 另外，不同性别、年龄受试者中rs3093062位点SNP与脓毒症风险也不相关，该位点SNP也不受年龄和性别的干扰。 进一步分析结果显示，CRP基因rs3093062位点突变型受试者血清CRP蛋白水平较高，说明CRP基因性别男女2值P值表2CRP基因rs1205位点和rs3093062位点基因型与性别的相关性例（%）注CRPC反应蛋白CC75（47.17）30（32.97）CT64（40.25）50（54.95）5.530.06TT20（12.58）11（12.09）GG81（50.94）50（54.95）GA59（37.11）32（35.16）0.460.80AA19（11.95）9（9.89）rs1205位点rs3093062位点例数15991年龄（岁）50502值P值表3CRP基因rs1205位点和rs3093062位点基因型与年龄的相关性例（%）注CRPC反应蛋白CC51（41.13）54（42.86）CT54（43.55）60（47.62）1.970.37TT19（15.32）12（9.52）GG64（51.61）67（53.17）GA43（34.68）48（38.10）1.610.45AA17（13.71）11（8.73）rs1205位点rs3093062位点例数124126病程程度一般脓毒症严重脓毒症2值P值表4CRP基因rs1205位点和rs3093062位点基因型与脓毒症严重程度相关性例（%）注CRPC反应蛋白CC32（44.44）15（28.30）CT36（50.00）20（37.74）17.14T突变和rs3093062位点-409GA突变与脓毒症易感性及其严重程度相关。 其机制可能与突变影响CRP蛋白表达有关，还需要进一步扩大样本量进行研究。 参考文献1Singer M，Deutschman CS，Seymour CW，et al.The ThirdInternationalConsensus Definitionsfor Sepsisand SepticShock（Sepsis-3）J.JAMA，xx，315 （8）778-787.2Iwashyna TJ，Cooke CR，Wunsch H，et al.Population burdenoflong-term survivorshipafter severesepsis inolder Amer-icansJ.J AmGeriatr Soc，xx，60 （6）1070-1077.3王碧玉.血清降钙素原联合C反应蛋白早期诊断脓毒症的价值J.中国老年学，xx，37 （5）1209-1211.4Semeraro N，Ammollo CT，Semeraro F，et al.Sepsis，throm-bosis andorgan dysfunctionJ.Thromb Res，xx，129 （3）290-295.5Ridker PM，Macfadyen JG，Everett BM，et al.Relationship ofC-reactive proteinreduction tocardiovascular eventreduc-tion followingtreatment withcanakinumaba secondaryanalysisfrom theCANTOS randomisedcontrolled trialJ.Lancet，2018，391 （10118）319-328.6Levy MM，Fink MP，Marshall JC，et al.xxSCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS InternationalSepsis DefinitionsConferenceJ.Crit CareMed，xx，31 （4）1250-1256.7王刚，李霓，曹立赢，等.基线高敏C反应蛋白水平与非糖尿病女性乳腺癌发病风险的关系J.中华肿瘤杂志，xx，36 （12）944-948.8Miller M，Zhan M，Havas S.High attributablerisk ofelevat-ed C-reactive proteinlevel toconventional coronaryheartdisease riskfactorsthe ThirdNational Healthand NutritionExaminationSurveyJ.Arch InternMed，xx，165 （18）2063-2068.9Kiran BSR，Mohanalakshmi T，Srikumar R，et al.C-reactiveprotein andother markersof inflammationin thepredictionof cardiovasculardisease indiabetesJ.Int 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