灯盏乙素调节ATP敏感性钾通道对抗β淀粉样蛋白的毒性作用.doc

灯盏乙素调节ATP敏感性钾通道对抗淀粉样蛋白的毒性作用 基础研究灯盏乙素调节ATP敏感性钾通道对抗-淀粉样蛋白的毒性作用王宁慧1伍棋1于燕妮1郭莉莉2(1贵州医科大学,贵州贵阳550004;2贵阳市第一人民医院)摘要目的观察灯盏乙素(Scu)对-淀粉样蛋白(A)142诱导的细胞模型中ATP敏感性钾(KATP)通道的影响,探讨其对抗A毒性损害的作用机制。 方法将神经母细胞瘤细胞分为对照组、Scu处理组、A处理组、Scu+A处理组及二氮嗪(DZ)+A处理组,用生物化学方法检测各组细胞内的ATP含量;用Western印迹法检测各组细胞中KATP通道亚基Kir6 1、Kir6 2、SUR 1、SUR2的蛋白表达情况;用荧光探针定量法检测各组细胞的细胞膜和线粒体膜膜电位变化;用流式细胞术测定各组细胞总凋亡率。 结果与对照组和Scu处理组相比,A处理组细胞中的ATP含量明显降低(P001),Kir61和SUR2的蛋白表达上调(P001),细胞膜和线粒体膜膜电位去极化(P005),细胞总凋亡率增加(P001),Scu的干预调节了上述指标趋向于正常。 DZ+A处理组的各指标变化与Scu+A处理组基本一致。 结论Scu能够调控ATP介导的Kir61/SUR2亚基KATP通道的开放来抑制A毒性所致的细胞凋亡,从而发挥神经元保护作用。 关键词灯盏乙素;淀粉样蛋白;ATP敏感性钾通道;神经母细胞瘤细胞R361A1005-9202 (2019)12-2972-05;doi:103969/jissn1005-9202201912048基金项目:国家自然科学基金项目 (30870986);贵州省科学技术基金项目(黔科合J字xx2091号)通信作者:郭莉莉(1974-),女,博士,副主任医师,硕士生导师,主要从事分子神经病理学研究。 第一作者:王宁慧(1991-),女,在读硕士,主要从事分子神经病理学研究。 Scutellarin inhibits-amyloid peptide-induced toxicityby ATP-sensitivepotassium channel in vitroWANGNing-Hui,WU Qi,YU Yan-Ni,et al.Guizhou MedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China【Abstract】ObjectiveTo investigatethe effectof scutellarin(Scu)on ATP-sensitive potassium(KATP)channelincell mod-el,and toexplore themechanism forreducing Atoxicity damage.MethodsSH-SY5Y cellswere divided into control,Scu treat-ment,Atreatment,A+Scu treatment,and A+DZ treatment groups.The content of ATPwas determinedby biochemicalmethod.The expressionsof Kir6.1,Kir6.2,SUR1,SUR2were examinedby Western blot.Cell membrane potential was detected byfluores-cence probeDiBAC4 (3)and mitochondrial membranepotentialwas examinedby JC-1.Apoptotic rate wasdetectedby flowcytometry.ResultsCompared withthat ofcontrol groupand Scutreatmentgroup,the contentof ATPwas obviouslyreduced(P0.05),the pro-tein expressionsof Kir6.1and SUR2were increased(P0.05),cell membranepotential andmitochondrialmembranepotential weredecreased(P0.05),and apoptoticratewasincreased inAtreatment cells(P0.05).The interventionsof Scuregulated theaboveindicators tendingto normal.The changesof allabove indicatorsof thecells treatingwith A+DZ werealmost thesame astreating withA+Scu.ConclusionsScu couldadjust Kir6.1/SUR2KATP channelopening byATP mediatedto inhibitA142-induced cellapop-tosis,and toexert protectiveaction ofneuron.【Key words】Scutellarin;-amyloid protein;ATP-sensitive potassium channel;SH-SY5Y阿尔茨海默病(AD)的病理机制与-淀粉样蛋白(A)的多个神经毒性机制密切相关,这些毒性机制之间相互影响,互为调节,形成一个复杂的多因素循环作用,贯穿在整个疾病进程中。 A作为疾病致病分子的认识多年来得到公认,虽然针对A设计的靶向临床药物并未取得治疗上的突破,然而研究者们却得到了在治疗上应针对A毒性而非单纯针对A本身的重大提示1,2。 致力于多个靶点的毒性对抗,降低A神经毒性以期延缓AD进程,仍然是AD的主要治疗策略之一。 课题组利用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术获取了AD双转基因动物脑组织中A毒性相关的差异蛋白点,同时观察到灯盏乙素(Scu)主要调节了其中12个差异靶蛋白点的疗效,包括ATP敏感性钾通道(KATP)蛋白3。 分化成熟的人源性神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞具有神经元的形态和特性,并表达神经元特异性标志物,往往被用来制作神经系统疾病的细胞模型4,本实验利用该细胞株制作A毒性诱2792中国老年学杂志2019年6月第39卷万方数据导的反映AD病程的细胞模型,进一步验证并探讨Scu介导KATP路径对抗A神经毒性的疗效及作用机制。 1材料与方法11实验药物及细胞实验Scu为浅棕色粉末(批号:ZLxx1012037,纯度98%),由南京泽朗生物医药科技公司提供;A142寡聚体购自Sigma公司(编号:A9810);二氮嗪(DZ)购自Sigma公司(编号:D9035);SH-SY5Y细胞购自中国科学院昆明细胞生物研究所(编号:KCBxx107YJ)。 12主要试剂与仪器CCK8试剂购自同仁公司(日本);多克隆兔抗Kir61购自GenTex公司(美国);多克隆兔抗Kir6 2、SUR 1、SUR2购自Abcam公司(美国);-actin抗体购自CST公司(美国);Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司;DiBAC4 (3)荧光探针购自北京索莱宝科技有限公司;线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)和ATP检测试剂盒购自碧云天生物技术公司。 多功能酶标仪(美国Thermo Fisher公司);流式细胞仪(美国Beckman Couler公司);蛋白质凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。 13方法131药物制备A142用六氟异丙醇(HFIP)进行充分溶解并分装,通风橱过夜风干,-80保存待用,使用前加二甲基亚砜(DMSO)溶解,用不含酚红的DMEM/F12细胞培养液稀释成每管10mol/L,4冰箱放置24h,离心后取上清使用5;Scu和DZ在使用前精确称量分装,再用DMEM细胞培养液充分稀释,022m微孔注射滤器过滤后使用。 132细胞培养及分组处理SH-SY5Y细胞培养,培养液为DMEM高糖培养基,添加12%胎牛血清,1%双抗,培养箱条件为37、5%CO2,将细胞转入细胞培养板中,分为对照组、Scu处理组、A处理组、Scu+A处理组、DZ+A处理组。 对照组不加药物处理;Scu处理组加入Scu(10mol/L)培养48h;A处理组加入A142(1mol/L)培养24h;Scu+A处理组、DZ+A处理组分别加入Scu(10mol/L)、DZ培养24h,再加入A142(1mol/L)培养24h。 133CCK-8法筛选药物浓度将细胞以1105个/ml的密度接种于96孔板,每孔100l,单加磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照,细胞贴壁后进行不同浓度DZ( 0、 100、 200、 250、 500、 1000、2000mol/L)的加药处理,继续培养48h后加入CCK-8试剂,CCK-8试剂用DMEM细胞培养液以110的比例稀释后,每孔100l均匀加入,放置培养箱孵3h后用多功能酶标仪测定450nm处OD值,根据公式存活率=(实验组-空白组)/(对照组-空白组)计算各组细胞存活率。 A及Scu的浓度同之前的检测方法和结果6。 134生物化学方法检测各组ATP含量将细胞接种于6孔板中,24h贴壁后进行分组处理。 各组细胞分别加入200l/孔的裂解液裂解细胞,412000r/min离心5min,取上清待用。 将100l/孔ATP检测工作液加入96孔板中,室温放置35min,再加入上述上清或标准品,多功能酶标仪(化学发光)检测,根据标准曲线计算样品中ATP含量。 135Western印迹检测各组细胞KATP通道亚基内向整流钾通道(Kir)6 1、Kir6 2、磺酰脲受体(SUR) 1、SUR2的蛋白表达水平收集各组细胞,加入蛋白裂解液,4裂解1h,412000r/min离心20min,取上清并进行BCA蛋白定量,聚丙烯酰胺凝胶电泳后转于PVDF膜上,各指标一抗和二抗孵育后曝光显影。 以-actin蛋白作为内参照,用ImageJ软件对图像进行灰度分析,结果以各指标条带与-actin条带灰度的比值作为各指标蛋白的相对表达量。 136DiBAC4 (3)荧光探针法检测各组细胞细胞膜电位将细胞以1105个/ml的密度接种于96孔板中,24h细胞贴壁后进行分组处理后分别加入180l的5mol/L DiBAC4 (3)的检测用缓冲液,在5%CO2,37培养箱中孵育30min,孵育结束后再加入20l的5mol/L DiBAC4 (3)的检测用缓冲液,用多功能酶标仪(激发光488nm,发射光517nm,孵育温度37)观察各组细胞的荧光强度变化。 137JC-1荧光探针法检测各组细胞线粒体膜电位将细胞以1105个/ml的密度接种于96孔板中,24h细胞贴壁后进行分组处理。 各组细胞分别加入50l/孔细胞培养液和50l/孔JC-1染色工作液,充分混匀,细胞培养箱37孵育20min,孵育结束后吸除上清,用JC-1染色缓冲液洗涤2次,最后加入100l/孔细胞培养液,多功能酶标仪检测JC-1聚合体(激发光525nm,发射光590nm)和JC-1单体(激发光490nm,发射光530nm)荧光值,线粒体膜电位用JC-1单体荧光值/JC-1聚合体荧光值作为相对比值进行计算统计。 138流式细胞仪检测各组细胞凋亡率将细胞接种于6孔板中,24h贴壁后进行分组处理。 用不3792王宁慧等灯盏乙素调节ATP敏感性钾通道对抗-淀粉样蛋白的毒性作用第12期万方数据含EDTA的胰酶(200l/孔)消化收集细胞,PBS洗涤细胞两次后,用500l上样缓冲液悬浮细胞,再依次加入5l AnnexinV-FITC和5l碘化丙啶混匀,室温避光放置15min,在1h内采用流式细胞仪进行凋亡检测,利用Flow-Jo流式分析软件,计算细胞总凋亡率。 14统计学方法采用SPSS210软件进行单因素方差分析和秩和检验。 2结果21不同浓度DZ对SH-SY5Y细胞增殖活性的影响浓度为 0、 100、 200、 500、 1000、2000mol/L的DZ作用于SH-SY5Y细胞48h后的细胞存活率分别为(10000000)%、(10347816)%、(9236338)%、(6532375)%、(4881426)%、(3031554)%。 0200mol/L DZ作用于细胞48h后细胞增殖活性无明显变化,5002000mol/L作用后细胞的增殖活性呈不同程度的下降,毒性作用呈剂量-效应关系,差异有统计学意义(P001),选择200mol/L作为DZ实验用浓度。 22各组细胞ATP含量与对照组(957062)nmol/mg和Scu处理组(986118)nmol/mg相比,A处理组(684068)nmol/mgATP含量明显降低,差异有统计学意义(P001);Scu干预后Scu+A处理组(878073)nmol/mg,ATP含量有所升高,差异有统计学意义(P005)。 23Kir6 1、Kir6 2、SUR 1、SUR2的蛋白表达与对照组和Scu处理组相比,A处理组Kir6 1、SUR2的蛋白表达上调,差异有统计学意义(P001),Kir6 2、SUR1的表达无明显变化;Scu干预后,Kir6 1、SUR2的蛋白表达下调,差异有统计学意义(P001),未见Kir6 2、SUR1的表达变化。 DZ+A处理组的表现与Scu+A处理组基本一致。 见表1,图1。 表1各组细胞中Kir6. 1、Kir6. 2、SUR 1、SUR2的蛋白表达水平(xs,n=3)组别Kir6.1Kir6.2SUR1SUR2对照组0.650.060.860.060.530.060.680.05Scu处理组0.640.140.860.160.540.090.660.12A处理组1.090.231)0.840.060.550.031.020.081)Scu+A处理组0.740.122)0.880.140.560.050.760.072)DZ+A处理组0.670.162)0.850.120.570.050.770.102)与对照组比较:1)P0.01;与A处理组比较:2)P0.0115:对照组;Scu处理组;A处理组;Scu+A处理组;DZ+A处理组图1各组细胞中Kir6 1、Kir6 2、SUR 1、SUR2蛋白表达水平24各组细胞细胞膜电位变化与对照组(686005)和Scu处理组(679005)相比,A处理组(738014)的荧光值有所升高,差异有统计学意义(P005),表示细胞膜膜电位升高,呈现去极化现象;而与A处理相比,Scu+A处理组(686020)的荧光值趋向于正常,但差异有统计学意义(P005),表示膜电位的去极化现象有所改善。 DZ+A处理组(690033)的表现与Scu+A处理组基本一致。 25各组细胞线粒体膜电位变化与对照组(103007)和Scu处理组(103004)相比,A处理组(143002)的荧光值有所升高,但差异仍有统计学意义(P001),表示细胞膜膜电位升高,呈现去极化现象;而与A处理相比,Scu+A处理组(123005)的荧光值趋向于正常,但差异仍有统计学意义(P001),表示膜电位的去极化现象有所改善。 DZ+A处理组(122004)的表现与Scu+A处理组基本一致。 26各组细胞总凋亡率与对照组(418%063%)和Scu处理组(425%042%)相比,A处理组(1758%048%)细胞总凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P001);Scu干预后,细胞总凋亡率(1123%084%)明显下降,差异有统计学意义(P001)。 DZ+A处理组(967%103%)的表现与Scu+A处理组基本一致。 3讨论KATP是一种与细胞能量代谢密切相关的配体门控钾通道,受腺苷酸的调节直接将细胞的代谢状态与电活动相耦联,在神经系统中起神经元保护作用7。 细胞内ATP是KATP通道的主要调节剂,通道的开闭直接受其调控,正常细胞胞质内ATP浓度4792中国老年学杂志2019年6月第39卷万方数据约为10nmol/mg蛋白,此时KATP处于稳定状态,当细胞受到内外环境刺激时,胞质内ATP浓度发生适应性下降,触发KATP开放。 细胞膜上的KATP开放时,K+外流,细胞膜超极化,抑制细胞膜上电压依赖性离子通道的开放,比如抑制电压依赖性钙离子通道,可减少钙内流,减少细胞内钙超载诱发的凋亡,同时也能减少动作电位的发生,减少能量消耗;线粒体膜上的KATP开放时,线粒体膜超极化,可维持线粒体膜电位,稳定线粒体体功能,抑制线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放,减少氧自由基和凋亡启动因子释放,进而减少氧化应激损伤和凋亡发生8。 我们在实验中发现,A的毒性刺激使细胞内ATP的浓度明显下降,细胞膜和线粒体膜电位呈现去极化改变,表明A刺激了ATP调节下的KATP开放,神经元细胞发生保护性自主调节的生物学行为,然而,细胞凋亡率的增加,代表这种适应性反应远不足以抵消A造成的细胞损伤。 KATP主要分布在神经元、胰腺细胞、骨骼肌细胞及平滑肌细胞的细胞膜和线粒体膜表面,由4种Kir和4种SUR组成,Kir家族形成通道孔,Kir6为ATP敏感,目前确定的有Kir61和Kir62两种亚基,SUR为ATP结合蛋白的“超家族”,构成通道调控元件,包括SUR1和SUR2两种亚基。 研究发现,KATP通道亚基在脑内广泛表达(包括在与认知能力密切相关的海马区域,海马区主要以Kir6亚基表达为主)9,我们同样观察到实验用神经元细胞中均呈现出Kir6 1、Kir6 2、SUR1和SUR2的蛋白表达,且A的处理引起了Kir61和SUR2的蛋白表达上调,对Kir62和SUR1的蛋白表达并无影响,代表A触发的KATP通道开放选择性作用于Kir61/SUR2亚基。 与此同时,我们观察到在Scu干预后,A刺激下细胞内ATP的浓度水平与细胞膜和线粒体膜电位的变化趋向于正常,Kir61和SUR2的蛋白表达下调,细胞总凋亡率明显下降,显示出Scu可能通过调节KATP通道蛋白Kir61/SUR2亚基的表达,或者是降低KATP通道对细胞内ATP的敏感性而激活了通道开放,在A的毒性影响下发挥神经元保护作用。 KATP通道现已成为包括神经变性性疾病在内的多种疾病的治疗靶点,多种KATP通道开放剂(KCOs)被应用于临床并取得较好疗效,不同类型的KCOs通过不同方式选择性作用于KATP通道蛋白10。 二氮嗪(DZ)作为KCOs的一种类型被证实可以用来延缓A毒性导致的细胞损伤11,有研究显示其可激活心肌细胞膜上的Kir61/SUR2亚型KATP通道来介导对心肌缺血再灌注损伤的保护,实验中DZ对ATP浓度的影响无统计学意义,可能与其主要是增加细胞内二磷酸腺苷(ADP)的浓度有关。 我们观察到Scu发挥了与DZ基本相一致的作用,提示Scu存在作为KCOs应用来降低A毒性的可能。 课题组在同期实验中观察到,Scu能够通过干预APP代谢的分泌酶途径来抑制A的生成12;能够通过对IP3R-Ca2+途径的调控和介导MPTP的开放来抑制A毒性所致的细胞凋亡13;能够调节A毒性所致神经元中组蛋白H2A、H2B、H3的表达,通过改变AD表观遗传的信息异常来发挥预防和治疗作用14等。 综上所述,我们推测其还可能通过调控ATP介导的KATP通道开放来抑制A毒性所致的细胞凋亡,从而发挥神经元保护作用,本实验为药物针对A毒性在AD治疗中产生积极影响提供了新的实验依据。 4参考文献1Butterfield DA,Boyd-Kimball D,Perry G,et al.Oxidative stress,amy-loid-peptide,and alteredkey molecularpathways inthe pathogene-sis and progression ofAlzheimers diseaseJ.J AlzheimerDis,2018;62 (3):1345-672Fang XX,Sun GL,Zhou Y,et al.TGF-1protection againstA1-42-induced hippocampalneuronal inflammationand apoptosisby TR-IJ.Neuroreport,2018;29 (2):141-63郭莉莉,敖俊文,于燕妮灯盏乙素调节APPswe/PSE9双转基因小鼠模型脑组织中差异蛋白的作用研究J.时珍国医国药,xx;28 (11):2618-214Pasquali MADB,Ramos VMD,Ricardo 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mito-5792王宁慧等灯盏乙素调节ATP敏感性钾通道对抗-淀粉样蛋白的毒性作用第12期万方数据chondrial toxicityinduced by-amyloid peptidevia ATP-sensitiveK+channelsJ.Biochem BiophysRes Commun,2018;500 (2):504-1012王豫君,敖俊文,郭莉莉,等灯盏乙素对阿尔茨海默病小鼠脑组织分泌酶途径相关蛋白表达的影响J.山东医药,2018;58 (26):5-8.13王豫君,敖俊文,于燕妮,等灯盏乙素介入IP3R-Ca2+途径抑制淀粉样蛋白诱导的神经细胞凋亡J.中国医院药学杂志,2019; (6):561-5,57614敖俊文,王豫君,于燕妮,等灯盏乙素对-淀粉样蛋白诱导的SH-SY5Y细胞中组蛋白H2A、H2B、H3表达的影响J.中药材,2018;41 (7):1718-22.2019-01-26修回(曹梦园)刺五加提取液对小鼠学习记忆障碍和淀粉样前体蛋白酶解通路影响及作用机制朱雯菲付朝旭代霖许妍姬(延边大学医学院预防医学教研室,吉林延吉133000)摘要目的研究刺五加提取液对衰老模型小鼠学习记忆障碍和淀粉样前体蛋白(APP)酶解通路的影响及作用机制。 方法70只2月龄雄性昆明种小鼠随机分为正常对照、衰老模型、衰老+刺五加低剂量、衰老+刺五加中剂量、衰老+刺五加高剂量、刺五加高剂量、衰老+维生素E组,共7组。 连续55d颈后皮下注射D-半乳糖(200mg/kg)建立衰老模型,运用Morris水迷宫及行为学测量方法,观察小鼠学习记忆能力。 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测脑组织中、-分泌酶、淀粉样蛋白(A)142及可溶性APP(sAPP)含量;Western印迹法检测脑组织中去整合素-金属蛋白酶(ADAM) 10、-分泌酶(BACE) 1、衰老蛋白(PS) 1、糖原合成酶激酶(GSK)-3、磷酸化(Phospho)-GSK-3(Ser9)表达水平。 结果行为学显示,随着刺五加提取液浓度的提高,小鼠的学习记忆能力得到一定的巩固和强化,衰老小鼠的记忆障碍得到了一定改善。 生化学显示,与衰老组比较,刺五加提取液可以增强-分泌酶活性,抑制、-分泌酶的活性,增加组织内的sAPP含量及有效抑制A142产生。 Western印迹法检测显示,与正常对照组比较,衰老模型组GSK-3、BACE1蛋白表达水平上调;ADAM 10、Phos-pho-GSK-3(Ser9)蛋白表达水平下降;与衰老模型组比较,刺五加组ADAM 10、Phospho-GSK-3(Ser9)蛋白表达水平明显升高,GSK-3、BACE 1、PS1蛋白表达水平明显降低(均P005)。 结论刺五加通过增加-分泌酶活性,抑制、-分泌酶活性,增加sAPP生成,减少A142产生,降低BACE1蛋白表达水平,可能对APP酶解通路起到一定作用,改善小鼠学习记忆障碍,对阿尔茨海默病的发病及进展有一定预防保护作用。 关键词刺五加;阿尔茨海默病;Morris水迷宫;、-分泌酶;糖原合成酶激酶(GSK)-3R2855A1005-9202 (2019)12-2976-06;doi:103969/jissn1005-9202201912049基金项目:国家自然科学基金(No.81160159);吉林省中医药科技项目(2018-135);吉林省教育厅科学技术研究项目(吉教科合字xx-279号)通信作者:许妍姬(1973-),女,博士,副教授,硕士生导师,主要从事神经毒理学研究。 第一作者:朱雯菲(1996-),女,在读本科生,主要从事神经毒理学研究。 Effect of Acanthopanax root extract on learning and memory impairmentandamyloid precursorprotein processing pathway in aging modelmiceZHU Wen-Fei,FU Chao-Xu,DAI Lin,et al.Department ofPreventive Medicine,Yanbian UniversityMedical College,Yanji133000,Jilin,China【Abstract】Objectiv