【毕业学位论文】（Word原稿）甘肃汉族人群SLC30A8基因多态性与2型糖尿病的相关性

1 前 言 近来年， 我国糖尿病患病人数 显著 增加，而且发病年龄 呈现出 年轻化的趋向。调查显示： 1980 年全国 13 省及北京市 30 万人口进行的糖尿病调查中，显示糖尿病患病率为 1。 1995 1996 年 对全国 11 省市 20 75 岁 4 万人群进行糖尿病流行病学基线调查表明糖尿病的患病率已达到 。 2002 年全国糖尿病的流行 病学 调查 ，采 用空腹血糖 5.5 l 作为筛选指标，高于此水平的人行 验。在 18 岁以上的人口中，城市糖尿病的患病率为 农村为 城市中年龄在 18， 45和 60 岁以上者糖尿病患病率分别为 而农村相应年龄组为 2007 至 2008 年在中华医学会糖尿病学分会 织下，全国 14 个省市进行了糖尿病的流行病学调查。通过加权分析，考虑性别、年龄、城乡分布和地区差别的因素后，估计我国 20 岁以上的成年人糖尿病患病率为 调查显示中 国成人糖尿病总数达9240 万，其中农村约 4310 万，城市约 4930 万。从 1980 年到 2008 年，在不到30 年间我国糖尿病患病率增加超过了 15 倍。中国可能已成为世界上糖尿病患病人数最多的国家。另外， 供 的有关资料表明，糖尿病的患病率、致残率和病死率对总体健康的危害程度， 已经 居 于 慢性非传染性疾病的第三位 ，仅仅次于心脑血管疾病和癌症。另外，调查显示在大多数发达国家，糖尿病是主要的致死原因， 且 以 2 型糖尿病为主，而在许多发展中国家目前糖尿病已达到流行状态 。综上所述，糖尿病及其各种并发症已经成为严重威胁人类生存质 量和社会发展的疾病， 未来 50 年内糖尿病仍将是 我 国一个严重的公共卫生问题。 目前我国糖尿病患病率急剧增加考虑可能有以下多种原因造成： 国城市化发展的进程随着经济的发展明显加快，我国城镇人口比例在2006 年的调查显示已上升至 43%。 年人的比例逐年增加， 2007年 的调查中 60 岁以上的老年人糖尿病患病率在 20%，比 20年龄阶段的人患病率高 10 倍。调整其他相关因素后，年龄每增加 10 岁，糖尿病的患病率增加近 70%。 国城市中主要交通工具进入了 汽车时代，人们出行的方式已经发生很大的变化，体力活动明显减少，而热量的摄入在逐渐增多，脂肪摄入量及比率比例明显增加，出现摄入大于消耗，过多脂肪在体内储存， 肥胖和超重的比例增加，调查显示： 我国超重占人群中的 肥胖已达甘肃汉族人群 陈华琴 兰州大学 二一三 2 到 5%, 超重及肥胖增长的幅度明显增加。 着对糖尿病患者各种并发症的危险因素控制以及治疗水平的提高，糖尿病患者死于并发症的风险明显下降，糖尿病患者的生存期明显增加。 目前 我国糖尿病流行特点： 尿病 患病人群中，以 2 型糖尿病为主，2 型糖尿病占 90以上 ， 1 型糖尿病约占 5，其它类型糖尿病仅占 ， 妊娠糖尿 病 的患病率 约占 5%。 2. 糖尿病患病率与经济发达程度 相关 ：在 1994 年的调查中，高收入组的糖尿病患病率是低收入组的 2。最新的研究发现发达地区的糖尿病患病率明显高于不发达地区，城市高于农村。 3. 未诊断的糖尿病比例高于发达国家： 2007 20 岁以上人全国调查糖尿病患者，新诊断的糖尿病占总 糖尿病患者 数 60%，远高于发达国家 (美国约 48%)。 4. 男性、低教育水平是糖尿病的易患因素：在 2007的调查中，在调整其他危险因 素后，男性患病风险比女性增加 26%，而文化程度大学以下的人群糖尿病发病风险增加57%。 5. 表型特点：我国 2 型糖尿病患者的平均 体重指数（ 约在 25高加索人糖尿病患者的 均多超过 30 kg/后高血糖比例高，在新诊断的糖尿病中，单纯餐后血糖升高占近 50%。 6. 目前 国内 尚 缺乏儿童糖尿病的流行病学资料，从临床工作中发现，近年来 20 岁以下的人群中 2 型糖尿病患病率显著增加。 我国目前糖尿病的分型采用的是世界卫生组织 1999 年制定的糖尿病病因学分型体系。将糖尿病分为四类： 1. 1 型糖尿病型 2. 2 型糖尿病 3. 特殊类型的糖尿病 4. 妊娠糖尿病 。临床的常见类型是 1 型糖尿病、 2 型糖尿病及妊娠糖尿病。 1型糖尿病病因和发病机制尚不清楚，病理学特征是胰岛 B 细胞数量显著减少或消失，导致胰岛素分泌显著下降或缺失，目前认为属于 自身免疫性疾病。2型糖尿病的病因和发病机制目前不明确，其显著的病理生理学特征为胰岛 或胰岛素抵抗所导致的胰岛素在机体内调控葡萄糖代谢能力的下降 , 或两 者共同存在。特殊类型糖尿病是在病因学上相对明确的一些高血糖状态， 相 对于 1型糖尿病及 2型糖尿病病因比较明确。 妊娠糖尿病是指怀孕前未患糖尿病，而在怀孕时才出现高血糖的现象，其发生率约百分之 五 。 随着对糖尿病发病机制研究的深入，病因明确的糖尿病将逐渐增多，特殊类型糖尿病的种类会逐渐增加。 2 型糖尿病的病因尚未完全阐明。目前认为不是唯一病因导致的单一因素疾病，而是复合病因的综合征，与遗传、自身免疫、生活方式和环境因素均存在关系。 它 是由遗传和环境因素共同作用而引起的以糖代谢紊乱为主要表现的疾病，具有双重的病理生理学机制 胰岛 但具体病因尚不明确。 人 体内的 糖主要来自于食物的摄取和肝脏的糖异生。虽然进食是周期性的，但是胰岛组织分泌的胰岛素和胰3 高血糖素的调节、小肠对葡萄糖的吸收、胃肠分泌的小分子肽对胰岛组织的分泌活动的影响、肝脏在激素刺激下糖原合成和糖异生的调节以及外周组织对葡萄糖的吸收和代谢相互平衡使血糖控制在一个很窄的范围内 (4-7 )。 目前糖尿病研究主要分为几大方面：胰岛 周组织对胰岛素的响应性、胃肠道的影响和基于基因水平上的易感性研究等。 近年来 基因多态性 的 研究 ， 使得临床医生将有可能 判断 ，在同样的致病条件下，不同的个体会出现 什么样的 临床表现 及 病理反应。按照基因多态性的特点 给予针对性的 用药，将会使临床治疗 更加 符合个体化的要求。 例 如高血压的治疗，将根据基因多态性的研究 ，判断高血压产生的病因， 选择更具针对性的药物，而不是 一味地、 不加选择地使用 血管紧张素转换酶抑制剂 、钙拮抗剂 、利尿剂或 。 而一些 合并症 、并发症 的防治也会更个体化，更 具有目的 性。 如前所述， 一种多基因病，它具有明显的遗传异质性、表型复杂性及种族差异性等特征，多个微效基因通过直接或者间接的关系 ， 对该疾病的易感性产生了累积的效应。已经研究的关于 2型糖尿病及 其并发症的候选基因主要有岛素分泌调节、脂代谢、糖代谢、肾素 溶稳定系统及相关激素、受体、酶及载体的基因。 随着 高通量单核苷酸多态性 (因分型技术发展迅速 , 全基因组关联研究 （ 方法被广泛应用到疾病的遗传学研究中 , 并取得了一系列研究成果。 在遗传流行病学上，全基因组关联研究 (一种检测特定物种中不同个体间的 大部分或 全部基因 ， 人类 从而 可以 了解不同个体间的基因 存在 变化有多大的一种方法。不 同的 基因 变化带来不同的性状， 例如各种 不同 疾病 的发生 。在人类中，这种技术发现了特定基因与疾病的关联，如糖尿病和 年龄相关性黄斑变性的眼部疾病 等 。 以遗传为基础的 复杂 、 常见 疾病提供了良好的研究前景 和方向 ，其常用的遗传标记就是 不同人群中， 及不同 ，这些差异可能就代表某一种族或人群间的遗传变异，对它们的研究有助于 （ 1） 解释个体的表型差异 。（ 2） 不同群体和个体 中 对疾病的易感性 。（ 3） 对各种药物的耐受性 以及 对环境因素的反应 2。 以前的连锁分析和候选基因的方法已经确定了 2 型糖尿病相关的 一些 基因，如 3 欧洲的原始种群中，是已知最强的与 关基因 10。全基因组关联研究（ 提供了 新的发现 2 型糖尿病的基因方法 ，并取得丰富结果。例如，包括 B、 因，已表明与 1关。 但这些基因的功能4 和调控机制还不十分清楚 ，有待于人类进一步研究证实。 全基因组关联研究得出，编码 基因 多态性与 2 型糖尿病的发生有关 21，且在不同种族有不同的研究结果。东亚地区单个易感基因可使患有 2 型糖尿病的风险性增加 16%，欧洲单个危险基因可使患有 2 型糖尿病的风险性增加 14%，而非洲、印度、以色列未发现 因多态性与 2 型糖尿病相关 22。 21在法国人群中首次发现 因和 2 型糖尿病相关。 22证实 挪威人 的 因多态性 2 型糖尿病有关。 4等研究了印第安人中 因 点 2 型糖尿病的相关性，并且发现这些位点与 2 型糖尿病及体 重 指数没有相关性。在亚洲， 5等的结论，证实 增加日本人 2 型糖尿病的易感性； 26证实因多态性与韩国人 2 型糖尿病有关。国内 27证实 型糖尿病、糖调节受损有关， 因型 患 2 型糖尿病的风险显著增加。黄勇 28等证实上海人群 态性与 2 型糖尿病相关。 一、 锌与糖尿病的关系 锌 (人体重要的微量元素之一 , 30 年代已经证实胰岛素晶体中含有锌。锌体内平衡受 因家族 )和 庭 )锌转运蛋白的调节。 作用是减少细胞内 锌离子的水平，将锌离子从细胞质运输到细胞外，而 加细胞内 锌离子的水平，将细胞外锌离子运输到细胞质。据报道 ,当前已确定人类 10 个 族的成员 ( 14 个 庭成员的( 大多数 胞质氨基和羧基 而 运蛋白有八个跨膜域。此外 , 在这两个锌转运蛋白中，锌结合到细胞内、外环跨膜域形成锌运输孔隙。在胰腺 B 细胞膜上存在 达，并转运锌离子进入细胞质 。 胰岛 胰岛素原被转运到高尔基体内与锌结合，然后形成六聚体。离开高尔基体后 , 在胰蛋白酶、羧肽酶的作用下 , 水解成 胰岛素浓缩形成 并以与锌结合的形式贮存于胰 岛 受到葡萄糖等刺激 , 岛 颗粒膜与细胞膜融合释放出胰岛素。在胰岛素的合成贮存过程中 , 锌起着重要作用 ,胰岛素原在 胰岛 聚体形成 , 胰岛素原水解酶的激活 , 胰岛素浓缩和胰岛 锌缺乏时 , 胰腺 胰岛素转录后或翻译后水平的合成下降 , 与锌结合发生交联的能力改变。锌也与胰岛素的释放密切相关 , 胰岛 而锌和胰岛素的释放是平衡的。 如果血液中锌足够多 , 并且 胰岛 则胰岛素分泌 相对 减少 ； 如果血锌降低 , 胰岛 5 则胰岛素可替代锌的分泌增加 , 这也是造成高胰岛素血症 , 产生胰岛抵抗的原因之一。所以微环境中含有充足的锌 , 有利于胰岛素的代谢 , 保护 胰岛 以免过度的刺激导致 动物试验证实 , 缺锌时动物糖耐量受损 , 母体缺锌时胚胎胰岛素与胰高血糖素含量均减少 , 胰岛 细胞数目也减少。这些表明锌与胰岛素、葡萄糖的代谢有密切的联系。所以锌在糖尿病发病过程中可能起着重要作用。 通过对影响锌平衡 6个因素 (发锌、血清锌、尿锌、肠锌 表观吸收率、血糖 /血清铜锌 )进行回归分析 , 肠锌 吸收率越低 , 24小时尿锌排泄越多 , 锌丢失越多，锌负平衡越严重。血糖越高 , 则血清锌含量越低 , 尿锌排泄越多 , 肠锌吸收障碍及负平衡越严重 29。何邦平等 30研究表明 , 糖尿病患者血清锌显著低于正常人 ,与胰岛素和 与血糖呈显著负相关。锌在十二指肠吸收过程中 ,要与载体蛋白结合 , 糖尿病患者蛋白质处于负氮平衡 , 可能影响锌载体蛋白的合成 , 这将导致肠道锌吸收障碍。另外 , 糖尿病患者控制饮食 , 锌摄取可能不足 , 也是造成锌缺乏的一个原因。 研究表明 ，高血糖能引起体内锌总量减少，而锌的损失可能进一步加重糖尿病。另外，氧化应激与糖尿病并发症密切相关，应用抗氧化治疗可延缓其并发症的发生、发展，而锌在细胞内抗氧化防御系统中起着重要作用，若锌量不足，氧化应激则不可逆地损害细胞，加重并发症的发生、发展。已经有一些机理说明 型糖尿病的风险 相关 。更具体地， 是 风险等位基因导致 2型糖尿病患者 胰岛 障碍 31敲除小鼠 岛 功能 受损 糖耐量异常， 但并非所有的结果都一致的 33 另外， 在基因敲除 的小 鼠 发现 ，高脂肪的饮食会导 致严重的胰岛素抵抗，可能涉及到 肪组织 存在 不同的表达 36。越来越多的文献表明， 工和分泌胰岛 素是重要的。 二、 锌转运蛋白 8（ 是 锌转运体家庭 的一个成员 ， 调节 囊泡内外锌 浓度 37。编码 基因 是 因，主要表达在胰腺中 A、 B 细胞 38 在睾丸和 颌下腺 等 有低水平的表达 。 位于胰岛素分泌颗粒在 B 细胞 40，在那里它被认为是需要提供锌，以允许适当的成熟，存储 和分泌胰岛素 37。 二聚体形式定位于 胰岛 B 细胞上 ，调节胰岛素分泌、储存 囊泡膜上41, 调节胞浆和囊泡间的锌转运。 白可能含有多个位点，这些假定位点为 物学功能的分子机制研究提供了必要的线索。 白在人类和哺乳动物的结构和功能相似，提示 白在锌转运过程中发挥重要作用 42。 外界的锌浓度不能影响 胰岛 B 细胞的锌聚集量，而锌转运或储存的能力则影响锌的聚集量。细胞内含锌量多 ， 达细胞会免于因锌缺乏而诱导的凋亡。 当6 白发生变异时，胰岛 B 细胞囊 泡内锌离子浓度下降，胰岛素六聚体明显减少，囊泡内胰岛素水平降低 , 外界 高血糖刺激下分泌的胰岛素相应不足。胞吐作用时胰岛素原不能完全转变为胰岛素， 胰岛 B 细胞分泌胰岛素的功能损伤。白锌离子转运能力下降，导致锌离子不能及时转运至囊泡，也可破坏胞浆内锌稳态。过量锌离子积聚在胞浆中，当其达到或超过毒性阈值可诱发大量 胰岛 43。 大鼠胰岛素瘤 胞实验表明， 白过表达能促进细胞摄取和储存锌离子增加，导致细胞内锌总含量 增加 44。 白也可作为抗原引起 T 细胞介导的以 甚至诱发 ，引起 白异常，造成胰岛素分泌减少，引发糖尿病。另外， 有研究报道 因多态性也 与同种异体肾移 植受者移植后糖尿病 45、妊娠糖尿病 46发病危险性增高相关 , 但具体机制尚未确定 。 三、 免疫系统 锌对免疫细胞进行调节 , 对免疫功能它是必不可少的微量元素 47。锌在先天和后天性免疫反应中均是必需的。锌对促炎细胞因子如白 介素 (肿瘤坏死(其他抗原刺激后 ,促进 T 细胞的增加显得十分重要 48因此锌缺乏引起胸腺萎缩 , 淋巴细胞减少 , 抑制细胞溶解的 T 细胞反应、 自然杀伤细胞活性和迟发型超敏反应的发生 50。锌也从细胞因子诱导破坏保护胰腺 B 细胞，这用来观察 1 型患者糖尿病 , 但也出现在 2 型糖尿病。 白介素 )是一个细胞因子 ,主要来源于巨噬细胞 , 在 1 和 2 型糖尿病中参与调节炎症 /免疫反应和参与抑制胰岛素的生物学释放以及胰岛细胞凋亡。据报道 ,这些作用是通过激活介导的转录因子核因子 k B 产生的，这是锌对胰岛 B 细胞的不利因素。 四、 型糖尿病 长 6个跨膜域 ,p，编码的蛋白为含有 369个氨基酸的锌转运蛋白 8,它特异性的在胰岛 51。 够促进锌离子从细胞质到胞内胰岛素囊泡中的聚集，然后胰岛素与 2个 合形成较稳定的六聚体储存起来，当胰岛 此， 44。 2能与 52相关。 22 等位基因为风险基因， 没有观察 内报道 型糖尿病患者和对照组有显著差7 异，表明等位基因的 型糖尿病的风险增加， 53。国外研究报道 2型糖尿病风险增加 54 综上所述， 型糖尿病发生的危险因素相关， 因多态性为复杂的多基因遗传性疾病，在某些特定种族、特定家族有着较高的发病率。 本文主要讨论 甘肃汉族人群 因多态性与 2型糖尿病及其相关因素的关系，以进一步了解 甘肃 汉族人群 2 型糖尿病患者与 8 研究对象与方法 究对象 2 型糖尿病组：随机选取甘肃汉族 2 型糖尿病患者（分别选自甘肃省人民医院及 兰州市第一人民医院 ）共 116 例 (男 60 例，女 56 例， 平均年龄（ 。彼此间无血缘关系。均排除重度吸烟 (10 支 /日 )、饮酒者；排 除高血压、冠心病、陈旧性心梗等心血管疾病以及肝、肾疾患、原发性性腺、甲状腺、甲状旁腺、垂体疾患及肾功能损害；排除糖尿病酮症酸中毒等急性并发症； 2 型糖尿病诊断标准按照 1999 年世界卫生组织 (定的诊断标准 ， 即空腹血糖 ( 126mg/l)，和 /或口服葡萄糖耐量试验（ 2 小时血糖200mg/1 l)。 正常对照组：同期选取兰州市第一人民医院体检中心汉族健康体检者。选择血糖正常者 80 名，其中男性 41 名，女性 39 名，平均年龄（ 。纳入标准：患者既往血糖正常，空腹血浆葡萄糖 且 2 小时血浆葡萄糖水平 。排除心、肺、肝、肾及内分泌疾病，未服用影响糖代谢的药物并无糖尿病家族史。 究对象的临床资料收集及人体测量 本资料 医生按照统一制定的表格进行详细的病史询问及体格检查。记录一般资料如性别、年龄、病程及家族史等。由专人测量受试者 身高（ m）、体重（ 收缩压（ 舒张压（ 计算体重指数（ =体重 /身高 2（ kg/血压测定：空腹状态下研究对象坐位休息 5钟后测量肱动脉， 测量 2 次，取两次均值。 腰围测量：被测者垂直站立，双脚分开 25米，取髂前上棘与第 12 肋骨下缘连线中点，水平绕腰部的周径；臀围测量：双足并拢，环绕臀围自股骨大粗隆水平进行的周径。 9 验室指标的测量 所有研究对象禁食 10 小时以上，留取晨起肘静脉血样 3檬酸钾 抗凝，置于 保存，用于提取基因组 留取 5于生化指标检测。 采用氧化酶法测定空腹血糖 ( 总胆固醇 (C)、甘油三酯 (高密度脂蛋白胆固醇 (低密度脂蛋白胆固醇 (采用放免法测定空腹胰岛素 ( 采用稳态模型 评价胰岛素抵 抗 指数（ 和胰岛 B 细胞 分泌功能指数（ ： 20 （ 血液基因组 取试剂盒（ 上海生工生物工程技术服务有限公司； 剂： 合酶、 10 100 .8 5 ; 500 v/v)； 25、 106上海生工生物工程技术服务有限 公司 ）； 3. 物序列 根据 供的 基因序列应用 和 上海生工生物工程技术服务有限公司合成），两个 点引物如下。 3.1 5 3 5 3 10 3.2 5 3 5 3 限制性核 酸内切酶 上海 ） 琼脂糖凝胶型号 ： 购于 上海生工生物工程 技术服务 有限公司 ) 电泳缓冲液 ： 10 液 (购于 上海生工生物工程 技术服务 有限公司 ) 4 主要实验仪器 应扩增仪 （加拿大 司）； 净工作台 （ 江苏苏洁净化设备厂 ）； 电热恒温水槽 （ 上海森信实验仪器有限公司 ）； 稳压稳流电泳仪 （ 上海琪特分析仪器有限公司 ）； 低温高速离心机（美国 司） 台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂 613 型） 型电泳槽 （ 上海精益有机玻璃制品仪器厂 ）； 凝胶成像系统 （ 司 ） ； 外 司 )； 移液器 （范围 100l， 20l， l）（加拿大 司 ）； 冰箱（青岛海尔）； 及枪头（上海生工提供）； 11 5. 实验方法和步骤 液基因组 提取 在充分解冻并混匀的全血样本中，抽取血样 200L，采用蛋白酶 K 快速裂解消化 法（离心柱型试剂盒）提取血液基因组 体步骤如下： 取血液样本 250L，加入 400L 细胞裂解液 倒混匀， 12000心 2去上清，留下细胞核沉淀，向离心收集到的细胞核沉淀中 ， 加入 200S 振荡至彻底混匀； 加入 10L 蛋白酶 K 溶液（ 10白酶 K 里加入 1馏水 ），混匀； 加入 200L 缓冲液 分颠倒混匀， 在 65 水箱 中 放置 10间颠倒混匀 多 次，至溶液变清亮为止； 加入 200L 无水乙醇，充分颠倒 至 混匀； 将所得溶液，加入吸附柱 （吸附 柱 入收集管中）， 120000s，倒掉收集管中的废液， 重新 将吸附柱 入收集管中； 向吸附柱 加入 500L 缓冲液 按要求 添 加无水乙醇），12000心 90s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 新 放入收集管中； 向吸附柱 加入 500L 漂洗液 按要求 添加 无水乙醇），12000心 90s 后 ，倒掉收集管中的废液； 向吸附柱 加入 500L 漂洗液 按要求 添加 无水乙醇），12000心 60s 后 ，倒掉收集管中的废液； 将吸附柱 次 放回收集管中， 12000心 2 ，倒掉废液，将吸附柱 室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残 存 的漂洗液； 将吸附柱 入干净的离心管中，向吸附膜悬空滴加 200L 洗脱缓冲液 温 下 放置 512000心 2 ，将溶液收集到离心管中。 制备的 品用 紫外分光光度计和 琼脂糖凝胶电泳检测 浓度和纯度。 度、纯度鉴定 判断纯度： 度采用 值进行分析，确定比值在 纯度好； 比值 能有核糖核 酸存在（ 尤其是 270 最高吸收峰的蛋白质； 比值 明有蛋白质污染 结果。 12 随机选取 （ A） 11、 32、 68、 75、 101, （ B） 23、 34、 67、77、 80 十个样本在 酸蛋白分析仪 上 测定浓度和纯度，分别取波长为 260280得其相应的 用公式： 量 =50 g/释倍数，计算出 量；利用公式： 度 =次检测前先用 水调零，结果 (见表 1)： 表 1 选取基因组 度、纯度鉴定 样本号 浓度（ 1） 纯度（ 260/280） A 11 113 2 159 8 129 5 231 01 198 23 204 4 154 7 184 7 199 0 201 表显示提取的基因组 度较合适 ，纯度亦较好。 A 组为 2 型糖尿病组 B 组为正常对照组 的基因体外扩增 应用聚合酶链式反应 - 限制性片段长度多态性 (的方法检测待测样本的基因型。具体步骤如下： 根据 供的 基因序列应用 和 物设计软件自行设计了引物 , 两个 点引物如下 。引物由 上海生工生物工程 技术服务 有限公司 合成。 1. 5 3 5 3 2. 5 3 13 5 3 1)引物的稀释 ： 根据说明书 ， 在合成好 的上游引物中加入 73L 游引物中加入 74L 使其浓度皆为 100， 再取 10L， 加 90L 释至 10 备用。 2)应体系的组成（总反应体系 15L） 0(50l) (50l) 5U/) 1l 5l 3） 增循环条件： 95 5 95 30 45 72 600 30 58 30 72 400 72 6 4 ) 切体系： 14 37 ， 增产物的鉴定 胶电泳 凝胶的制备：电子天平称取 3g 琼脂糖，置于 100形瓶中，加入 100 分，微搅拌溶解，微波炉里加热沸腾，琼脂糖凝胶全部熔化，冷却至 60 加入 5 1 溴化乙锭 (存液，摇匀，配制成 3%琼脂糖凝胶溶液。 胶板的准备：在胶槽内插入梳子，将锥形瓶内的琼脂糖 凝胶冷却到 60 左右，将凝胶缓慢倒入胶槽中，形成均匀的胶层。凝固后将胶槽静置于水平支持物上，待胶完全凝固后，将胶槽放入电泳槽，加入 冲液至液面恰好盖过胶板上表面，然后拨出梳子。 加样：取酶切产物 5 1、 1 上样于 3%琼脂糖凝胶 加样孔中 ；把样品与 51 100入凝胶板的样品孔中作为参照物。 电泳：接通电源，电压 150V， 30 分钟后停止电泳。电泳结束后，将凝胶置于成像系统仪器，照相，并根 据酶切图谱判断基因型。 因型的判定 因 的 制性内切酶位点，切开片段长度分别为 332 231101果 T/T:332 1 条带， C/C:231101 条带， C/T:332231101 3 条带； 如图一所示。 点含 制性内切酶位点，切开片段长度分别为 3192254结果 A/A:319 1条带 G/G:22594 2条带 A/G:3192254 3条带 ； 如图二所示。 0l 10 (10U/l) 5l 15 图片（一） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ： 1 8 为随机样本（ 及正常组）酶切后的产物，基因型分别依次为： C/C、 C/C、 T/T、 T/T、 C/C、 C/T、 T/T、 C/T。 9： 图片（二） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ： 1 8 为随机样本 （ 及正常组 ） 酶切后的产物 ， 基因型分别依次为 ： A/G 、 G/G 、 G/G A/A、 G/G、 G/G、 A/A、 G/G。 9： 采用 计 学软件分析。对所有资料进行正态性检验，正态分布的资料以 x示，非正态分布资料 (对数转换为正态后进行分析。计数资料间比较用 验 ， 的年龄显著高于 但 的 腰臀比，显著高于 (分别为 05) 表 2 不同代谢人群一般临床与生化指标比较 （ n=80） （ n=116） P 年龄（岁） 别（男 /女） 41/39 60/56 重（ MI(kg/C（ 臀比 BP(BP(C() G() ) ) ) PG() 7 ） 注：年龄、 非正态，非正态分布资料，数据经对数转换为正态分布资料，最后数据以 x示。 不同糖代谢组间 因型频率和等位基因频率比较 因 因型频率在 的分布符合 衡（ P 如表 2 所示， 因 基因型 因型频率明显