【毕业学位论文】（Word原稿）PAHs降解菌的筛选、降解基因克隆及作用效果微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 解菌的 筛选 、降解 基因克隆 及 作用效果 I 摘 要 多环芳烃降解菌的筛选 一直是国内外生物 降解 一个重要方面 ， 获取 高效降解 菌株是生物修复的前提。 本论文从 长期 污染 的 土壤中筛选到两株 降解 多环芳烃 的分枝杆菌 ， 对其进行了固体平板，摇床培养和污染土壤中的降解效果研究， 结果 表明这两株菌均 有很强的 降解 能力。 根据已报道的多环芳烃降解菌的双加氧酶同源序列设计引物， 增出编码 双加氧酶大亚基和小亚基的基因片段，为了进一步研究 多环芳烃 降解基因，构建了降解菌的粘粒基因组文库，并 筛选到携带降解基因的 克隆 子 。 利用平板 升华 法 从 103 个多环芳烃污染的土壤样品中初筛到 51 株多环芳烃降解菌。比较降解菌降解圈的大小，得到 2 株降解能力较强的菌，命名为 株菌均能以苊、芴、菲、蒽、荧蒽和芘为唯一碳源和能源良好生长。通过形态观察、生理生化特征测定、全细胞脂肪酸分析、 16S 列分 析和 列分析鉴定这两株菌 都 属于分枝杆菌属（ ，但为 不同的种 。 菌株 固体平板上和液体培养基中都有很好的降解效果。在固体平板上，菌株 0d） 和荧蒽 （ 0d） 的速率大于 分别为 00d） ，而降解芘的速率 （ 0d） 却小于菌株 0d） 。 在液体培养基中， 菌株 5d 时对 200 菲的降解率达到 98%， 16d 对难降解的芘的降解率达到 80，对荧蒽的降解率为 50左右 。 降解菌 含芘 50、 100 和 200的无机盐液体培养基中培养 16d 降解率分别达到 在芘浓度 100， 5 9 的液体条件下，均可生长 和降解 ， 添加高浓度的葡萄糖会抑制降解能力。 添加氮源和磷源对菌株 在污染土壤中的降解效果有一定的促进作用，添加无机钾对降解效果有一定的抑制作用 。 盆栽条件下，降解菌株与植物联合的作用效果较好，降解效率较高。从开始接种到第 4 周这段时间的降解速度较快 ，之后变慢。接种菌剂比不接种菌剂的降解效果好，土壤不灭菌比灭菌的降解效果佳。植物的根和茎叶对芘有一定的吸收作用， 不接种菌剂的处理比 接种的吸收的较多，土壤中接入菌剂后，植株芘的含量明显降低，不灭菌土壤植株芘的含量相对高于灭菌土壤 。 根据已报道降解菌的双加氧酶同源序列设计引物， 增出编码 双加氧酶大亚基和小亚基的基因片段，序列分析表明与已知降解芘的分枝杆菌的双加氧酶基因 有 99的同源性 。 利用粘粒 为载体，制备基因组 分酶切片断，经体外包装、转染 大肠杆菌 选择培 养基平板上获得 1 万多个重组克隆子，构建了菌株 基因组粘粒文库。从含菲的固体培养基上筛选到了携带降解基因的克隆子， 经 增，所有克隆子均带有 关键词 ： 多环芳烃 ， 分枝杆菌 ， 微生物降解 ， 芘 is an at is of of on in of of on of of 11 to 03 1 11 16. on as a to of 6S TS on in of 0d )0d) 16 11, of 0d)11 16. In 8 d, 0% 0% at 11 in at 0,100 00 In 00 in 9. 11 by of a to in a a In of an of in in 11 16 no of in in in of 11 in . as 0,000 CR of 录 第一章 多环芳烃微生物降解的研究进展 . 1 环芳烃（ . 1 产生和来源 . 1 理化特征 . 2 危害 . 3 内外的污染现状 . 5 环芳烃的微生物降解 . 5 分子量多环芳烃的降解 . 6 分子量多环芳烃的降解 . 7 环芳烃的无氧降解 . 12 枝杆菌降解多环芳烃的研究现状 . 13 环芳烃降解菌的分子生物学研究 . 14 环芳烃污染土壤的生物修复 . 16 环芳烃污染土壤的微生物修复 . 16 环芳烃污染土壤的微生物植物联合修复 . 18 环芳烃污染土壤生物修复的影响因素 . 19 究的目的和意义 . 19 究内容和技术路线 . 20 第二章 多环芳烃降解菌的筛选 . 21 验材料 . 21 品来源 . 21 养基 . 21 要试剂 . 21 要仪器 . 21 验方法 . 22 选方法 . 22 型特征鉴定 . 22 离菌株全细胞脂肪酸甲脂分析 . 23 6S 定 . 24 6S 列的鉴定 . 24 统发育树的构建 . 24 果与分析 . 25 解菌的筛选 . 25 离菌株的形态观察和生理生化特征 . 26 离菌株的全细胞脂肪酸分析 . 27 V 离菌株的 16S 列分析 . 27 于 16S 系统发育树的构建 . 28 列的分析和系统发育树构建 . 29 论 . 29 第三章 降解菌株的室内作用效果研究 . 31 验材料 . 31 验菌株和培养基 . 31 验 方法 . 31 环芳烃的测定方法 . 31 株生长量的测定 . 31 株 固体多环芳 烃平板上的生长和降解效果 . 31 株 液体培养基中的生长特性和降解效果 . 32 体培养基中影响降解菌 用效果的因素 . 32 果分析 . 32 解菌株在固体平板上的生长特性和降解特性 . 32 解菌株在液体培养基中的生长特性和降解特性 . 34 同浓度芘对 生长和降解能力影响 . 37 同 对 生长和降解芘能力的影响 . 38 同葡萄糖浓度对 长和降解芘能力的影响 . 38 论 . 39 第四章 芘污染土壤中降解菌的作用效果 . 41 验材料 . 41 验方法 . 41 壤、草炭、盆钵和种子表面灭菌处理 . 41 解菌株菌剂的制备 . 41 工污染土壤样品的制备 . 42 品处理 . 42 验设计 . 42 、 P、 K 养分对降解菌在土壤中作用效果的影响 . 42 解菌与植物联合的作用效果研究 . 42 果与分析 . 43 、 P、 K 养分对降解菌在土壤中作用效果的影响 . 43 解菌与植物联合的作用效果 . 44 论 . 46 第五章 降解菌 因组文库的构建和 解基因的筛选 . 48 验材料 . 48 株与质粒 . 48 养基和抗生素 . 48 溶液、缓冲液和试剂 . 49 验方法 . 49 粒 提取 . 49 因组 提取 . 50 解菌 香环羟基化双加氧酶序列扩增 . 51 粒基因组文库的构建 . 51 果与分析 . 53 加氧酶 大亚基和 小亚基的序列分析 . 53 枝杆菌基因组提取和基因组 分酶切片段的制备 . 54 枝杆菌 因组文库的构建 . 55 带 解基因的克隆子的筛选 . 56 论 . 57 第六章 全文结论 . 58 参考文献 . 60 致谢 . 66 作者简历 . 67 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 环芳烃 a)并 a芘 bp 基对 合酶链 式反应 核糖核酸酶 十六烷基三甲基溴化铵 十二烷基硫酸钠 脱氧核苷三磷酸 三（羟甲基）氨基甲烷 落形成单位 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 多环芳烃微生物降解的研究进展 1 第一章 多环芳烃微生物降解的研究进展 多环芳烃（ 指一类由两个或两个以上苯环以线状、角状或成簇形式构成的独特的持久性有机污染物，其中一些 在生物活体内产生种种有害效应，包括细胞毒性、遗传毒性、免疫毒性、致癌、致突和致畸变等 (002)。多环芳烃主要通过吸烟和污染食物进入人体 ， 其中饮食摄入是主要方面 (004)。 随着煤、石油 在工业生产、交通运输以及生活中被广泛应用 ， 多环芳烃的污染已成为世界各国共同关注的问题。多环芳烃在环境中的归宿包括挥发光氧化化学氧化生物积累土壤吸附及微生物降解，研究表明，微生物降解在该污染物的迁移转化乃至最终从环境中消失的过程中占有重要的地位，是环境中 去除 多环芳烃最主要的途径，也 是最有效 、 最廉价的方式 (992)。 因此 ， 微生物 降解 已成为 国内外 污染环境修复的重要手段。 环芳烃（ 产生和来源 多环芳烃化合物是在燃烧或热解 过程中产生 的 ，但因其种类复杂繁多，其形成机制至今尚未完全了解，根据目前研究结果可分成下列两种机制： 1 热解或不完全燃烧 形成是自由基在火焰中发生化学反应。自由基起源于碳氢化合物的不完全燃烧，经过活性大、反应快的自由基催化和环化等化学反应机制后生成 大利亚学者 1960)曾推论碳氢化合物在热解过程中逐渐由 乙炔 合成 机物在高温缺氧下裂解产生碳氢自由基结合成乙炔，由乙 炔 形成乙烯基乙炔或 1,3后生成乙基苯，再进一步结合成丁基苯和四氢化萘，最后通过 中间体形成苯并 a芘 (英文缩写为 其报道显示甲苯、乙苯、丙苯及丁苯经热解反应后，会产生大量的苯并 a芘及中间产物丁苯，但结构复杂的碳氢化合物并不须经由裂解反应形成小分子，只需打断几个键来进行热合成和氢反应，即可生成 他的同事提出的苯并 a芘合成步骤如图 1示。 图 1并 a芘合成步骤 国农业科学院硕士学位论文 第一章 多环芳烃微生物降解的研究进展 2 任何含碳有机物的燃烧反应都有可能促使 生，例如：含脂肪的肉类在烧烤时与火焰接触后即有可能生成 着 于肉类上。 人（ 1985）也指出，在热解过程中，若有机分子具有苯环结构时，苯环和苯基分子均将大量生成，苯与苯基经聚合反应后则会生成 发 生热解反应的温度很广，但是在高温和低温时 的 作用 又不甚相 同。在高温下的主要反应为高分子量 的反应物经由断键和脱氢，而形成活性大且不稳定的低分子量分子，而在低温时则是进行分子聚合反应。 2 碳化过程 不是只能由高温才能生成 ， 在低温（ 200 以下）和高压下经过几百年的时间， 同碳化过程产生。这种转化过程与热解相似，但因温度的关 系，反应极慢，例如像石油及煤中都具有 其前驱物。 环境中 来源 很多，其主要来源可分为自然产生和人为产生两种，以人为活动贡献最多。 1 自然产生 自然界有很多自然现象会产生 火山爆发、森林火灾、微生物的生 化作用和光化学作用。同时自然界本身存在的一些物质如石油、煤、 沥青、木榴油和 柏 油等自身也含有多环芳烃类物质，这些 会通过各种方式排到环境中。这些自然现象所产生的 于其具有偶然性，而且其对环境的影响会受到人类活动的干扰，很少有人研究这些自然现象所产生的 环境的影 响 (夏北成 ,2002)。 2人为产生 虽然自然现象会产生一定量 是人类活动是现在环境中 前 (1) 在焦化煤气、有机化工、石油工业、炼钢炼铁等工业所排放的废弃物中有相当多的多环芳烃 ， 其中焦化厂是排放多环芳烃最严重的一类工厂。监测数据表明 ， 作为多环芳烃污染指数的苯并 a ， 大大高于 的国家排放标准 (岳敏 ,2003)； (2)城市废弃物 （ 其中含有大量纸张、塑料等 有机原料 )的焚烧过程 (003)；（ 3）交 通业如机动车中柴油机、汽油机的使用 (002)； （ 4）食物烹饪和家用燃料的燃烧，这是造成室内 川张林 ,1997)。 虽然环境中 是化石燃料燃烧及城市生活 垃圾焚烧等过程是其主要来源 。 理化特征 分异构体很多，仅差两个氢原子的同环化 合 物也很多，目前探明的 00多种。 其极性通常很低，当连接的苯环数目越多时，在水中的溶解度也越 低。 当水中的溶解度越低，则正辛醇水的分配系数（ 越大，且随着环数越多，则 因此 环境中存在 ， 时间越长 ， 遗传毒性越高 ， 致癌性增强 ， 并能通过食物链在动、植物体内逐级富集 ， 对人体健康具有非常大的危害。 美国环保局在上个世纪 80年代已将 16种不带分支的多环芳烃列入优先污染物名单中。我国也把 多种 多环芳烃列入环境污染物的黑名单中 。 表 16 种美国环保总局 ( 优先监测污染物 结构和性质 。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 多环芳烃微生物降解的研究进展 3 表 16 种 结构和性质 6 合物名称 结 构 式 分 子 量 熔点 沸点 溶 解 度 气压 萘 128 81 218 32 2300 0 152 93 270 2000 0 氢 苊 154 96 279 5 ) 21000 0 166 117 294 5000 0 178 101 340 9000 0 178 216 340 25 ) 28000 610蒽 202 111 383 25 ) 0 5 0 202 156 404 25 ) 210 5 0 228 256 448 25 ) 410 5 0并 a蒽 228 162 435 25 ) 410 5 0并 k荧蒽 252 217 481 10 6 0并 b荧蒽 252 168 481 10 6 0并 a芘 252 177 496 25 ) 106 0 1,2,3 并芘 276 163 534 10 7 0苯并a,h蒽 278 270 535 25 ) 106 0并g,h,i苝 276 278 542 07 0 危害 早在公元 1775 年，英国 人 观察 到 烟囱清洁工因长期 曝露在煤 尘 中而 导 致 阴 囊病 变 的例子 ， 提出煤油燃 烧后 的 产 物具有致癌性的看法 。 但 直 到 1933 年才由 出致癌物 1976 年 国际 上已 确认 具致癌性的 少有三十 种 以上 ， 成为 目前世界已知的 致癌化 学 物最 庞 大的一群。 萘是 族中的 第 一个成员，是最普通的微量污染物。 萘对于实验动物的毒性特征已经被深入研究和报道 (001; 997)。萘能共价结合于肝脏、肾和肺部组织，导致其毒性增加 ； 人体急性 萘 中毒会导致溶血性贫血 ；还会 抑制线粒体的呼吸 (2001)。长期与萘接触的职业工人，皮肤和眼睛会产生变化。菲是已知的人类皮肤的光敏剂 和温和的过敏原，在特殊情况下会引起细胞 突变 ，也 是姐妹染色体交换的微弱诱导