课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 目标导航1 能利用选择培养基分离细菌 2 能运用活菌计数法测定土壤中分解尿素细菌的数量 预习导学挑战自我 点点落实 1 筛选菌株 1 PCR技术要用到一种关键酶 这种酶只能在耐环境的微生物中获得 2 微生物筛选的原理是 人为提供有利于生长的条件 包括 pH等 同时或阻止其他微生物的生长 该类培养基是 一 研究思路 TaqDNA聚合酶 高温 目的菌株 营养 温度 抑制 选择培养基 2 1 在稀释涂布平板法和平板划线法两种方法中 适合统计样品中活菌的数目 该方法要求对样品的稀释度要 确保一个菌落来源于 2 用于活菌计数的平板要形成个菌落 所统计的菌落数往往比活菌的实际数值要 原因是连在一起时观察到的仅是一个菌落 稀释涂 布平板法 足够高 一个活菌 30 300 低 两个或多个 细胞 3 设置对照 目的是排除实验组中对实验结果的影响 提高实验结果的 非测试因素 可信度 二 实验设计 1 操作步骤 土壤取样 微生物的 2 土壤取样一般要铲去 因为绝大多数细菌分布于距地表约的土壤层 样品的稀释 培养与观察 3 8cm 表层土 3 样品的稀释 不同的微生物需要稀释的倍数不同 请填写下表 104 105 106 103 104 105 102 103 104 4 微生物的培养与观察微生物的生长受的影响 菌落的数目和是观察的主要内容 温度 特征 三 操作提示1 无菌操作 取土样用的和盛土样的在使用前都需要灭菌 称取土样要在旁进行 稀释样品要在旁操作 2 做好标记 要对和试管进行标记 尤其进行系列稀释时要按顺序将试管排列成行 小铁铲 信封 火焰 火焰 平板 稀释度递增 四 课题延伸分解尿素的细菌合成的将尿素分解成了氨 使培养基的碱性增强 在以为唯一氮源的培养基中加入指示剂培养细菌 若指示剂变 可以初步鉴定该种细菌能够分解 脲酶 酚红 尿素 尿素 红 预习诊断 判断正误 1 选择培养基只允许特定的微生物生长 而抑制或阻止其他微生物的生长 2 对活菌进行计数时 所做的平板越大越好 3 设置对照实验可以排除一些非测试因素对实验结果的影响 4 从土壤中取样时 土层越浅越好 5 来自土壤的微生物稀释倍数越大越好 一 选择培养基 课堂讲义重点难点 个个击破 1 选择培养基的制作方法 1 在培养基全部营养成分具备的前提下 依据某些微生物对某些物质的抗性 在培养基中加入某些物质 以抑制不需要的微生物 促进所需要的微生物生长 如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长 但不影响金黄色葡萄球菌的生长 从而可将该菌分离出来 而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌 放线菌的生长 从而分离得到酵母菌和霉菌等 2 通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的 培养基中缺乏氮源时 可分离自生固氮微生物 非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存 培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存 而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存 3 利用培养基的特定化学成分分离特定微生物 如当石油是唯一碳源时 可抑制不能利用石油的微生物的生长 使能够利用石油的微生物生存 从而分离出能消除石油污染的微生物 4 通过某些特殊环境分离微生物 如在高盐环境中可分离耐盐菌 其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存 在高温环境中可分离得到耐高温的微生物 其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存 2 结果分析与评价 思维激活 1 伊红美蓝培养基为什么不是选择培养基 答案伊红美蓝只能显示有无大肠杆菌 而不能只允许一种微生物生存而抑制或影响其他微生物的生存 所以伊红美蓝培养基不是选择培养基 2 一种自养微生物与多种异养微生物混合在一起 如何将自养微生物选择出来 答案用不含有机碳源的培养基进行培养 因为自养微生物可以利用空气中的CO2而异养微生物不可以 所以能在培养基中生存的就是自养微生物 3 2013年11月22日凌晨3点 青岛黄岛区发生石油泄漏事件 一些微生物可以有效地分解石油 如何配制选择培养基将这类微生物选择出来 答案配制的选择培养基中 石油作为唯一的碳源 然后用这种培养基培养多种微生物 凡是能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物 应用示例 1 苯酚是工业生产排放的有毒污染物质 自然界中存在着降解苯酚的微生物 某工厂产生的废水中含有苯酚 为了降解废水中的苯酚 研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株 筛选的主要步骤如图所示 为土壤样品 请回答下列问题 1 中培养目的菌株的选择培养基中应加入作为唯一碳源 中不同浓度碳源的培养基 A 影响 B 不影响 细菌的数量 如果要测定 中活细菌数量 常采用法 2 为对照 微生物在 中不生长 在 中生长 与 培养基的主要区别在于 使用法可以在 上获得单菌落 采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是 3 实验过程中如何防止其他微生物的污染 问题导析 1 题目中的目的菌株是 选择培养基与完全培养基相比最大的差别是不同 选择培养基中是唯一的碳源 2 苯酚的会对能分解苯酚的细菌产生影响 能否生存取决于细菌 细菌的分解能力可以通过改变判断出来 3 制备培养基最后一个环节是 分解苯酚的细菌 碳源 苯酚 能否利用苯酚 苯酚的浓度 倒平板 浓度 解析根据微生物对营养的需求 在培养基中加入或不加某些物质以达到促进目的菌生长 抑制或阻止其他杂菌生长的目的 然后再用稀释涂布平板法 平板划线法或其他方法筛选出单个目的菌落 再接种培养即可获得纯目的菌 为防止培养基中水分蒸发形成的水珠落入培养基中影响菌体生长 所以要将培养皿倒置 在设计实验中要注意单一变量原则和对照原则 操作中要严格进行无菌操作 答案 1 苯酚A稀释涂布平板 2 的培养基没有加入苯酚作为碳源 的培养基加入苯酚作为碳源稀释涂布平板法或平板划线以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基 3 培养基灭菌 接种环境灭菌 接种过程无菌操作 一题多变 1 为什么测定活菌的数量不能用平板划线法 答案由于在所划的线中 只有最后一次划线的末端才会形成由一个细菌形成的菌落 而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成 而在计数时一个菌落对应着一个细菌 这样在划线所得的平板中 菌落数目低于活菌的实际数值 所以不能用平板划线法测定活菌数量 2 如何判断培养基是否被污染 答案在不接种微生物的情况下将培养基在培养箱中进行培养 如果培养基中无菌落出现 则说明没有被污染 如果有菌落出现 则说明培养基被污染 3 两位同学在取土壤样品时 一位同学在不含苯酚的土壤中取样 另一位同学在含苯酚的土壤中取样 哪位同学做得较好 答案在含有苯酚的土壤中取样较好 二 统计菌落的数目1 显微镜直接计数法 总菌计数法 1 原理 此法利用特定细菌计数板或血球计数板 在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量 2 方法 用计数板计数 计数板是一块特制的载玻片 上面有一个特定的面积为1mm2和高为0 1mm的计数室 在1mm2的面积里又被划分成25个 或16个 中格 每个中格进一步划分成16个 或25个 小格 但计数室都是由400个小格组成的 如图所示 3 计算公式 每毫升原液所含细菌数 每小格平均细菌数 400 10000 稀释倍数 4 缺点 不能区分细菌的死活 2 间接计数法 活菌计数法 1 原理 当样品的稀释度足够高时 培养基表面生长的一个菌落 来源于样品稀释液中的一个活菌 通过统计平板上的菌落数 就能推测出样品中大约含有多少活菌 2 计算公式 每克样品中的菌株数 C V M 其中 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用稀释液的体积 mL M代表稀释倍数 3 统计方法 统计某一稀释度下平板上的菌落数 最好能统计3个平板 计算出平板上菌落数的平均值 然后按公式进行计算 应用示例 2 自然界中的微生物往往是混杂生长的 人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯 然后进行数量的测定 下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验 请回答有关问题 步骤如下 制备稀释倍数为102 103 104 105 106的系列稀释液 为了得到更加准确的结果 应选用法接种样品 适宜温度下培养 结果分析 1 测定大肠杆菌数时 在对应稀释倍数为106的培养基中 得到以下几种统计结果 与事实更加接近的是 A 一个平板 统计的菌落数是230B 两个平板 统计的菌落数是220和260 取平均值240C 三个平板 统计的菌落数分别是400 212和256 取平均值289D 四个平板 统计的菌落数分别是210 260 240和250 取平均值240 2 一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212 那么每毫升样品中的菌落数约是 涂布平板时所用的稀释液体积为0 2mL 3 用这种方法测定菌体密度时 实际活菌数量要比测得的数量 多 少 因为 问题导析 1 因为题中操作的目的需要对大肠杆菌进行数量的测定 所以接种的方法是 2 测定活菌数量时 选择的平板越多误差 且选择的平板要能形成个菌落 3 所做的多个平板中 如果其中一个平板中菌落的数目明显其他几个平板 则说明该平板不符合要求 应或舍弃 稀释涂布平板法 越小 30 300 多于或少于 重做 解析若对大肠杆菌进行计数 则需要用稀释涂布平板法接种样品 1 应选取多个菌落数相差不大的平板进行计数 取其平均值 2 212 0 2 106 1 06 109 个 3 因为菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成 所以实际活菌数量要比测得的数量多 答案步骤 稀释涂布平板 1 D 2 1 06 109个 3 多当两个或多个细菌连在一起时 平板上观察到的只是一个菌落 一题多变 1 如果某同学的稀释倍数仅为104 则测定的数值要比题中操作的数值高还是低 为什么 答案低 因为稀释倍数太低 则大部分菌落是多个细菌繁殖而成 所以观察到的菌落的数值要低于由单一细菌形成的菌落数目 2 第 1 小题中C项中菌落数为400的平板不符合要求 试分析该平板中菌落数目多于其他平板的可能的原因 答案 培养基被污染 一些菌落是由杂菌繁殖而成的 接种过程中由于操作不当感染了杂菌 取菌液时没有摇晃 所取菌液中细菌个体浓度偏大等 课堂小结 目的菌株 活菌计数法 显微镜直接计数法 对点练习 1 2 3 4 1 可以分离并鉴定出分解尿素的细菌的方法是 A 以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂B 以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C 以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红试剂D 以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂 1 2 3 4 解析尿素在尿素分解菌的作用下分解产生氨和CO2 氨会使培养基的碱性增强 pH升高 酚红指示剂变红 答案A 1 2 3 4 2 选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理 化学抗性而设计的培养基 利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来 为选择酵母菌和硝化细菌 应选用的培养基分别为 A 伊红美蓝培养基 含青霉素培养基B 含青霉素培养基 含氨的无机培养基C 含氨的无机培养基 含青霉素培养基D 含青霉素培养基 伊红美蓝培养基 1 2 3 4 解析酵母菌是真菌 通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养 因为青霉素抑制细菌生长 但不抑制真菌生长 硝化细菌为自养型生物 能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量把无机物转变为有机物以维持自身生命活动 利用含氨的无机培养基可进行选择培养 答案B 1 2 3 4 3 下列说法错误的是 A 因为土壤中各类微生物的数量不同 所以为获得不同类型的微生物 要按不同的稀释倍数进行分离B 测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量 选用的稀释范围不同C 只有得到了3个或3个以上菌落数目在30 300的平板 才说明稀释操作比较成功 并能够进行菌落的计数D 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目 说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落 1 2 3 4 解析样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目 土壤中各类微生物数量不同 含量最多的是细菌 大约占70 90 其次是放线菌 最少是真菌 所以为获得不同类型的微生物 再按不同稀释倍数进行分离 在同一稀释度下只要得到两个或两个以上的菌落数目在30 300的平板 就说明稀释操作比较成功 并能够进行菌落的计数 验证选择培养基是否具有选择作用 需设立牛肉膏蛋白胨培养基作为对照 若后者上的菌落数明显大于前者 说明前者具有筛选作用 答案C 1 2 3 4 4 某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌 并统计每克土壤样品中的活菌数目 培养基配方如下表 1 2 3 4 1 根据培养基的成分判断 该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌 能 不能 原因是 2 该培养基为培养基 按物理状态分 因为培养基中含有 1 2 3 4 3 要统计每克土壤样品中活菌数目 宜采用法 根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积 统计平板上的就能大约推测出样品中的活菌数 4 如果把该培养基中的蛋白胨去掉 培养基上的微生物是不是一定都是能分解尿素的细菌 为什么 1 2 3 4 解析选择分