蛹虫草菌丝体中多糖提取方法的研究

I摘要蛹虫草属真菌类物质，其菌丝体具有很高的药用价值和营养价值，尤其是菌丝体中含有的多糖应用十分广泛并有较高的应用价值和开发潜力。实验以蛹虫草菌丝体为原材料，以多糖的提取率为考察指标，比较了热水浸提法，超声波提取法和微波提取法对蛹虫草菌丝体中多糖的提取效果，并利用苯酚硫酸法测定其多糖含量。实验结果表明，热水浸提法对菌丝体多糖的提取效果最佳，其次是超声波提取法和微波提取法。并采用正交实验法对影响有效成份提取的工艺条件进行了优化，最终确定蛹虫草菌丝体多糖提取的最佳工艺条件为：提取温度80，提取时间3h，提取次数为3次，液料比为10:1。关键词：蛹虫草菌丝体；多糖；提纯；正交试验法IIAbstractAsthefungussubstance，theculturedmyceliaofCordycepsmilitarishasahighmedicalandnutritionalvalue,especiallyitspolysaccharidehasbeenwidelyused.Ithasahighapplicationvalueanddevelopmentpotential.TheexperimentregardstheculturedmyceliaofCordycepsmilitarisastheresearchmaterial，theextractionrateofpolysaccharidesasindicators.ToinvestigatethemethodappliedintheextractionofpolysaccharidesinCordycepsmilitarismyceliaWater-extractionmethod，ultrasonicwaveextractionandmicrowaveextractionmethodwereappliedintheextractionofpolysaccharidesThecontentofpolysaccharidesinmyceliawasdeterminedbyphenol-vitriolmethodTheexperimentresultshowsthatthecoarsepolysaccharidesextractiverateofwater-extractionmethodwasthebestinCordycepsmilitarismycelia，followedbyultrasonicwaveextractionandmicrowaveextractionmethod.Orthogonaldesignwasbeusedtoassesstheprocessconditionswhichinfluencingtheextractionandseparation,andfinaloptimizedconditionsforextractingexopolysaccharidewasestablished,extracted3hourson80，extraction3timesandliquidtosolidration10:1.Keywords:culturedmyceliaofCordycepsmilitaris；polysaccharide；purification；OrthogonaldesignmethodIII目录摘要.IAbstract.II第一章前言.1第二章文献综述.22.1蛹虫草菌丝体.22.1.1概述.22.1.2成分.32.2蛹虫草菌丝体多糖.52.2.1蛹虫草菌丝体多糖的结构.62.2.2蛹虫草菌丝体多糖的特点.62.2.3蛹虫草菌丝体多糖的功效.72.2.4蛹虫草菌丝体多糖的应用.92.3蛹虫草菌丝体多糖提取方法.92.3.1一般提取法.92.3.2超声波提取法.102.3.3微波提取法.102.3.4热回流提取法.112.3.5分级沉淀法.112.3.6超滤膜分离法.112.3.7色谱法.122.3.8季铵盐络合法.122.3.9酸碱提取法.122.4蛹虫草菌丝体多糖的测定方法.132.4.1气相色谱法.132.4.2高效液相色谱法.132.4.3苯酚-硫酸法.132.4.4离子色谱法.132.4.5蒽酮比色法.132.5国内外研究的现状.142.6本论文的研究内容及研究意义.14第三章试验部分.163.1材料与设备.163.1.1原材料.163.1.2主要仪器.16IV3.1.3主要试剂.163.2试验方法.173.2.1蛹虫草菌丝体的培养.173.2.2蛹虫草菌丝体的预处理.173.2.3蛹虫草菌丝体多糖的提取工艺.183.2.4蛹虫草菌丝体多糖提取方法的比较.193.2.5蛹虫草菌丝体多糖提取工艺的优化（热水浸提法）.193.2.6蛹虫草菌丝体多糖的检测.203.3结果与讨论.223.3.1葡糖糖标准曲线的绘制.223.3.2蛹虫草菌丝体多糖提取方法的比较.233.3.3热水浸提法提取蛹虫草菌丝体多糖的单因素分析.233.3.4正交试验法优化热水浸提法提取蛹虫草菌丝体多糖.27第四章结论与展望.284.1结论.284.2展望.28致谢.30参考文献.310第一章前言蛹虫草是一种著名的传统中草药，性平味甘，具有补肾滋肺、化痰止血的功效。近年来研究结果表明：蛹虫草是冬虫夏草的重要人工替代品，其在降血脂，防治动脉硬化，镇静催眠，保护心、脑组织，增强巨噬细胞活性，抗癌、抗菌、抗缺氧、抗炎等方面具有良好的功效。蛹虫草的药理药效作用与天然冬虫夏草基本一致，甚至要好于天然冬虫夏草。其子实体中富含虫草多糖和虫草素等重要的生理活性成分。自从1969年，日本学者千原从香菇子实体中提取出了一种具有抗肿瘤的活性多糖以来，世界便掀起了从真菌中探求抗肿瘤成分的高潮。蛹虫草菌丝体多糖作为蛹虫草中重要的活性成分，自然成为了人们研究的热点。据报道,蛹虫草菌丝体所含的多糖是免疫促进物质，而且是目前发现的最佳免疫促进剂之一。因此，蛹虫草菌丝体多糖备受人们青睐，对其研究也已成为食品科学、医药、分子生物学等领域开发应用和研究的热点。国内外的学者针对蛹虫草多糖的结构以及生物学活性开展了大量的研究工作，而且已经证实蛹虫草多糖具有提高免疫力、抗衰老，对特异性、非特异性、体液免疫和细胞免疫均有显著增强作用，还有降低血乳酸和血清尿素氮水平的作用。但现阶段，蛹虫草菌丝体多糖产品的开发仍然很少，其远远比不上其他的药用真菌例如灵芝、冬虫夏草等。最主要原因的是针对蛹虫草菌丝体多糖提取技术研究开发还较少，无法进行工业化生产应用。技术问题是主要克服现有的技术不足，提供一种低成本，而且对环境污染小的蛹虫草菌丝体多糖的提取方法，从而使蛹虫草多糖能被有效地提取、避免单一的提取给蛹虫草活性成分带来损失，以提高蛹虫草的综合利用度，降低投资与运行成本，最大限度地发挥蛹虫草的综合经济效益。因此，本实验开展对蛹虫草菌丝体多糖提取工艺的研究和优化，为工业化规模性生产蛹虫草菌丝体多糖提供理论依据。1第二章文献综述2.1蛹虫草菌丝体2.1.1概述由于生长环境的要求极其特殊而且有严格的寄生性，造成冬虫夏草的资源非常稀少，再加上采收的不易，因而野生的冬虫夏草十分缺乏。而且由于近几年对冬虫夏草无序的滥采滥挖，使其资源面临崩溃。冬虫夏草价格昂贵，已经数十甚至数百倍于参茸等。因此，寻找其他的代用品是势在必然。随着科学技术的迅速发展，研究员们已经开始人工培育蛹虫草，蛹虫草的培育过程是仿照野生冬虫夏草的生育条件开展模仿栽培的结果，其过程为：采用传统的菌种采集方法，从长白山地区采集被蛹虫草真菌感染的、已有成熟子实体、孢子尚没扩散的昆虫体进行菌种分离，用斜面纯化蛹虫草菌种，选出稳定品质优良的蛹虫草菌种，然后采用液体培养方法制成蛹虫草菌种液。在采摘山上柞树上的柞蚕茧，破蚕后取出鲜活的柞蚕蛹，消毒体表后自然晾干，在无菌条件下将蛹虫草菌液注入蚕蛹体，将感染蛹虫草菌的蚕蛹置于容器中，如罐头瓶等。仿生培养4060天，控制温度25左右，光照为10001500Lux，湿度为7085%。待生出火红色子实体并成熟后采收。人工培育的蛹虫草与野生的冬虫夏草经严格的测试，他们在功能与功效上并无区别，但其生产成本却大大降低，一般工薪阶层都能消费得起，这不能不说是对人类健康的一大重要贡献。蛹虫草菌丝体是冬虫夏草的有效替代品，根据科学家们分析检验，它具有与冬虫夏草相同的功效：入肺、肾、肝，具有补肺、强肝、益肾、补精、益气的效果，且无毒副作用，不仅能提高人体免疫功能，还能抵抗疲劳，分解肌肉中疲劳物质，使人体耐疲劳度增加，提高机体的运动能力。图2-1野生冬虫夏草图2-2蛹虫草菌丝体22.1.2成分蛹虫草菌丝体即人工虫草，功效成分主要是腺苷、3-脱氧腺苷（虫草素）、虫草多糖、麦角甾醇以及D-甘露醇（虫草酸）类物质和一些维生素类，蛹虫草菌丝体的主要活性成分明显要高于冬虫夏草。（1）腺苷不仅是蛹虫草核苷酸的主要成分，而且是蛹虫草的主要有效成分。可以直接转化为虫草素来发挥作用，其自身也能发挥防止心律失常，改善心脑血管循环，调节腺苷酸环化酶活性和抑制神经递质释放等作用。（2）3-脱氧腺苷（虫草素）它是一种核苷类抗生素，具有有抑制肿瘤，抗菌，抗病毒，免疫调节的作用，由于其保护生命体遗传密码的特殊功效及修复细胞，已成为了抗癌药物的新宠。其中治疗白血病已进入2期临床试验。在美国，虫草素类抗癌与抗病毒已进入了3期临床试验，虫草素在天然虫草中含量极少，每克纯品价格高达四万港币（2007年），人工合成的已有资料报道，但尚无规模化生产。（3）麦角甾醇麦角甾醇是蛹虫草中最主要的一种甾醇，也是蛹虫草质量控制的指标。麦角甾醇是一种重要的维生素D源，它具有抗癌，减毒，防衰等功效，在蛹虫草菌丝体中的含量高于冬虫夏草。（4）虫草多糖虫草属真菌的僵虫体、子座、发酵液及菌丝体中均含有多糖，蛹虫草多糖是一种高分子复合物，是蛹虫草中含量最高的药理活性物质，其具有抗传染病的功效，抗肿瘤，益精气，补肾壮阳，防止衰老，延年益寿的作用，在蛹虫草菌丝体中的含量高于冬虫夏草。（5）超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶是一种非常重要的抗氧化酵素，是在人体内自然生成的一种酶。它是保护身体细胞的一种物质，可以帮助体内清除粒腺体过多产生的自由基，避免细胞受到氧化、老化或破坏。另外，张显科等测出蛹虫草含有超氧化物歧化酶(SOD)584ug/mgpro1。（6）氨基酸类蛹虫草富含十八种氨基酸，包括人体必须的氨基酸，其中蛹虫草的赖氨酸、酪氨酸、异亮氨酸等含量相当于冬虫夏草的一倍，说明蛹虫草的蛋白质质量优于冬虫夏草。姜泓等从人工蛹虫草菌丝体中分离出虫草环肽A2，具免疫和抗真菌作用。（7）无机元素蛹虫草菌丝体中所含微量元素非常丰富，已检出有37种元素，其中以P的含量3最高，其次是Na,K,Mg,Mn,Fe,Cu,Zn。其中被称为抗癌之王的硒，含量高达0.54ug/g，所以，蛹虫草具有提高人体免疫的功效。（8）维生素类每100g冬虫夏草中含维生素A29.19ug，维生素B120.12ug,维生素C116.03ug，每100g人工培养蛹虫草菌丝体中含维生素B120.27ug。张显科等测出蛹虫草菌丝体中含有多种及其重要的维生素，其中维生素B6和维生素E含量最高，维生素B1和维生素B12的含量也较高1。维生素A含量是猪肝的13倍，维生素B2是人参的4038倍和猪肝的13倍，维生素C是香菇的8倍，维生素E的含量高于菇类。表2-1蛹虫草与其它虫草活性物质比较虫草活性物质蛹虫草野生虫草大米培养的虫草子实体虫草菌丝体虫草素0.45%0.002%0.08%0.01%蛋白质50.60%24.80%23.20%18.10%虫草酸12.40%9.23%10.12%5.17%虫草多糖11.20%6.80%6.3%4.69%SOD674.86ug/mg257.14ug/mg423.2ug/mg硒0.0450%0.012%未测锌0.0236%0.009%未测钙0.0242%0.0240%0.020%未测表2-2腺苷酸含量比较（mg/100g）不同产地野生冬虫夏草样品虫草菌丝体云南丽江四川康定青海海南青海玉树西藏那曲腺苷酸26.5210.7511.2328.7429.7833.284表2-3冬虫夏草与虫草菌丝体核苷类成分比较（mg/100g）不同产地野生冬虫夏草样品虫草菌丝体云南丽江四川康定青海海南青海玉树西藏那曲腺苷酸26.5210.7511.2328.7429.7833.28表2-4多糖及甘露醇含量（%）虫草多糖D-甘露醇麦角甾醇冬虫夏草285271323虫草菌丝体6.8781197143表2-5冬虫夏草及虫草菌丝体化学成分比较（mg/100g）腺苷尿苷鸟苷虫草菌丝体粉（9个样品）762763239343279冬虫夏草(5g个样品)1026854061表2-6冬虫夏草及虫草菌丝体无机元素比较（ug/g）PKMgAlCaFe虫草菌丝体12.47519.8415.3401181.712829冬虫夏草3.6713.9751.8137.6541.6553.1362.2蛹虫草菌丝体多糖多糖是存在于自然界中的醛糖或酮糖，通过糖苷键连接在一起的多聚物。同时含有少量的氨基酸、蛋白质、微量元素和其他功能的侧链基团,它是一切有生命的机体必不可少的成分,与维持生物机能密切相关3。近年来随着多糖的分离、分析、制备以及结构以及功能性研究的发展,研究者们对于多糖有了更加深入的了解,充分5认识到了这类化合物在抑制肿瘤、免疫调节、治疗疑难杂症等方面的特殊功效,对这一新型药物开发的非常重要的原料来源有了更充分的认识。蛹虫草作为我国名贵的传统中药,是一种极具保健功能的药用真菌,在本草备要（1694）中也有关于蛹虫草的论述。蛹虫草菌丝体多糖在蛹虫草中含量较高,而且生理作用非常广泛。2.2.1蛹虫草菌丝体多糖的结构蛹虫草菌丝体多糖，分子量为27kD，是一种含有少量蛋白的半乳甘露糖CM-1。单糖组成的摩尔比为半乳糖：甘露糖=6:5，蛹虫草菌丝体多糖具有高度分枝结构,以-（12）连接的甘露糖为主干,支链由较大量的-（16）吠喃半乳糖组成,分别连接在主干O-4和O-6上，消除反应与氨基酸分析表明：CM-1的糖链和蛋白质之间的结合是通过苏氨酸和丝氨酸的O-糖昔键连接而成的4。虫草多糖(CMPS)是蛹虫草中的非常重要的活性物质，国内外研究人员对蛹虫草多糖结构的研究较多，而不同研究人员测得虫草多糖的结构略有差异。藏药研究中报道：从蛹虫草菌丝体中分离出两种多糖：一种由分子量约为23kD组成的D-半乳糖和D-甘露糖，其分子比为5：3。另一种是由分子量约为43kD单糖组成的葡萄糖、半乳糖、甘露糖等，比例为1：3.6：10.3。李晓明5对冬虫夏草菌种发酵滤液中多糖的研究结果表明,虫草菌滤液中的多糖由半乳糖、木糖和葡萄糖、甘露糖组成。邓岚等6在固体发酵的虫草菌拟青霉中分离提纯得到的糖含量为56%的虫草菌多糖,经薄层层析与气相色谱分析组成单糖比分别为:阿拉伯糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、半乳糖,物质的量的比为11233,这与有关文献报道的有所差异。经SephadexG-75凝胶柱分离纯化得到的糖含量为72%，用Sepharose4B凝胶柱测定的分子量分别为57000和40000。陈安平7从亚香棒虫草中也分离出了一种水溶性多糖,组分分析后得其单糖比为葡萄糖半乳糖甘露糖=0.10.471。2.2.2蛹虫草菌丝体多糖的特点蛹虫草菌丝体及其胞外多糖具有良好的触变性、增稠性、抗盐耐热性和对pH的稳定性。蛹虫草菌丝体及其胞外多糖还具有一定的抗氧化活性,如在60促进氧化条件下放置7天,则0.05%含量的菌丝体及其胞外多糖油脂氧化率分别降低为18.8%和19.8%8。药理学研究表明，蛹虫草多糖对网状皮系统及巨噬细胞有明显的激活作用，能促进淋巴细胞的转化，是一种非特异性免疫增强及调节剂，可激活机体的免疫活性细胞，特别是淋巴细胞及其淋巴因子、单核巨噬细胞系统和NK细胞等，从而攻击靶细胞，发挥抗肿瘤的作用9-10。6迄今为止，人们对蛹虫草多糖的研究还寥寥无几,只是近几年蛹虫草的人工培养及其活性成分研究才相对活跃起来。实验表明：蛹虫草多糖作为蛹虫草的活性成分之一，对小鼠的特异性及非特异性体液免疫和红细胞免疫都有显著的增强作用。它作为免疫促进剂的同时,也可作为抗癌作用发挥的有效物质。通过免疫调节，蛹虫草多糖达到治疗和控制肿瘤的目的。另外，蛹虫草多糖还有促进SOD酶活力的作用，它对延缓衰老也有显著意义。因此，为了更进一步研究蛹虫草多糖活性，加速其临床应用进程,有必要对其最适宜的分离条件进行深入的研究11。蛹虫草菌丝体多糖可以活化巨噬细胞、刺激抗体的产生,提高人体的免疫能力,其抗肿瘤活性也渐渐被人们公认12。多糖有抗炎作用，且持续性明显，其发酵液中还有抗菌活性物质，对马铃薯芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等均有明显抑制作用，在研制新型保鲜剂和杀菌剂方面有良好应用前景13。2.2.3蛹虫草菌丝体多糖的功效2.2.3.1抗氧化、抗衰老作用经研究证实，蛹虫草菌丝体多糖能促进SOD酶活力，具有显著的抗衰老作用，对老年性痴呆的有效率明显优于维生素E。同时能提高老龄鼠GSHPX(谷胱甘肽过氧化物酶)、活性SOD和明显降低体内的脂质过氧化物含量。因此，蛹虫草菌丝体多糖是通过抗氧化作用实现的抗衰老作用。2.2.3.2调节免疫系统作用蛹虫草的免疫作用主要是蛹虫草菌丝体多糖在发挥其效应，研究表明，蛹虫草菌丝体多糖的不同组分都能增加小鼠的脾脏和胸腺的重量，提高机体的细胞免疫与体液免疫。蛹虫草菌丝体的胞内及胞外多糖均明显著提高小鼠腹腔内巨噬细胞吞噬指数和吞噬率，其吞噬功能的增强表明机体非特异性免疫的增强。另外，蛹虫草菌丝体多糖还能明显增强小鼠血清溶菌酶的活力，促进红细胞C3b降低，提高小鼠的肝红细胞SOD酶活力。蛹虫草菌丝体多糖对周血淋巴细胞有双向免疫调节作用。徐廷万等14对人工蛹虫草菌丝体胞外多糖对抗疲劳作用及受抑制的免疫功能的影响进行了研究，结果发现，人工蛹虫草菌丝体胞外多糖可增强免疫功能、被抑制的非特异性免疫功能和体液免疫功能，同时人工蛹虫草菌丝体胞外多糖还能显著地延长负重小鼠的游泳时间，即具有抗疲劳作用。俞丽露等15研究了蛹虫草菌丝体多糖不同组分对小鼠免疫功能的影响，结果表明，蛹虫草菌丝体多糖不同组分对单核巨噬细胞的吞噬能力均有较显著增强作用，并且可以明显地增加经地塞米松免疫抑制作用后胸腺和脾脏的重量，提高脏器指数。72.2.3.3抗炎作用炎症早期表现为毛细血管通透性增大而引起肿胀和炎症渗出等反应，是机体的活组织对损伤因子所发出的防御反应，蛹虫草菌丝体多糖对醋酸所致毛细血管通透性的增高和巴豆油所致耳肿胀等均有显著抑制作用，表明其具有良好的抗炎作用。主要原因是蛹虫草菌丝体多糖，尤其是菌藻类多糖能够调节免疫细胞间信息的感受与传递，细胞的转化、分裂和再生等活动，具有显著地抗炎作用。宾文等16对人工培养蛹虫草菌丝体多糖抗炎和免疫作用的研究中发现:蛹虫草菌丝体多糖对小鼠耳肿胀与毛细血管通透性增高等均有抑制作用，抑制小鼠溶血素的生成，对免疫器官重量、DTH等免疫作用、碳粒廓清功能无明显影响。2.2.3.4抗肿瘤作用多糖类的物质是蛹虫草菌丝体主要活性物质之一，近来的研究发现蛹虫草菌丝体多糖对网状皮系统及巨噬细胞有明显的激活作用，能够促进淋巴细胞的转化，是一种非特异性免疫调节及增强剂，可以激活机体的免疫活性细胞，特别是单核巨噬细胞系统、淋巴因子及淋巴细胞、NK细胞等，从而攻击靶细胞，发挥抗肿瘤的作用。主要原因是蛹虫草菌丝体多糖能够促进免疫细胞增殖、分泌，增强免疫细胞的功能，通过宿主介导从而发挥抗肿瘤作用。蛹虫草菌丝体多糖抑制肿瘤的机理已经取得初步进展。2004年研究发现，蛹虫草发酵菌丝提取物通过影响相关的基因表达来抑制血管的形成，从而抑制黑色素瘤生长。2005年研究表明，蛹虫草水提液能通过诱导细胞凋亡从而使白血病细胞U937的生长受到抑制，最终可以抑制肿瘤细胞的生长。汤新强等17研究人工蛹虫草菌丝体胞外多糖对毒性剂量卡铂骨髓抑制作用的影响以及对治疗剂量卡铂抗小鼠的实验性肿瘤作用的影响。发现人工蛹虫草菌丝体胞外多糖与治疗剂量的卡铂合用，可以增强卡铂的抗肿瘤作用；人工蛹虫草菌丝体胞外多糖与毒性剂量的卡铂合用，可以对抗卡铂引起的血小板减少，其对增强抗自由基引起的脂质过氧化性损伤，抗机制与减轻卡铂抑制骨髓造血细胞的GSH-PX活性有关。2.2.3.4降血糖作用人工蛹虫草菌丝经热水浸提，乙醇沉淀等处理后得到多糖精品。若口服剂量在500mg/kg的多糖精品时，对正常的小鼠没有明显的降血糖作用；若腹腔给予剂量在100mg/kg和50mg/6g的多糖精品时，对正常的小鼠、四氧嘧啶糖尿病模型的小鼠和链尿佐菌素糖尿病模型的小鼠均有明显的降血糖作用。正常小鼠血糖水平最多甚至可以降到60%左右，而糖尿病模型小鼠最多可以降到约40%，精多糖对高血糖小鼠的作用要强于正常小鼠，而且高剂量组下降的幅度要大于低剂量组，而且呈现一定的量效关系。8季晖等18对人工蛹虫草菌丝多糖生理功能的研究中发现,蛹虫草多糖(CP)对正常小鼠与四氧嘧啶糖尿病和链脲佐菌素糖尿病模型小鼠均有显著的降血糖作用,而且有一定量效关系。姚思宇等19在蛹虫草菌丝体多糖降血脂作用的动物试验研究中发现，3个虫草多糖试验组的TC和TG于30d的含量明显低于高脂对照组；而HDlLC含量明显高于高脂对照组，说明人工培育的蝙蝠蛾拟青霉虫草多糖有降血脂效果。另有研究报道,蛹虫草菌丝体多糖可降低血液中三油甘酯和胆固醇的含量。蛹虫草菌丝体多糖具抗肿瘤、抗辐射、诱生干扰素等作用也相继报道20,21。2.2.4蛹虫草菌丝体多糖的应用2.2.4.1保健食品保健食品方面，蛹虫草菌丝体多糖的应用也非常之广。研究者们以营养性食品凝胶剂和功能性甜味剂为载体，引入蛹虫草的提取液，经过合理的制作工艺，制成低热量、具有保健功能的蛹虫草高级果冻和新型蛹虫草保健软糖。2.2.4.2医药制剂依据蛹虫草菌丝体多糖的药理作用，研究者们正在进一步研究并挖掘它在保健食品、医药等各方面的价值。由于蛹虫草多糖具有增强机体免疫力、抗肿瘤作用、治疗肝的病毒性感染、抗免疫损害性大鼠肝纤维化作用和降血糖等多方面药理作用，蛹虫草菌丝体多糖被提取并制成各种医疗药剂。2.2.4.3其它蛹虫草菌丝体多糖甚至对艾滋病毒有直接的抑制作用，并且有望成为阻止艾滋病毒携带者表现症状的药物。此外蛹虫草菌丝体多糖在日用化妆品方面，在食品工业、发酵工业及石油工业等行业上也有着广泛的应用2224。2.3蛹虫草菌丝体多糖提取方法2.3.1一般提取法蛹虫草菌丝体多糖的提取一般是采用水煮醇沉的方法。通常先用乙醚脱脂，再热水提取、乙醇沉淀而得到粗多糖。由于不同研究者用的提取方法不同，所以菌丝体粗多糖得率也不同。季晖等25取人工蛹虫草菌丝体干粉200g，经过10g甲醇、7g乙醇索氏提取后，残渣用热水反复提取5次，提取液对自来水透析2天后再对无离子水透析2天，合并未经透析的部分，稍加浓缩后，再加入两倍体积的乙醇，再离心收集乙醇沉淀，9将沉淀物用水洗涤浓缩后真空干燥即得粗多糖，产率为6.67。马成坚等26取蛹虫草的胶囊粉末100g，置于索氏提取器中，在圆底烧瓶中加入无水乙醚l00mL，连续回流提取直至无色。药渣风干后用八倍量的沸水回流提取2次，每次30min，趁热过滤，并将滤液浓缩至15mL后，再加乙醇至含醇量为80，在冰箱中静置过夜后离心过滤，并加入0.2的活性炭脱色。将沉淀分别用无水乙醇、丙醇依次洗涤3次，每次5mL，置60烘干后得到灰白色粗多糖，得率为4.9。姚桂卿等27取无杂菌蛹虫草发酵物压滤后，将菌丝体和发酵液分开，菌丝体加五倍体积水，于9095浸煮10h，浸煮4次，再浸煮液抽滤，滤液减压浓缩至一定体积后离心弃去滤渣，于上清液中加三倍体积的95乙醇沉淀过夜，离心后收集沉淀，加入丙酮和乙醚反复洗涤，然后置真空干燥器中真空干燥，得粗多糖黄色粉末，得率为2.8。2.3.2超声波提取法超声波提取多糖是基于超声波的特殊物理性质。主要是主要通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固液萃取分离。超声波提取法的原理28是：（1）加速介质质点运动。根据惠更斯波动原理，在高于20KHz声波频率的超声波的连续介质中（比如水）传播时，在其波阵面上将引起介质质点（包括菌丝体重要有效成分的质点）的运动，从而使介质质点运动获行巨大的动能和加速度。质点的加速度经计算甚至可达重力加速度的2000倍以上。由于介质质点将超声波能量作用于菌丝体有效成分质点上而使其获得巨大的加速度和动能，迅速逸出菌丝体而游离于水中。（2）空化作用。超声波在液体介质中传播会产生特殊的“空化效应”，使其不断产生内部压力甚至达到上千个大气压的微气穴且不断“爆破”产生微观上的强大冲击波作用在菌丝体上，使其中菌丝体有效成分物质被“轰击”逸出，并使得菌丝体被不断剥蚀，加速多糖等有效成份的浸出提取。（3）超声波的振动均匀化可使样品介质内各点受到的作用一致，使整个样品提取更加均匀。颜辉等29利用超声波法辅助提取蛹虫草菌丝体多糖，结果显示，对提取率影响由大到小依次为料液比，超声波功率，提取温度，提取时间，最佳工艺参数是料液比1:45，温度为80，超声波功率为140W，提取时间为80min，多糖提取得率是3.98%，工艺稳定可靠。102.3.3微波提取法（1）微波所产生的电磁场加速被萃取部分成分向萃取溶剂界面扩散速率。用水做溶剂时，在微波场下，水分子高速转动成为激发态，这是一种高能量不稳定状态，或水分子汽化加速萃取组分的驱动力。或者水分子本身释放能量回到激态，所释放能量传递给其它物质分子，加速其热运动，缩短萃取组分的分子由物料内部扩散到萃取溶剂界面的时间，从而使萃取速率提高数倍，同时还降低了萃取温度，最大限度的保证了萃取质量。（2）微波辐射过程是高频电磁波穿透萃取介质，到达物料的内部维管束和腺胞系统。由于吸收了微波能量，细胞内部温度迅速上升，使其细胞内部压力超过细胞壁的膨胀承受能力，细胞破裂。细胞内有效成分自由流出在较低的温度下萃取介质捕获并溶解。通过进一步过滤和分离便获得了萃取物料。白霞等30以微波辅助法提取蛹虫草菌丝体中的多糖，取粉碎后蛹虫草干粉样品1.0g加入到40mL去离子水中，选择微波功率低火，提取14min，多糖提取量最高为3.93%。施英等31有效利用微波辅助法从蛹虫草菌丝体中提取多糖，并采用单因素和正交实验进行最佳条件的优化研究，结果表明，在微波功率为80%、料液比1:20的条件下提取20min，蛹虫草菌丝体粗多糖的提取率为10.97%。2.3.4热回流提取法热回流提取法是以甲醇、乙醇等易挥发的有机溶剂为提取溶剂，对浸出液加热蒸馏，挥发性溶剂馏出后经冷凝后重新回到浸出器中继续浸提，并循环进行，直至有效成分完全浸提。热回流法是将样品放入冷凝系统的浸取器内，然后用溶剂浸没样品的表面，浸泡一定时间后再加热浸提，蒸发的溶剂经冷凝后直接回流到浸取器内，规定时间后可将回流液滤出，再添加新溶剂继续回流数次，合并各次回流的浸出液，再馏出溶剂，即可得浸出的浓缩液待用。2.3.5分级沉淀法不同的多糖在不同浓度的甲醇、乙醇和丙酮中的溶解度不同，因此，可在不同浓度的有机溶剂中分级沉淀分子大小不同的黏多糖。在Zn2+、Ca2+等二价金属离子的存在下，采用乙醇分级分离黏多糖可以获得最佳分离效果。2.3.6超滤膜分离法超滤是一种膜分离技术，所采用的超滤膜能够从水和其他液体中分离出很小的胶体和大分子。由于超滤膜拥有不对称微孔结构，且采用摩擦流道和湍流促进结构，减少膜污染，使得在分离过程中大分子溶质和微粒（例如淀粉、胶体等）随溶液切11向流经膜表面，而小分子物质和溶剂则在压力驱动力下穿过致密层上的微孔而进入膜另一侧，因而超滤膜可以长期连续使用并保持较恒定的产量和分离效果。将超滤膜用于多糖这种生物活性物质的分离，具有不损害活性，分离效率高，能耗低，设备简单，可连续性生产，无污染等优点。2.3.7色谱法按色谱法分离所依据的物理化学性质不同，可将其分为：（1）吸附色谱法此法是利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的不同而使之分离的色谱法。其适于分离不同种类的化合物（如芳香烃与分离醇类）。（2）离子交换色谱法利用液相色谱技术和离子交换原理的结合来测定溶液中阴离子和阳离子的一种分离分析方法。利用固定相与被分离组分之间发生离子交换的能力不同来实现分离。此法主要是用来分离可离解的化合物或离子。它不仅广泛应用于无机离子的分离，而且广泛在有机和生物物质，例如氨基酸、蛋白质、核酸等的分离。（3）分配色谱法利用固定液对不同组分的分配性能差别而使之分离。（4）亲和色谱法具有高度亲和性的两种物质之一作为固定相，由于与固定相有不同程度的亲和性，而使成分与杂质分离的色谱法。例如，利用基质与酶、抗原与抗体，激素与受体等之间专一的相互作用，使物质之一与不溶性担体形成共价的结合化合物，作为层析用固定相，将另一方从混合物中选择可逆地截获，达到提纯的目的。可用于分离活体高分子的物质及细胞。（5）尺寸排阻色谱法按分子大小的顺序进行分离的一种色谱方法。体积大的分子不能渗透过凝胶孔穴中而被排阻，较早的淋洗出来，中等体积的分子部分渗透，小分子则可完全渗透到内部，最后洗出色谱柱。因此，样品分子基本按其分子的大小先后排阻，从柱中流出。被广泛用来分析大分子物质相对分子质量的分布。2.3.8季铵盐络合法多糖与一些阳离子的表面活性剂如十六烷基氯化吡啶（CPC）和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等形成季铵盐络合物，这些络合物在低离子强的水溶液中是不溶解的，在离子强度大时，这些络合物可以解离、溶解并释放。使其溶解度发生明显改变的无机盐浓度（临界盐浓度）主要由聚阴离子的电荷密度决定。122.3.9酸碱提取法有些多糖适合用稀酸提取，且能够得到更高的提取率。将热水浸提过的含多糖物质加8倍量3%的三氯乙酸浸提，15过夜后过滤，离心，再将提取液用20%的NaOH中和至pH为7，浓缩后醇析沉淀、丙酮洗涤、真空冷冻干燥后得酸提水溶性粗多糖。与酸提取法类似，有些多糖在碱中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖和酸性多糖。采用稀碱提取：多为0.1mol/L氢氧化钾、氢氧化钠，为了防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠硼及氢化钾。2.4蛹虫草菌丝体多糖的测定方法2.4.1气相色谱法糖类分子间引力一般较强，挥发性弱，故不能直接进行气象色谱分析。把糖制成某种具有挥发性的衍生物，就可用气相色谱法进行分离分析，所用衍生物有三氯硅烷（TMS）衍生物、三氟乙酸（TFA）衍生物、乙酰衍生物和甲基衍生物等，其中常用的是前两种。样品处理后，使之生成挥发性TMS衍生物后注入色谱仪器，在一定色谱条件下得出色谱图，再与标准样品的色谱图进行比较，根据峰的保留时间定性，根据峰面积，内标法定量。2.4.2高效液相色谱法高效液相色谱(HPLC)是分离与鉴定多糖的一种非常实用而且精细的设备。样品经适当前处理后，将糖类水溶液注入反相化学键合相色谱体系，用乙腈和水为流动相，糖类分子按其分子质量有小到大的顺序流出，经差示折光检测器检测，与标准比较定量。根据待定糖的种类，通过改变流动相乙腈溶液的浓度，可以扩大使用范围。2.4.3苯酚-硫酸法苯酚硫酸试剂可与游离的寡糖或多糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长490nm处（戊糖及糖醛酸在480nm处）有最大吸收，吸收值与含量成线性关系，从而可用比色法测其含量。2.4.4离子色谱法糖是一种多羟基醛或酮的化合物，具有弱酸性，当PH为12-14时会发生解离，13所以能被阴离子交换树脂（HPAC）保留，用PH12的氢氧化钠溶液淋洗，可实现糖的分离，再以脉冲安培检测器（PAD）检测，以峰保留时间定性。以峰外标法定量。本法灵敏度高（检测下限可达ng/mL级）、选择性好、操作简单、样品不必进行复杂的前处理等优点。2.4.5蒽酮比色法糖与硫酸反应，脱水生成羟甲基呋喃甲醛，再与蒽酮缩合成蓝色配合物。其颜色与糖浓度成正比。单糖、双糖、糊精、淀粉等均与蒽酮反应。因此，如测定不需要包括糊精、淀粉等糖类时，需将他们除去后测定。本法在20200mL/L质量浓度范围内成良好的线性关系。2.5国内外研究的现状我国和日本对蛹虫草菌丝体多糖研究的最多,蛹虫草菌丝体多糖脂质体和蛹虫草菌丝体多糖的药理功能逐渐被医学界认可。冬虫夏草在我国中医药史上已经应用了几百年，几乎家喻户晓。而蛹虫草发现较晚，最早在1958年吉林省长白山区被发现，吉林省蚕业研究院科技人员于1987年8月在九台土门岭山林采集了新鲜野生蛹虫草，开始人工培育并成功，目前，知道蛹虫草真实身份、功效的人极少，加之在2009年前国家