免疫亲和-光化学柱后衍生高效液相色谱荧光法测定花生粕中黄曲霉(精)

中国饲料 2007年第 24 期黄曲霉毒素由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生 , 主要包括 B 1、 B 2、 G 1和 G 24种毒素 , 其中 B 1是毒 性和危害最大的一种 , B 2和 G 2分别是 B 1和 G 1的 双羟基衍生物。 黄曲霉毒素是一级致癌物质 , 其毒 性比氰化钾要强 10倍 , 能使植物和动物细胞染色 体发生畸变 , 使胎儿发生畸形。 花生粕的营养价值 较高 , 适口性好 , 是猪、 鸡等单胃动物及反刍动物 的良好饲料。但是其易感染黄曲霉菌而产生黄曲 霉毒素 , 所以要加强花生粕原料和以花生粕为原 料的混合饲料中黄曲霉毒素的检测和控制。 目前国际上黄曲霉毒素测定普遍采用荧光光 度 计 法 , 但 该 法 只 能 测 定 总 黄 曲 霉 毒 素 (GB/T 18979-2003 。黄曲霉毒素主要的衍生方法有柱 前三氟乙酸衍生 , 柱后碘衍生、 电化学在线柱后衍 生 , 溴化吡啶溴衍生法 (Stroka 等 , 2003; 宋欢 , 2001 。衍生后通过高效液相色谱 -荧光法测定黄 曲 霉 毒 素 B 1、 B 2、 G 1和 G 2。 Waltking 和 Wilson (2006 采用柱后光化学衍生法测定了坚果中的黄 曲霉毒素 B 1、 B 2、 G 1和 G 2。本研究采用了免疫亲和柱净化 , 柱后光化学 衍生 , 高效液相色谱法结合荧光检测器测定花生 粕中黄曲霉毒素 B 1、 B 2、 G 1和 G 2。1材料与方法1.1仪器与试剂 L2130型高效液相色谱仪 ; 荧 光检测器 ; AURA INDUSTRIES 光化学衍生器 ; 高 速 均 质 器 ; 免 疫 亲 和 柱 分 离 6位 泵 流 操 作 架 ; Afla-P 黄曲霉毒素免疫亲和柱 ; 1.5m 玻璃纤维 滤纸。黄曲霉毒素 B 1、 B 2、 G 1和 G 2混合标准溶液 (美国 SUPLCO 公司 ; 甲醇 (色谱纯 。黄曲霉毒素标准储备液的配制 :将黄曲霉毒 素 B 1、 B 2、 G 1和 G 2混合标准溶 液 1mL 全 部 转 移 到 10mL 棕色容量瓶中 , 用甲醇稀释至刻度。 0.1%吐温 -20/PBS 清洗液的配制 :称取 8.0g NaCl , 1.2g Na 2HPO 4, 0.2g KH 2PO 4, 0.2g KCl , 用免疫亲和 -光化学柱后衍生高效液相色谱 荧光法测定花生粕中黄曲霉毒素的研究中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 陈 新北 京 中 检 维 康 技 术 有 限 公 司 王 雄 雷 达摘要 研究建立了光化学柱后衍生 -高效液相色谱 (HPLC -荧光检测器测定花生粕中黄曲霉毒素 B 1、 B 2、 G 1和 G 2的方法。甲醇 /水提取样品中黄曲霉毒素 B 1、 B 2、 G 1和 G 2, Afla-P 黄曲霉毒素免疫亲和柱净化 , 经高效液相色谱分 离后 , 由光化学柱后衍生 , 通过荧光检测器测定。 结果表明 :在优化条件下 , 黄曲霉毒素 B 1、 B 2、 G 1和 G 2的检出限分别 为 1.0、 0.3、 1.0g/kg 和 0.3g/kg , 回收率为 67.0%117%, 相对标准偏差 (R SD 低于 18.2%。 该方法简便快速、 灵 敏度高、 重现性好 , 满足饲料用花生粕中黄曲霉毒素检测的需要。关键词 免疫亲和柱 ; 光化学衍生 ; 高效液相色谱 ; 黄曲霉毒素 ; 花生粕中图分类号 S816.17文献标识码 A 文章编号 1004-3314(2007 24-0030-03 AbstractA method for determination of Aflatoxin B 1, B 2, G 1and G 2by using photochemical derivatization-HPLC-fluorescence detector was developed.The Aflatoxin B 1, B 2, G 1and G 2in samples were extracted by methanol /water and were cleaned up by immuno affinity columns.The separation of Aflatoxin B 1, B 2, G 1and G 2was conducted by HPLC , the determination was carried out by fluorescence detector after photochemical derivatization.Under optimum conditions , the limits of determination of Aflatoxin B 1, B 2, G 1and G 2were 1.0, 0.3, 1.0g/kg and 0.3g/kg respectively , the recoveries of analytes were from 67.0%to 117%and the relative standard deviations were below 18.2%.The method is simple , high sensitive and good repeatability , which is suitable for the determination of Aflatoxin in peanut residues.Key wordsimmunoaffinity column ; photochemical derivatization ; HPLC ; Aflatoxin ; peanut residues30中国饲料2007年第 24期 (下转第 34页 黄曲霉毒素线性方程相关系数线性范围 (ng/mL 检出限 (ng/mL B 1y=151354x-1137270.99390501.0B 2y=282044x-761520.99340150.3G 1y=67639x-597540.99410501.0G 2y=136211x-413860.99210150.3990mL 纯水将上述试剂溶解 , 加入 1mL 的吐温 -20, 然后用浓 HCl 调 pH 至 7.0, 最后用纯水稀释至 1000mL 。1.2色 谱 条 件 高 效 液 相 色 谱 用 分 析 柱 是Cloversil ODS-C 18柱 , 粒径 5m , 内径 4.6mm , 柱 长 150mm 。甲醇 水 (50 50, V V 为流动相 ; 流动 相 流 速 为 1mL/min ; 进 样 量 为 20L ; 柱 温 为 25 ; 检测器为荧光检测器 , 检测激发波长为 360nm , 发射波长为 440nm 。1.3实验方法1.3.1样品制备。花生粕样品为均匀颗粒状 , 粒径 为 23mm 。在进行黄曲霉毒素添加回收率实 验 , 需将 25g 空白样品中添加适量的黄曲霉毒素 混合标准溶液 , 放置 4h 以上或过夜。1.3.2提取。称取 25g 样品于高速均质器中 , 加 5g 的氯化钠 , 加入 100mL 甲醇 +水 (80 20, V V ,以均质器高速提取 12min , 用中速滤纸过滤 , 收集滤液 10mL , 用 40mL 纯水稀释。1.3.3净化。将上述稀释后的滤液以玻璃纤维滤纸过滤 , 移取滤液 20mL (相当于 1.0g 样品 过Afla-P 黄曲霉毒素免疫亲和柱 , 调节流速 12滴 /s , 直至空气完全通过免疫亲和柱。用 10mL0.1%吐温 -20/PBS 清洗液以 23滴 /s 清洗免疫亲和柱。然后用 10mL 的纯水以 23滴 /s 清洗免疫亲和柱两次 , 直至空气完全通过免疫亲和柱。 加入 1mL 甲醇 , 调节流速 12滴 /s 的流速将免 疫亲和柱中的黄曲霉毒素淋洗下来。1.3.4测定。从上述淋洗下来的 1mL 洗脱液中准确移取 200L , 加 200L 纯水混匀 , 然后取20L 注入高效液相色谱仪中 , 用峰面积计算 , 外标法定量。2结果与分析2.1光化学衍生本实验采用的光化学衍生池利用紫外光照射 , 使流动相光解出具有荧光特性 的基团 , 与黄曲霉毒素 B 1、 G 1分子上的活性双键 发生羟基化反应 , 生成荧光特性更强、 更稳定的物 质 , 解决了黄曲霉毒素 B 1、 G 1在水溶液中有荧光 淬灭的现象。由图 1和图 2可知 , 在未进行光化 学衍生化时 , 因流动相中水对黄曲霉毒素 B 1和G 1具有强烈的荧光淬灭作用 , 荧光强度大幅度减小 , 信号响应低。通过光化学衍生后时 , 黄曲霉毒 素 B 1和 G 1荧光强度增强。2.2方法性能 按 1.2的色谱条件进行测定 , 以各黄曲霉毒素峰面积 (y 为纵坐标 , 黄曲霉毒素浓 度 (x , ng/mL 为 横 坐 标 进 行 线 性 回 归 , 结 果 见 表1。由表 1可知 , 在 050ng/mL , 黄曲霉毒素 B 1和 G 1具有良好的线性关系。 在 015ng/mL 范围内 , 黄曲霉毒素 B 2和 G 2具有良好的线性关系。2.3回收率和精密度测定 用不含黄曲霉毒素B 1、 B 2、 G 1和 G 2的花生粕作为空白样品进行添加回收和精密度实验 , 样品中添加不同浓度标准、 搅 拌均匀后静置 4h 以上 , 以保证黄曲霉毒素被样 品充分的吸收 , 然后按照本方法进行处理 , 结果见 表 2。从表 2可知 , 该方法准确度好 , 黄曲霉毒素B 1、 B 2、 G 1和 G 2回收率为 67%117%; 精密度高 , 其 RSD 低于 18%。2.4样品测定 将该方法用于随机抽样获得的 25个花生粕样品测定 , 均有检出。大部分黄曲霉毒素总量分布在 250ng/g 之间。只有 1个样品 黄曲霉毒素总量为 147ng/g , 其中黄曲霉毒素 B 1图 2衍生后的黄曲霉毒素标准溶液色谱图图 1未衍生的黄曲霉毒素标准溶液色谱图50.035.020.05.0-10.00.03.36.710.013.316.720.06. 44G 29. 18B 210. 95B 150.035.020.05.0-10.00.03.36.710.013.316.720.06. 41G 29. 15B 210. 90B 17. 44G 1表 1方法的性能响 应 强 度时间 (min 响 应 强 度时间 (min 31中国饲料 2007年第 24期(上接第 31页 为 121ng/g , 黄曲霉毒素 B 2为 20ng/g , 黄曲霉毒 素 G 1为 4ng/g , 黄曲霉毒素 G 2为 2ng/g 。说明花 生粕中黄曲霉毒素污染比较严重 , 必须对这类原 料与产品中黄曲霉毒素进行严格的检测与控制。3结论采用免疫亲和柱净化 , 光化学在线衍生 , 高效 液相色谱荧光法检测花生粕中黄曲霉毒素 B 1、 B 2、 G 1和 G 2。该方法简便快速 , 准确可靠 , 灵敏度高 , 重现性好 , 能够满足饲料用花生粕中黄曲霉毒素 检测的需要。(基金项目 :国家科技支撑计划项目 , 项目编 号 :2006BAD12B03参考文献1宋欢 . 液相色谱法测定饲料中的黄曲霉毒素 B 1J. 山西农业大学学报 , 2001, 3:257258.2中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 .GB/T 18979-2003. 食品 中黄曲霉毒素的测定 -免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法 S. 北京 :中国标准出版社 , 2003-7-01.3Stroka J , Houst C V , Anklam E , et al.Immunoaffinity Column Cleanup with Liquid Chromatography Using Post -Column Bromination for Determination of Aflatoxin B 1in Cattle Feed :Collaborative Study J.J of AOAC International , 2003, 86(6 :11791186.4Waltking A E , Wilson D.Liquid Chromatographic Analysis of Aflatoxin Using Post-Column Photochemical Derivatization :Collaborative Study J.J of AOAC International , 2006, 89(3 :678692.通讯地址 :北京市海淀区中关村南大街 12号 , 邮编 :100081表 2回收率及精密度试验结果 (n=7黄曲霉毒素 添加量(g/kg 测定量(g/kg 回收率(%相对标准偏差 (%B 1 1.00.8383.016.2 109.1491.410.7 5046.2392.49.5B 2 0.30.35116.717.8 3.02.6287.312.6 1513.2688.411.6G 1 1.01.14114.012.5 109.0590.513.1 5045.9091.89.2G 2 0.30.2066.718.2 3.02.1872.716.2 1510.0667.112.33讨论植酸酶酶活国标测定法是在 BASF 和 AOAC 植酸酶酶活测定法的基础上确立起来的。在国标 法发布之前 , 我国科学工作者对植酸酶测定方法 进行了研究和论证 , 其中底物建议应用 Sigma 试 剂公司生产的 P3168。而国标测定法发布后对底 物的应用 只 是 规 定 了 分 子 式 是 C 6H 6O 24P 6Na 12, 而 对其他方面没有作详细说明。 Sigma 试剂公司生 产 的 底 物 P0109和 P3168的 化 学 式 分 别 为 C 6H 6O 24P 6Na 12 xH 2O 和 C 6H 6O 24P 6Na 12, 绝干状态下 相对分子质量都是 923.8, 是植酸的钠盐形式 , 其 水溶液呈碱性。底物 P3168和 P0109在应用 pH 5.5的乙酸缓冲液配制后 pH 值达到 6.46.5, 而 植酸酶国标法中酶活单位定义是在 pH 为 5.5的 条件下测定的。 所以在植酸酶酶活测定过程中 , 应 将底物溶液 P3168和 P0109的 pH 校正到 5.5。 同 样 , 当在 pH5.0条 件 下 检 测 时 也 应 将 底 物 溶 液 P3168和 P0109的 pH 校正到 5.0。有研究报道 , 将植酸钠 P3168溶液 pH 由 6.48调至 5.5, 极显著 影响植酸酶活性 , 未调节 pH