【毕业学位论文】（Word原稿）TSH对血管内皮细胞影响的作用及机制研究

兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 1 第一章 前 言 大量临床研究表明甲状腺功能减退增加了动脉粥样硬化（ 生的危险，其机制可能涉及甲状腺功能减退引起的高胆固醇血症，尤其以低密度脂蛋白胆固醇（ 为主 (1)。另外有研究发现，甲状腺功能减退可通过损害动脉内皮细胞功能、促进脂质氧化应激反应、升高 C 反应蛋白及同型半胱氨酸水平、增加胰岛素抵抗等环节促进动脉粥样硬化的发生 (2)。 甲状腺功能减退引起动脉粥样硬化的主要机制目前研究比较明确的是由于甲状腺激素水平降低所导致的 (3)。甲状腺激素可影响血脂的合成与分解，且对分解作用的影响大于合成。当甲状腺激素处于正常水平时，脂质的合成与分解处于平衡状态 。甲状腺功能减退时甲状腺激素分泌缺乏打破了脂质代谢的平衡状态，血脂谱表现为高胆固醇血症，且主要是 升高。 近年来亚临床甲状腺疾病的潜在危害已被许多研究证实， 尤其老年人亚临床甲状腺功能减退（ 发病率高，临床表现不典型，易被忽略或误诊，从而对机体造成不良影响。 现为血清促甲状腺激素 （ 水平升高而甲状腺激素水平正常。持续的 伴血清中致动脉粥样硬化脂质的改变，即 总胆固醇 （ 、 高和高密度脂蛋白胆固醇 （ 降低 (4)。 (5)研究发现在亚临床甲状腺功能 减 退 患者发生动脉粥样硬化； 且 在 10 时动脉粥样硬化更显著。目前有研究发现 以独立于甲状腺 激 素直接作用在肝细胞增加肝脏胆固醇的合成，升高血中总胆固醇水平 (6)，而高胆固醇血症是导致动脉粥样硬化的主要危险因素 ，且 总胆固醇的增高损伤血管内皮细胞，加速动脉粥样硬化的形成。最近的一项临床研究也发现亚临床甲状腺功能减退患者颈动脉弹性降低，血管内皮功能受损，且与平成正比 (7)。 形成是一个复杂 、 长期的过程 ， 血管 内皮细胞损伤和功能紊乱 是 生、发展的始动和关键因素 (8)。通过测定血管内皮细胞上一些活性物质的浓度变化可进行血管内皮细胞损伤的定性及定量分析。 血管内皮细胞（ 血流刺激、损伤应激、炎症改变、血管压力作用下可以合成和分泌数十种血管活性物质 (9)。其既能合成和分泌发挥舒张血管作用的一氧化氮 (前列环素 (内皮依赖性舒张因子；也能兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 2 独立或作为参与部分分泌内皮素 ( 纤溶酶原激活物抑制剂 1（ 等内皮依赖的收缩因子。通过上述物质的合成发挥促进血液流动、维持血管紧张度、调节血管张力、防止血栓形成、降低内皮通透性等重要 作用 。正常情况下 ，内皮细胞所分泌的各种因子处于平衡状态；病理情况下，内皮细胞功能紊乱，分泌的血管物质失衡造成微血管及大血管的病理改变，促进动脉粥样硬化的发生。 因此，血管内皮细胞对于维持血管局部稳态和预示动脉粥样硬化形成起重要作用。而临床及亚临床甲状腺功能减退可导致内皮细胞功能障碍，增加机体发生动脉粥样硬化的风险 (10)。 体内参与甲状腺功能的调节。子通过与甲状腺细胞表面的 体结合调节甲状腺细胞的生长、增殖和分化。促甲状腺激素受体 （ 是人体内介导 状腺调控功能的重要的蛋白分子。 要存在于甲状腺滤泡细胞膜上，生理情况下，与 合后介导节甲状腺滤泡细胞的正常生长和功能。 目前有研究表明 了存在于甲状腺滤泡细胞膜外，还在甲状腺外许多组织有表达 (11)， 甲状腺外的这些组织发挥着许多病理生理作用 (12)； 亦有研究证明在血管内皮细胞上也有 体表达 (12)。 本研究拟通过研究不同浓度的 体外培养的人脐静脉血管内皮细胞的影响，以探讨 动脉粥样硬化中的作用机制，尤其是对亚临床甲状腺功能减 退患者发生动脉粥样硬化，引起心血管疾病的发生机制更深入的探讨 ， 并通过这些研究为临床治疗提供科学依据。 兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 3 第二章 材料与方法 验材料 要仪器 超净工作台 （ 苏州 安泰技术 有限公司 冰箱 （ ） 箱 （ ） 中国海尔集团公司 高速低温离心机 置显微镜 置荧光显微镜 德国 酶标分析仪 %上海市实验仪器总厂 医用电热型高压消毒锅 上海博讯实业有限公司医疗设备 漩涡混合器 上海亚荣生化仪器厂 上海东昌大和卫器有限公司 水平摇床 北京六一实验仪器厂 微量移液器 上海生物工程有限公司 79上海医科大学仪器厂 双蒸水制备仪 温水 浴箱 北京六一实验仪器厂 25、 50美国 96、 12、 6孔平底培养板 美国 细胞冻存管 美国 心管、计数板 、吸头 上海生工生物工程技术公司 核酸蛋白定量检测仪 主要试剂 国 人 脐 静 脉 血管 内 皮 细 胞 株 中国科学院上海细胞生物 研究所 兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 4 （ 干粉型 国 胎牛血清 杭州四季青生物工程公司 二甲基亚砜 美国 氯仿 浙江巨化集团公司试剂 异丙醇 浙江巨化集团公司试剂 海生物工程技术公司 无水乙醇 上海化学试剂一厂 碳酸氢钠 上海化学试剂一厂 四甲基偶氮唑蓝 美国 胰蛋白酶干粉 美国 青霉素 华北制药有限公司 链霉素 华北制药有限公司 本 M 日本 x M 试剂盒 日本 大连宝生物公司 要工作液配制 液的配制： 该试剂以固体粉末状存在，冷冻干燥保存。按照说明书要求，将 5， 充分摇 匀，配制成终浓度为 2U/ 40的 照文献所采用的浓度，用前稀释成不同浓度处理细胞。1、 2、 4的 将配置除菌的工作液移入无菌试剂瓶中， 保存备用。 胞培养液： 将干粉型 00入碳酸氢钠 1000L，调节 拌 5小时后，过滤除菌（滤器配用 分装至 250 全培养基配置： 兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 5 完全培养液配制：先将 冻存的胎牛血清放于 4全解冻后的血清置于 56C 恒温水浴箱中温溶 30制时将 109000U/封 4C 保存。 l 称取氯化钠 8g、氯化钾 酸氢二钠 酸氢钾 入烧杯中，用超纯水定容至 1L。搅拌至充分溶解，分装于无菌试剂瓶中。在 放置室温后 4 蛋白酶液的配置： 称取 250 00拌均匀后，用 ， 保存。 液： 称取 放入小烧杯中，量筒量取 0， 入烧杯，避光磁力搅拌 30 4C 避光保存。两周内有效。 胞冻存液 将 二甲基亚砜（ 与 :9比例配置即可，冻存液配制须遵守无菌原则。 理的水： 在 10000l， 使其终浓度达到 充分震荡混匀。用于浸泡逆转录反应所需的 枪头 ，浸泡完毕后高压灭菌除去残留的 验方法 脐静脉血管内皮细胞株（ 复苏 从液氮中取出冻存管快速置于 37C 的温水中，快速摇动，使其迅速融化。在超净工作台上操作，用酒精消毒冻存管后拧开管盖，用移液管将冻存液移入离心管，滴加完全培养液， 800去上清后，再重复用完全培养液清洗离心。离心沉淀后加入完全培养液稀释，吹打细胞，移入细胞培养瓶，在 7 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 6 培养，次日更换培养液。 脐静脉血管内皮细胞传代培养 观察接种的内皮细胞的生长状态，当细胞铺满培养瓶壁面积约 70%，即可进行传代。在超净工作台上，弃去培养瓶内旧培养基， 加入适量 培养瓶中加入 1胰蛋白酶，轻轻摇动瓶身，使消化液将细胞培养瓶壁完全覆盖，边消化边在显微镜下观察。待细胞间隙变大，细胞变圆时，立即加入血清终止消化。加入适量完全培养基，反复吹打细胞，收集细胞悬液， 800去培养液，重悬细胞，并反复吹打呈单细胞悬液，调整细胞数目为 5 105种于培养瓶，继续培养实验。 脐静脉血管内皮细胞的冻存 取出已配制好的细胞冻存液放置于室温下。在超净工作台上，弃去培养瓶内旧培养基，加入适量 入 胰酶，与传代相同消化细胞 ， 800细胞冻存液于离心沉淀中，轻轻吹打后， 将其移入冻存管 。逐步降温，最后放入液氮罐中。 甲基偶氮唑蓝 (比色分析法检测人脐静脉血管内皮细胞活力 理 -(4,52)二苯基四氮唑溴盐，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶可与 成难溶性的 蓝紫色结晶，其生成量与活细胞数目和功能状态呈正相关。结晶物能被 酶联免疫检测仪在 490处测定其光吸收值，可以间接反映活细胞数目 。 作步骤 将人脐静脉血管内皮细胞以每 孔 5 1056孔细胞培养板上。 各 培养 128孔加入 37继续培养 4h，终止培养，弃去每孔培养液，每孔加 荡 10酶联免疫检测仪上 490 验设计分组 兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 7 【 1】正常对照组 ； 【 2】 M)； 【 3】 M)； 【 4】 M)； 【 5】 理 实时荧光定量 T是指在 后收集 循环过程进行实时检测。 RT值表示荧光信号强度到达所设阈值所需要的循环次数，模板初始浓度越高， 终通过特定数学原理对样品模板做定量分析。 RT有操作简单，敏感性高，污染 较小，并可以进行多重扩增，现已被应用到基础科学研究、药物研发、疾病研究及临床诊断等多个领域。 测样本收集及其他注意事项 选取生长状态良好的 化后传代， 待 细胞贴壁后 加药 ，随机分组 分别 培养 128h。注意：所用器械均预先用 炭酸二乙 酯） 水溶液在374h，然后 1200 取 【 1】 弃去原有细胞培养液，用 培养瓶中加入 5平在 冰上放置 5裂解液分布均匀充分裂解细胞， 用移液枪吹打混匀，吸至 【 2】 加入 1荡混匀，室温静置 54120000 【 3】 取出 取上清液，加入与上清液等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，室温静置 1041200010 【 4】 取出 去上清液，清洗试管底部的 离心沉淀中加入 15%无水乙醇，上下颠倒清洗， 41200010 【 5】 取出 去 上清液，室温干燥 5入 20 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 8 淀， 冰箱保存。 【 6】 加 2测时清除背景影响，调零后检测 260280值 = 所以比值大于 在 用于实 验。 转录合成 上操作。 【 1】 具体反应体系如下： 试剂 使用量 5l T 板 1l 体系 10l 【 2】 具体反应条件如下： 37C 、 1585C、 5s，转录后于 保存。 物设计： 【 1】 通过 基因 名称 引物序列 :5R:5:5R:5:53 R:5- 3 兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 9 :5R:5:5R:5【 2】 引物的配置： 将装有引物干粉的 000管中加入 后用 0M， 保存。 应 【 1】 光，冰上进行。 试剂 使用量 x 10M） 1l 10M） 1l 2l 反应体积 25l 【 2】 步法扩增）： 第一步：预变性， 95C 30s， 1个循环 第二步： 95C 5s， 60C 30s， 50个循环。 【 3】 结果分析： 实验结束后获取溶解曲线、扩增曲线及 解曲线呈单峰，证实引物具有特异性。获取 照 2- 验组） - 照组）； 验组） =的基因 照组） =的基因 计学处理 所有实验数据均由 数据以均数 标准差 (x s)表示，组间差异显著性检验使用单因素方差分析，组间两两比较使用 满足方差齐性时 )， P 兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 10 第三章 结 果 置相差显微镜下观察 倒置相差显微镜下观察发现 细胞 开始贴壁 。呈集落生长，椭圆形或长梭形。贴壁初期，可见细胞呈单层生长，胞浆逐 渐均匀，胞核逐渐清晰。 培养 48胞进入对数生长期，此期细胞增殖旺盛。（见图 1）。 图 1 倒置显微镜下观察 20） 测定细胞活力 实验中各组测得的吸光度值占正常对照组吸光度值的百分比即为细胞活力。结果显示 ： 、 1及 2浓度的 正常对照组相比 ， 细胞活力均无显著差异，差异无统计学意义（ P 而 4浓度的 显 低于正常对照组 ， 差异 具有 统计学意义 （ P 实验结 果说明：、 1及 2浓度的 异无统计学意义（ P 而 4浓度的 差异 具有 统计学意义 （ P 故此浓度弃去不用。 （表 1 图 2） 表 1 x s, n =3) 组别 细胞活力（ %） 12h 48h 正常对照组 州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 11 表 1 x s, n =3)（续） 组别 细胞活力（ %） 12h 48h 1 2 4 注：与正常对照组比较， *P #P 同浓度的 用不同时间 对 影响 表 2 不同浓度的 同时间后 因 2- （ x s, n =3) 组别 基因 M 2M 正常对照组 12h 8h 2h 48h 2h 48h 2h 48h 2h 48h 注：与正常对照组比较， *P与 12#P同浓度的 用不同时间后对 达的影响 我们分别以不同浓度的 28h，与正常对照组相比， 1M 及 2中以 2异具有统计学意义（ P说明 间梯 度上， 28h，相比于正常对照组， 48异具有统计学意义（ P说明 上所述， 异具有统计学意义（ P（表 2 图 2 图 3） 兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 12 图 2 不同浓度 同时间后 对 注：与 正常对照组比较 , *P与 12 #P l 1 M 2 #*#*#*#兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 13 图 3 不同浓度 同时间后 对 注：与 正常对照组比较 , *P与 12 #P 同浓度的 用不同时间后 对 因 达的影响 我们分别以不同浓度的 28h， 与正常对照组相比， 1M 及 2中以 2异具有统计学意义（ P说明 间梯度上， 28h，相比于正常对照组， 48异具有统计学意义（ P说明 。综上所述， 异具有统计学意义（ P（表 2 图 4 图 5） P Hc o n l 0 0 1 M 2 01 #*#*#*#兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 14 图 4 不同浓度 同时间 后对 注： 与 正常对照组比较 , *P与 12 #P M M 1 M 2 #*#*#*#兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 15 P A tr o l 0 M 0 M 1 M 2 #*#*#*#图 5 不同浓 度 同时间后 对 响 注： 与 正常对照组比较 , *P与 12 #P 各个 基因 的扩增及溶解曲线 图 6 增 及 溶解曲线 图 7 增及溶解曲线 兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 16 图 6 增 及 溶解曲线 （ 续 ） 图 7 增及溶解曲线 （ 续 ） 图 8 图 9 解曲线 兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 17 第四章 讨 论 甲状腺功能减退是一种常见疾病，其所引起的动脉粥样硬化是心血管系统的主要危险因素之一 (13)。对于甲减引起动脉粥样硬化的临床研究较多，但对于其中的机制研究目前并不完善，而往往认为是甲状腺 激 素的作用 (14)。 我们的研究发现 进动脉粥样硬化的发生。 这就说明，在甲减患者中， 仅仅是甲状腺激素的作用。 动脉粥样硬化的形成是一个复杂、长期的过程，血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生、发展的始动和关键因素 (15)。血管内皮细胞是人体内分布 最 广泛的内分泌器官、效应靶器官 (16)。在人体正常状态下，内皮细胞分布完善、功能良好，能分泌多种血管活性物质并且对各种理化刺激做出反应。在病理条件下，血管内皮细胞上血管活性物质分泌的平衡状态被扰乱，引起血管收缩痉挛、血小板被激活、血液处于高凝状态 (17)。因此，血管内皮细胞对于维持血管局部稳态和预示动脉粥样硬化形成起重要作用。本实验以人脐静脉 血管 内皮细胞为切入点，研究 制 ，从而研究 一氧化氮（ 由血管内皮细胞合成和释放， 是 调节内皮细胞功能的重要因子。它由一氧化氮合酶（ 化产生。 有扩张血管、抑制血管平滑肌细胞的迁移和增殖、防止血小板粘附和聚集、抑制单核细胞浸润、维持内皮细胞功能稳定及屏障保护作用 (18)。 为 内皮型一氧化氮合酶 )、 经型一氧化氮合酶）及 导型一氧化氮合酶）三种类型。其中， 要存在于内皮细胞中。当 性降低时， 生减少，血小板易于黏附聚集，并释放一些活性物质，使血管收缩，动脉内血栓形成；同时使血管平滑肌细胞增殖，血管壁增厚，造成管腔狭窄、阻塞，促使动脉粥样硬化的发生和发展。 要存在于神经细胞中；而 要存在于巨噬细胞中 (19)。本实验结果显示，与正常对照组相比，不同浓度的 激 胞后， 因 表达含量均明显降低，其中以 2M 最显著，差异具有统计学意义（ P； 而不同浓度用于细胞 12h 和 48h 后 ， 因 表达含量也明显降低，且 48异具有统计学意义（ P故可得出： 诱导 表达呈现剂量及时间依赖性降低。因此我们得出： 以 诱导 内皮功能的紊乱，使 泌下降，致使 合成和分泌减少，促进动脉粥样硬化的发生发展。 兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 18 前列环素（ 由花生四烯酸在血管内皮细胞环氧合酶和前列环素合酶的作用下生成的 (20)，具有显著的血管扩张、抑制血小板聚集、抑制血管 平滑肌细胞增殖和迁移、 调节局部血流量 、 防止动脉硬化发生的作用 (21)。 O，而 本实验结果显示，与正常对照组相比，不同浓度的 中以 2异具有统计学意义（ P； 而不同浓度 28 48异具有统计学意义（ P故可得出： 此我们得出： 导 内皮 细胞 功能的紊乱，使 使血小板聚集， 进动脉 粥样硬化的发生发展。 内皮素（ 由 21个氨基酸构成的寡肽， 是 经由血管内皮细胞合成的目前已知 的 效果最强的血管收缩因子之一。 强大的缩血管功能、升高血压作用、激活 激平滑肌细胞增殖、促进粘附分子的分泌与释放等 (22)。血管内皮细胞主要合成 致内皮细胞通透性增加，促进动脉粥样硬化 (23)。本实验结果显示，与正常对照组相比，不同浓度的 中以 2异具有统计学意义（ P；而不同浓度 28h， 48异具有统计学意义（ P故可得出： 此我们得出： 导 内皮功能的紊乱，使 使血管收缩、内皮细胞功能紊乱，导致内皮细胞通透性增加，促进动脉粥样硬化的发生发展。 纤溶酶原激活物抑制剂（ 人纤溶系统的主要调节因子 (24)。纤溶系统由纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶原激活物 (纤溶酶原激活物抑制剂（ 成。纤溶酶是由纤溶酶原在组织型 PA(作用下转变成的，纤溶酶能使纤维蛋白原、纤维蛋白单体和交联纤维蛋白降解为多种纤维蛋白降解产物。血管内皮细胞主要合成 要的生理抑制剂 (25)，能快速与 合并使其灭活，导致纤溶酶减少，从而抑制纤维蛋白溶解、促进血栓形成。 参与平滑肌细胞增殖迁移和细胞外基质积聚等 基本病理过程，从而促进 发生和发展。因此，正常情况下， 间保持着生理平衡。而当内皮细胞损伤或功能紊乱可导致血液凝血 纤溶失衡，促成血栓形成。本实验结果显示，兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 19 与正常对照组相比，不同浓度的 激 胞后， 因 表达含量均明显升高，其中以 2M 最显著，差异具有统计学意义（ P； 而不同浓度 用于细胞 12h 和 48h 后 ， 因 表达含量也明显升高，且 48h 时间段最显著，差异具有统计学意义（ P故可得出： 诱导因 表达呈现剂量及时间依赖性升高。因此我们得出： 以 诱导 内皮功能的紊乱，使 泌增加，致使血液凝血 纤溶系统失衡，促进动脉粥样硬化的发生发展。 人脐静脉 血管 内皮细胞株 究所提供。该细胞株在体外具有正常脐静脉 血管 内皮细胞的功能，因而被广泛用 于 体外研究。一种不依赖激素的细胞，在我们的实验中，为排除血清内可能含有的微量激素的干扰作用，我们在无血清的培养基中 使 用 便更明确地体现 本实验中，我们观察到 以随着 时间依赖性降低，而 着 浓度依赖性增加。这就说明甲减疾病过程中， 升高参与了动脉粥样硬化的发生，不仅仅是甲状腺 激 素的作用，说明 动脉粥样硬化 相关基因 表达的时效关系研究上，我们发现 2 M 2其 相关 基因的 作用 48关 基因 的 著 的变化。 通常情况下，在体外培养的细胞中外源物质作用超过 24小时才被认为是一个长期作用。结合本实验的结果，这说明 因 表达的改变是一长期作用，这也可用于解释在甲减或亚临床甲减等伴有 在一过性亚临床甲减时却未见有动脉粥样硬化。 本实验中我们选用的 中提取的，纯度超过 98%，已有研究表明其已被大量应用于体外 7)。我们的研究中所选用的 ，这一浓度远远超过了生理浓度。在生理情况下，体内 内皮细胞培养中，我们在加 减少协同因子的作用。我们所选用的 26)。 人体动脉粥样硬化是一个复杂的过程，受到诸多因素的调节， 伤血管内皮细胞，尚不能完全解释甲状腺功能异常如甲减和亚临床甲减兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究 20 时出现动脉粥样硬化，还需要不断的 深入研究。但本研究证实的 血管内皮细胞损伤，将为认识 及为探讨甲状腺功能减退，尤其是亚临床甲状腺功能减退导致动脉粥样硬化的发生发 展 及心血管疾病的发生发展提供了新的线索。 兰州大学硕士研究生学位论文 血管内皮细胞影响的作用及 机制 研究